專利名稱：微陣列測定中的次級捕獲的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于靶向的序列富集的組合物、方法和系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明提供了 通過抑制非靶核酸序列的次級捕獲而在微陣列測定中的雜交過程中富集靶向的核酸序列。
背景技術(shù)：
核酸微陣列技術(shù)的出現(xiàn)使得在非常小的區(qū)域例如在顯微鏡載玻片上建立數(shù)以百萬計的核酸序列的陣列成為可能(例如美國專利號6，375，903和5，143，854)。最初， 此類陣列是通過將預先合成的DNA序列點染至載玻片上而制備的。但是，如美國專利號 6，375，903中描述的無掩膜的陣列合成器(MAQ的構(gòu)建現(xiàn)在允許直接在載玻片本身上原位合成寡核苷酸序列。使用MAS儀器，在微陣列中待構(gòu)建的寡核苷酸序列的選擇由軟件控制，從而現(xiàn)在有可能基于研究人員的特定需求單獨地產(chǎn)生個性化陣列。一般而言，基于MAS的寡核苷酸微陣列合成技術(shù)允許在標準的顯微鏡載玻片的非常小的區(qū)域內(nèi)平行合成數(shù)以百萬計的獨特寡核苷酸特征。隨著數(shù)以百種生物的完整基因組的可獲得(它們的參考序列一般已經(jīng)保存于公共數(shù)據(jù)庫)，微陣列已被用于在分離自多種生物的核酸中執(zhí)行序列分析。核酸微陣列技術(shù)已經(jīng)應用于很多研究和診斷領(lǐng)域，例如基因表達和發(fā)現(xiàn)、突變檢測、等位基因和進化序列比較、基因組作圖、藥物開發(fā)等等。很多應用需要在整個人類基因組范圍內(nèi)搜索那些解釋人類疾病的遺傳變體和突變。在復雜疾病的情況下，這些搜索一般會產(chǎn)生與疾病和/或疾病風險相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或SNP的組。已證明鑒定此類SNP是艱難的任務(wù)并且經(jīng)常是沒有成果的，這是因為需要對來自受影響的個體或組織樣品的基因組DNA的大的區(qū)域(通常大于100，000堿基(IOOKb))進行重新測序，以找尋單一的堿基變化或鑒定所有的序列變體。其它的應用包括鑒定也可能與癌癥相關(guān)的染色體序列的獲得和丟失，所述癌癥為例如淋巴瘤(Martinez-Climent JA等人，2003，Blood 101 3109-3117)、胃癌(Weiss MM 等人，2004，Cell. Oncol.洸307-317)、乳腺癌(Callagy G 等人，2005，J. Path. 205 :388-396)和前列腺癌(Paris, PL 等人，2004，Hum. Mol. Gen. 13 1303-1313)。因此，微陣列技術(shù)對于科學研究人員和臨床人員理解疾病和治療疾病的治療方案的功效是極其有用的工具。通常而言，基因組太復雜以致于不能作為一個整體來研究，必須使用一些技術(shù)來降低基因組的復雜性。為了解決這個問題，一個方案是減少來自DNA樣品的某些類型的高豐度序列，如美國專利6，013，440所記載。替代性方式則使用用于富集基因組序列的方法和組合物，例如在 Albert 等人(2007, Nat. Meth.，4 :903-5)，Okou 等人(2007, Nat. Meth. 4 907-9)，Olson M. (2007, Nat. Meth. 4 :891-892)，Hodges 等人(2007，Nat. Genet. 39 1522-1527)中所描述，以及如美國專利申請系列號11/638，004、11/970，949和61/032，594 所記載。Albert等人公開了一種既成本劃算又迅速有效降低基因組樣品的復雜性的替代性方式，其通過使用者確定的方式以允許進行進一步處理和分析。Lovett等人(1991，Proc.Natl. Acad. Sci. 88 =9628-9632)也描述了使用細菌人工染色體進行基因組選擇的方法。通過進行靶序列富集然后測序以降低基因組的復雜性遠遠優(yōu)越于單獨測定雜交事件。雜交事件允許任意種類在微陣列中雜交；包括靶序列和非靶序列等。通過進行復雜性降低和序列富集，研究人員增加了所捕獲的在靶序列(on-target sequence)(例如是測定焦點的那些序列)，同時減少了所捕獲的非靶序列的數(shù)量(例如那些不是測定焦點的序列)。但是，任何微陣列測定中都存在的一個問題是重復性核酸序列的交叉捕獲的事件，也稱作在靶核酸雜交過程中，陣列上的非靶核酸序列的次級捕獲。次級捕獲通過非靶標捕獲而潛在地淹沒想要的靶標捕獲，導致靶標捕獲的效率降低，降低了復雜性減低和其它微陣列測定的效率。因此，需要抑制在微陣列測定中發(fā)生次級捕獲反應的方法，從而為研究工作增加靶核酸捕獲的效率。

發(fā)明內(nèi)容
微陣列形式中的次級捕獲反應導致靶核酸捕獲效率的降低。這種降低的效率見于由微陣列測定得到的在靶讀數(shù)(on-target read)的百分率，從而，當次級捕獲不被抑制時， 捕獲的非靶核酸的量增加并且靶核酸的量減少。本發(fā)明總結(jié)為用于抑制微陣列中的次級捕獲的方法、系統(tǒng)和組合物。以下描述了本發(fā)明的一些解釋性的實施方式。本發(fā)明不限于這些實施方式。本發(fā)明的實施方式包括固定的核酸探針，其用于通過使樣品與固體支持物或溶液中的探針或探針衍生的擴增子雜交而捕獲來自例如基因組樣品的靶核酸序列。如本文描述的雜交反應包括將物種特異性的阻斷DNA加入到微陣列測定中的反應中。物種特異性的阻斷DNA包括例如，在人特異性微陣列雜交中，摻合人CJ-I DNA與人靶核酸；在小鼠特異性微陣列雜交中，摻合小鼠Qt-IDNA與小鼠靶核酸；以及在玉米特異性微陣列雜交中，摻合玉米Qt-I DNA與玉米靶核酸。本發(fā)明的其它實施方式包括固定的核酸探針，其用于通過使樣品與固體支持物或溶液中的探針或探針衍生的擴增子雜交而捕獲來自例如基因組樣品的靶核酸，其中所述靶核酸與位于片段化的核酸樣品的5’和3’末端之一或二者的接頭連接子附著，所述接頭連接子用于連接介導的聚合酶鏈式反應(LM-PCR)方法并用于測序應用。如本文描述的雜交反應包括將如上所述的物種特異性的阻斷DNA加入到微陣列中的雜交反應中，和/或?qū)⒑铣傻碾s交阻斷寡核苷酸摻入到微陣列中的雜交反應中。上文已經(jīng)描述了物種特異性的阻斷 DNA。將雜交阻斷寡核苷酸摻入到微陣列雜交中以阻斷由于例如接頭介導的次級捕獲而引起的次級捕獲。 在復雜性減低測定中摻入如本發(fā)明提供的物種特異性的阻斷DNA和/或雜交阻斷寡核苷酸會抑制次級捕獲，從而與在雜交中使用非物種特異性阻斷DNA相比，增加雜交過程中所捕獲的在靶核酸序列(例如想要的靶序列)的量。優(yōu)選洗滌所捕獲的靶核酸并將探針洗脫掉。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了在基于溶液的形式中的靶向的序列的富集和非靶向的序列的次級捕獲的抑制?？紤]到本發(fā)明不限于微陣列底物。微陣列底物包括但不限于，載玻片、芯片、珠子、基于溶液的、管、柱、孔、板，等等。 基因組樣品在本文中用作描述性目的，但是應該理解，其它非基因組樣品可以經(jīng)歷同樣的程序，因為本發(fā)明提供了與任意核酸靶標(不論其來源)相關(guān)聯(lián)的非靶標次級捕獲的抑制。本發(fā)明提供的靶標富集的效率的增加為研究人員提供了用于與疾病和疾病狀態(tài)相關(guān)的研究和治療的卓越工具，所述疾病為例如，略舉幾例，癌癥(Durkin等人， 2008，Proc. Natl. Acad. Sci. 105 :246-251 ；Natrajan 等人,2007，Genes, Chr. And Cancer 46 :607-615 ；Kim 等人，2006，Celll25 :1269-1281 ；Stallings 等人，2006Can. Res. 66 3673-3680)、遺傳病癥(Balciuniene 等人，Am. J. Hum. Genet.出版中)、精神疾病(Walsh 等人，2008，Science 320 :539-543 ；Roohi 等人，2008，J. Med. Genet. Epub 18 March 2008 ；Sharp 等人，2008，Nat. Genet. 40 :322-328 ；Kumar 等人，2008，Hum. Mol. Genet. 17 628-638)，以及進化和基礎(chǔ)性研究(Lee 等人，2008，Hum. Mol. Gen. 17 :1127-1136 Jones 等人，2007，BMC Genomics 8 :402 ；Egan 等人，2007，Nat. Genet. 39 1384-1389 ；Levy 等人， 2007，PLoS Biol. 5 :e254 ；Ballif 等人，2007，Nat. Genet. 39 :1071-1073 ；Scherer 等人， 2007，Nat. Genet. S7-S15 ；Feuk 等人，2006，Nat. Rev. Genet. 7 :85-97)。本發(fā)明提供了分離和降低多個核酸分子的遺傳復雜性的方法，所述方法包括以下步驟將所述種群的片段化的、變性的核酸分子在雜交條件下暴露于相同的或多個不同的結(jié)合于固體支持物上的寡核苷酸探針，以捕獲與所述探針特異性雜交的核酸分子，或者，將所述種群的片段化的、變性的核酸分子在雜交條件下暴露于相同的或多個不同的寡核苷酸探針，然后使雜交的分子的復合物與固體支持物結(jié)合，以捕獲與所述探針特異性雜交的核酸分子，其中在兩種情況下，所述片段化的、變性的核酸分子具有大約100至大約1000個核苷酸殘基的平均大小，優(yōu)選大約250至大約800個核苷酸殘基，最優(yōu)選大約400至大約600 個核苷酸殘基；使未結(jié)合的和非特異性雜交的核酸與捕獲的分子分離；洗脫捕獲的分子； 和任選以洗脫的捕獲的分子將上述方法重復至少一個循環(huán)和/或?qū)Ω患陌泻怂徇M行測序。在一些實施方式中，所述靶核酸分子選自動物、植物或微生物。如果僅可獲得有限的核酸樣品，則可以在實施本發(fā)明的方法之前擴增核酸，例如通過全基因組擴增。預先擴增可能對于執(zhí)行本發(fā)明的方法是必要的，例如，用于法醫(yī)的目的(例如，用于遺傳鑒定目的的法醫(yī)醫(yī)藥)。在一些實施方式中，靶核酸分子的群體是基因組DNA分子的群體。在此類實施方式中，探針選自例如確定來自多個遺傳基因座的一個或多個外顯子、內(nèi)含子或調(diào)節(jié)序列的一個或多個序列，或確定至少一個單一遺傳基因座的完整序列的多個探針，所述基因座的大小為至少1001Λ，優(yōu)選至少1Mb，或至少一個如上文指定的大小，一個或多個確定單核苷酸多態(tài)性(SNP)的探針，或多個確定陣列的探針，所述陣列為例如設(shè)計以用于捕獲至少一個完整染色體的完整序列的tiling陣列。在一些實施方式中，本發(fā)明包括以下步驟在將片段化核酸樣品暴露于探針以進行雜交之前或之后，將接頭分子連接至核酸分子的一個或兩個末端，優(yōu)選兩個末端。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法還包括使用至少一個引物擴增靶核酸分子，所述引物包含與所述接頭分子的序列特異性雜交的序列。在一些實施方式中，所述接頭分子是自我互補的、非互補的或是Y-接頭(例如這樣的寡核苷酸一旦退火，則包含互補性末端和非互補性末端， 其互補性末端與片段化的核酸樣品退火)。在一些實施方式中，可以將擴增的靶核酸序列測序，與重測序或SNP-calling陣列雜交，并且可以進一步分析序列或基因型。
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在一些實施方式中，本發(fā)明提供了用于基因組樣品中的靶核酸序列(例如外顯子或變體，優(yōu)選SNP位點)的復雜性減低的方法。這可以這樣實現(xiàn)合成一個或多個對基因組的區(qū)域有特異性的基因組探針，以捕獲復雜基因組樣品中包含的互補性靶核酸序列。富集方法包括加入物種特異性阻斷DNA和雜交阻斷寡核苷酸中的一個或二者。在一些實施方式中，本發(fā)明還包括測定富集的和洗脫的靶分子的核酸序列，尤其是通過進行測序反應來進行。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的組合物和試劑。此類試劑盒可以包含下列物質(zhì)，但不限于雙鏈接頭分子、固體支持物，其包含用于任何特定微陣列應用(例如比較型基因組雜交、表達、染色質(zhì)免疫沉淀、比較型基因組測序，等等)的多個雜交探針，以及物種特異性阻斷DNA和雜交阻斷寡核苷酸中的一個或多個。在一些實施方式中，試劑盒包含兩種不同的雙鏈接頭分子。試劑盒還可以包含至少一個或多個選自下列的其它成分DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、T4DNA連接酶、雜交溶液、洗滌溶液，和/或洗脫溶液。


圖1例示了兩種不同類型的次級捕獲。圖2例示了以人類靶DNA進行的微陣列中，不同類型的阻斷DNA的效應?！叭恕贝砣说腸。t-l，“鮭魚”代表鮭魚精DNA，“小鼠”代表小鼠CQt-l，“無”代表沒有阻斷DNA (陰性對照)。圖3例示了在微陣列捕獲實驗中使用物種特異性阻斷DNA的重要性。圖4顯示了一種進行靶向的樣品核酸的序列捕獲的方法的示例性流程。在該示例性流程中，將DNA樣品片段化，將接頭(例如連接子)添加到片段化DNA的末端，例如使用用于產(chǎn)生DNA文庫的試劑盒。使用附著至片段化DNA的末端的連接子擴增單鏈模板，例如通過連接介導的聚合酶鏈式反應方法(LM-PCR)。將樣品變性，與微陣列底物雜交，洗滌并洗脫。使用接頭序列擴增洗脫的樣品，隨后測序。圖5例示了在微陣列捕獲測定中使用雜交阻斷寡核苷酸以阻斷接頭介導的次級雜交(當接頭與靶核酸連接時)的重要性。定義如本文使用的術(shù)語“樣品”以其最廣泛的含義使用。在一個含義中，其意指包括獲自任何來源的樣本或培養(yǎng)物，優(yōu)選生物來源，可以是真核的或原核的。生物樣品可以獲自動物(包括人)并且包括液體、固體和組織。生物樣品包括血液制品，例如血漿、血清等。來自非人動物的樣品包括但不限于，來自脊椎動物例如嚙齒類、非人靈長類、綿羊、牛、反芻動物、兔、豬、山羊、馬、犬、貓、鳥等脊椎動物的生物樣品。此外，如本文使用的樣品包括來自植物的生物樣品，例如源自植物界中存在的任何生物(例如單子葉植物、雙子葉植物等)的樣品。樣品還可以來自真菌、藻類、細菌等。預期本發(fā)明不限于樣品的來源。如本文使用的樣品通常是包含來自任意來源的核酸(例如DNA、RNA、cDNA、mRNA、tRNA、miRNA等)的“核酸的樣品”或“核酸樣品”，或“靶核酸樣品”，或“靶樣品”。因此，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中使用的核酸樣品是源自任意生物(真核或原核)的核酸樣品。如本文使用的術(shù)語“靶核酸分子”和“靶核酸序列”相互替代地使用，是指來自待研究的靶基因組區(qū)域的分子或序列。預先選定的探針決定靶向的核酸分子的范圍。因子， 所尋求的是，將“靶標”從其它核酸序列中分選出來?！皡^(qū)段”定義為靶序列內(nèi)的核酸區(qū)域， 即核酸序列的“片段”或“部分”。因此，“在靶讀數(shù)”是被測序的并且被發(fā)現(xiàn)是研究人員想要的序列的那些靶核酸的百分率或數(shù)目。當用于與核酸相關(guān)時，例如用在“分離核酸”中時，如本文使用的術(shù)語“分離體”是指從在其天然來源中通常與其結(jié)合的至少一種成分或污染物中鑒定并分離出來的核酸序列。分離的核酸的形式或狀態(tài)不同于其天然存在的形式或狀態(tài)。相反，非分離的核酸是以其天然狀態(tài)存在的核酸例如DNA和RNA。分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以單鏈或雙鏈形式存在。如本文使用的術(shù)語“寡核苷酸”是指長度短的單鏈多核苷酸的鏈。寡核苷酸的長度通常在200個殘基以下(例如15至100個)，但是，如本文所使用，該術(shù)語還意在包括較長的多核苷酸鏈。寡核苷酸通常通過其長度進行指稱。例如二4個殘基的寡核苷酸被稱作 “24-聚體”。寡核苷酸可以通過自身雜交或通過與其它多核苷酸雜交而形成二級或三級結(jié)構(gòu)。此類結(jié)構(gòu)可以包括但不限于，雙螺旋、發(fā)夾、十字形、彎曲和三螺旋。如本文使用的術(shù)語“雜交”用于指互補性核酸的配對。雜交和雜交強度(例如核酸之間的結(jié)合強度)受到以下因素的影響，例如核酸之間的互補性程度、涉及的條件的嚴格性、形成的雜交體的解鏈溫度(Tm)，以及核酸的G C比。雖然本發(fā)明不被特定組的雜交條件所限制，但優(yōu)選使用嚴格雜交條件。嚴格雜交條件是序列依賴性的，并且隨著不同環(huán)境參數(shù)(例如鹽濃度、有機物質(zhì)的存在等)而有所不同。一般而言，將“嚴格”條件選擇為，比特定核酸序列在確定的離子強度和PH時的Tm低大約50°C至約20°C。優(yōu)選地，嚴格條件為， 比特定核酸與互補性核酸結(jié)合的熱熔解點低大約5°C至10°C。1是(在確定的離子強度和 PH時)指50%的核酸(例如靶核酸)與完美匹配的探針雜交時的溫度?！皣栏駰l件”或“高度嚴格條件”可以是例如在50%的甲酰胺，5x SSC(0. 75MNaCl, 0. 075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6. 8)，0. 1 %焦磷酸鈉，5x Denhardt溶液，經(jīng)超聲處理的鮭魚精DNA (50mg/ml) ,0. 1% SDS,和10%葡聚糖硫酸酯中，在42°C雜交；在42°C在0. 2% SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%甲酰胺中在55°C洗滌，然后以含有EDTAWO. Ix SSC在 55°C洗滌。舉例而言，但非限制，預期含有35%甲酰胺，5x SSC和0.1% (w/v)十二烷基硫酸鈉(SDQ的緩沖液適合于在中等非嚴格條件下在45°C雜交16-72小時。此外，預想到可以在20% -45%的范圍內(nèi)適宜地調(diào)整甲酰胺的濃度，這取決于探針長度和所需的嚴格性水平。在多個來源中提供了雜交條件的另外的實例，包括Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Sambrook 等人編，Cold Spring Harbour Press(通過弓| 用方式全文并入本文)。類似地，“嚴格”洗滌條件通常是通過經(jīng)驗確定的，用于靶標與探針的雜交，或者在本發(fā)明中，用于靶標與探針衍生的擴增子的雜交。擴增子/靶標發(fā)生雜交(例如在嚴格雜交條件下)，然后以含有連續(xù)降低的濃度的鹽或連續(xù)升高的濃度的去污劑的緩沖液洗滌或在漸增的溫度洗滌，直至特異性與非特異性雜交的信噪比高到足以促進特異性雜交的檢測。嚴格溫度條件通常包括大約30°C以上，更通常是大約37°C以上，偶爾大約45C以上的溫度。嚴格的鹽條件通常是大約IOOOmM以下，通常大約500mM以下，更通常是大約150mM 以下(Wetmur 等人，1966，J. Mol. Biol. ,31 :349-370 ；ffetmur, 1991, Critical Reviews inBiochemistry and Molecular Biology, 26 :227-259, fflil^lM^ ζ^^Ι^Α^ ；) ο如本文使用的術(shù)語“引物”是指寡核苷酸，可以是天然存在的作為純化的限制性消化物，或通過合成產(chǎn)生的，當被置于“互補于核酸鏈的引物延伸產(chǎn)物的合成被誘導”的條件 (例如存在核苷酸和例如DNA聚合酶的誘導劑以及在合適的溫度和ρΗ)下時，其能夠作為合成的起始點。引物優(yōu)選為單鏈的，以使擴增效率最大化。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長以便在存在誘導劑的情況下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將取決于很多因素，包括溫度、引物來源和使用的方法。如本文使用的術(shù)語“探針”是指寡核苷酸(例如核苷酸序列)，可以是天然存在的作為純化的限制性消化物，或通過合成產(chǎn)生的，重組的，或通過PCR擴增產(chǎn)生的，其能夠與另一個感興趣的寡核苷酸例如靶核酸序列的至少一部分雜交。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針用于檢測、鑒定和分離特定的基因序列。如本文使用的探針通常附著于微陣列
底物，使用MAS通過原位合成，或者通過技術(shù)人員已知的任何其它方法合成，并與靶核酸雜交。如本文使用的術(shù)語“接頭(adapter)，，(或“連接物”(adaptor))是確定的(或已知的)序列的雙鏈寡核苷酸，其附著于樣品DNA分子的一個或兩個末端。可以在加入它們之前將樣品DNA分子進行片段化或不片段化。在接頭被添加到樣品DNA分子的兩個末端的情形中，接頭可以是相同的(即在兩個末端具有同源序列)或不同的(即在各末端具有異源序列)。為了連接介導的聚合酶鏈式反應(LM-PCR)的目的，術(shù)語“接頭”和“連接子”相互替代地使用。接頭的兩條鏈可以自我互補、非互補或部分互補(例如Y-形狀)。接頭通常是12個核苷酸殘基至100個核苷酸殘基，優(yōu)選18個核苷酸殘基至100個核苷酸殘基，最優(yōu)選20至44個核苷酸殘基。當提供數(shù)值的范圍時，應該理解為，除非上下文另有明確指明，否則也具體公開了該范圍的上限和下限之間的每個中間數(shù)值，達到下限的單位的十分位。本發(fā)明包括指定范圍內(nèi)任意指定數(shù)值或中間數(shù)值之間的每個較小范圍，或者該指定范圍中的任意其它指定的或中間的數(shù)值。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在該范圍內(nèi)或排除在該范圍外，并且每個范圍(其中兩個端點值之一包括在、均不包括在，或二者均包括在該較小范圍內(nèi))也包括在本發(fā)明內(nèi)，服從該指定范圍內(nèi)任意具體排除的端點值。當指定范圍包括一個或兩個端點值時，排除所包括的端點值之一或二者的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。
具體實施例方式微陣列測定中的次級捕獲包括未在微陣列探針捕獲設(shè)計中表示的序列(例如 Alu, THE-U LINE-I重復序列等)的基于雜交的相互作用(圖1)。一種類型的次級捕獲， 例如，見于非雜交的樣品DNA與與探針雜交的靶DNA之間(“序列介導的次級捕獲”)。另一種類型的次級捕獲是附著于靶DNA的接頭或連接子序列之間的雜交(“接頭介導的次級捕獲”)。例如，當在微陣列測定中接頭與其互補序列雜交時，發(fā)生接頭介導的次級捕獲。例如，在次級捕獲中，探針與其靶標特異性雜交，但是該靶標具有一些也與非順式拷貝雜交的非探針序列(例如Alu、THE-U LINE-I重復序列等)。次級捕獲的一個結(jié)果是靶樣品內(nèi)重復性元件(例如非靶序列)的特定子集的富集，導致靶區(qū)域的總體富集較差。本質(zhì)上講，不需要的類型的局部重復序列的共同富集導致微陣列上需要通過捕獲而被富集的靶序列被淹沒。如本文所描述，本發(fā)明的方法、系統(tǒng)和組合物提供了對于微陣列測定中的次級捕獲的抑制，從而增加了靶序列的捕獲。以下描述了本發(fā)明的一些示例性實施方式。本發(fā)明不限于這些實施方式。進行競爭性或抑制性的雜交以阻斷次級捕獲包括阻斷使用復雜的DNA時可能獲得的潛在的強烈的重復性DNA信號的捕獲。例如，將DNA變性，并允許在存在處于溶液中的總基因組DNA或優(yōu)選就高重復性DNA序列進行富集的部份重新退火。在任一情況下，靶DNA 中的高度重復性DNA相對于探針中的重復性元件以大量過量而存在(因為總是以盡可能少的重復序列來產(chǎn)生陣列)。因此，此類序列將會容易地與靶標內(nèi)的重復性序列的互補性鏈結(jié)合，加入大量過量的相同類型的重復序列的外源拷貝，從而有效阻斷它們與靶序列的雜交。 因此，在雜交反應中使用阻斷劑。更有效的是使用就高度重復性DNA序列(例如Alu、THE-I和LINE-1重復序列) 進行富集的總基因組DNA的部份，而不是使用總基因組DNA作為雜交中的阻斷劑。對于復雜的人類DNA和其它復雜的基因組而言，后者通常包括制備被稱作Qt-I DNA的DNA部份 (例如，復性時間的DNA濃度依賴系數(shù)為1.0)。CQt-l DNA可以從商業(yè)上獲得，或者可以使用已經(jīng)建立的技術(shù)來制備(見Human Molecular Genetics 2，Strachan和Read編輯，John Wiley&Sons，Inc.)。按照本文的描述制備了玉米CQt_l DNA0在實驗過程中觀察到在靶標富集實驗中采用CJ-I DNA改善了在靶測序結(jié)果。 但是，令人驚奇地觀察到，使Qt-I DNA與靶物種匹配提供了最佳的捕獲性能。此外還確定了，當使用接頭連接的靶核酸并且將互補于那些靶序列的寡核苷酸序列另外加入到微陣列中的雜交反應中時，觀察到關(guān)于在靶捕獲的進一步改善。本發(fā)明不限于特定的機理。事實上，理解機理不足以實施本發(fā)明。然而，預期該效應不是通過抑制微陣列的非特異性結(jié)合能力而介導的，而是通過CQt-l DNA中的過量的特異性序列猝滅重復介導的樣品DNA中的次級捕獲。經(jīng)典的基于雜交的序列表征使用阻斷劑以阻止標記的探針與尼龍或硝酸纖維素固體支持物相互作用。在那些研究中，經(jīng)評估用于抑制這種非特異性DNA結(jié)合活性的試劑多數(shù)通常是鮭魚精DNA(鮭魚基因組主要包含重復序列，尤其比小鼠或人類基因組的重復序列多)，或純化的酵母tRNA的混合物。從Southern類型的分析到基于微陣列的研究的轉(zhuǎn)變帶來了非特異性阻斷的使用。目前，關(guān)于在陣列雜交中是否必需使用Qt-I存在爭議，因為一些應用和生產(chǎn)商(例如 Agilent Technologies, Abbott Laboratories 等)推薦 C。t_l 用于比較型基因組雜交，而其它的(例如Roche NimbleGen, Inc.)則不推薦。目前認為阻斷非特異性捕獲所需的僅是任意Qt-I DNA，與阻斷劑的來源無關(guān)， 此類阻斷都產(chǎn)生相同的捕獲性能。事實上，目前人Qt-I DNA被推薦用于人和小鼠靶序列捕獲方法，并且設(shè)想使用鮭魚精DNA來抑制微陣列雜交測定過程中可能發(fā)生的非特異性雜交將產(chǎn)生與任何Qt-I DNA等同的作用。這是所希望知道的，因為Qt-I DNA成本是將近鮭魚精DNA的30倍。然而，業(yè)已觀察到來自不同物種的CJ-I DNA對例如復雜性減低測定(其中人類DNA序列是被捕獲和富集的靶序列(圖2))有害。在開發(fā)本發(fā)明的實施方式時，使用相同的DNA文庫集(人的或小鼠的)和相同的陣列設(shè)計，一式三份地進行了復雜性減低測定。所有3個捕獲使用相同數(shù)量的DNA文庫(Iug)和IOOug阻斷劑DNA 人CQt-l、小鼠Qt-I或鮭魚精DNA。進行了對照捕獲以輔助鑒定成功差異。從圖2可以看出，以人Qt-I DNA進行的人文庫DNA捕獲是成功的(產(chǎn)生大約85%的在靶讀數(shù))，而使用小鼠CJ-I進行的人的測定表現(xiàn)較差(被認為是失敗)，使用鮭魚精DNA阻斷的人測定與不存在阻斷DNA時的測定(陰性對照，被認為是失敗)相同。但是，應該注意，較高濃度的鮭魚精DNA(即200 微克/捕獲雜交)產(chǎn)生了改善的結(jié)果。當使用小鼠靶標序列時，見到了相似的式樣，從而當使用小鼠Qt-I代替人Qt-I或鮭魚精DNA時實現(xiàn)了最佳靶標捕獲。為了研究當使用非哺乳動物靶核酸時是否存在此現(xiàn)象，進行了微陣列實驗，其中使用經(jīng)濟上具有重要意義的植物農(nóng)作物物種(在本例中為玉米)的DNA進行靶序列富集。 對于玉米靶標捕獲，研究了多種潛在的次級捕獲阻斷劑鮭魚精DNA、不含接頭的過量的玉米基因組DNA、PCR擴增的玉米重復區(qū)域的集合，以及綠豆核酸酶產(chǎn)生的玉米Qt-I DNA。在玉米靶標富集中使用人Qt-IDNA產(chǎn)生了大約(0.94%)的在靶讀數(shù)；從現(xiàn)實角度而言即失敗了。如表1所示的定量PCR(qPCR)數(shù)據(jù)證明當使用玉米Qt-1 DNA作為針對次級捕獲的阻斷DNA時，非靶序列的排除是最佳的，并且靶序列的富集是最佳的。表 權(quán)利要求
1.一種抑制核酸雜交中的次級捕獲的方法，包括以下步驟a)將一個或多個核酸探針固定以捕獲樣品中的靶核酸序列；b)向所述樣品中加入次級捕獲抑制劑，其中所述次級捕獲抑制劑包括物種特異性 C0t-1 DNA和雜交阻斷寡核苷酸；和c)將所述樣品和所述次級捕獲抑制劑施加到所述探針中，以與所述靶序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述物種特異性Qt-IDNA是人Qt-I DNA并且所述靶核酸序列是人核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述物種特異性Qt-IDNA是小鼠CJ-IDNA并且所述靶核酸序列是小鼠核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述物種特異性Qt-IDNA是植物CJ-IDNA并且所述靶核酸序列是植物核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述植物CJ-I是玉米CJ-I并且所述靶核酸是玉米核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的方法，其中所述次級捕獲抑制劑以相對于靶核酸序列至少5倍摩爾過量的量存在。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中所述靶核酸序列包括DNA文庫并且其中所述文庫包括自我互補性接頭。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中所述靶核酸序列包括DNA文庫并且其中所述文庫包括非互補性接頭。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中所述靶核酸序列包括DNA文庫并且其中所述文庫包括基于Y的接頭。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的方法，其中所述雜交阻斷寡核苷酸具有與接頭連接的核酸互補的序列。
11.一種抑制核酸雜交中的次級捕獲的方法，包括以下步驟a)將一個或多個核酸探針固定以捕獲樣品中的靶核酸序列；b)向所述樣品中加入次級捕獲抑制劑，其中所述次級捕獲抑制劑包括雜交阻斷寡核苷酸，其與接頭連接的核酸互補；和c)將所述樣品和所述次級捕獲抑制劑施加到所述探針中，以與所述靶序列雜交。
12.包含物種特異性Qt-IDNA和雜交阻斷寡核苷酸的組合物，其中所述組合物用于阻斷基于雜交的測定中的次級捕獲。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中所述物種特異性Qt-IDNA選自人Qt-Ι、小鼠 c0t-l 或植物 Qt-I。
14.根據(jù)權(quán)利要求12-13的組合物，其中所述雜交阻斷寡核苷酸具有與接頭連接的核酸互補的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述植物Qt-I是玉米Qt-I。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于靶向的序列富集的組合物、方法和系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明提供了通過抑制非靶核酸序列的次級捕獲而在微陣列測定中的雜交過程中富集靶向的核酸序列。
文檔編號C12Q1/68GK102209792SQ200980144848
公開日2011年10月5日 申請日期2009年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者B·斯文松, J·杰德洛, T·阿爾伯特 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司