專利名稱：秋茄erf轉(zhuǎn)錄因子、其編碼基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物抗逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子cDNA及其編碼蛋白，尤其涉及從紅樹林植物秋茄[Kandelia candel (L.)Druce]中所分離、克隆的編碼ERF轉(zhuǎn)錄因子的cDNA 序列，本發(fā)明還涉及含有該cDNA序列的植物高效表達(dá)載體以及它們?cè)谔岣咧参锟鼓嫘灾械膽?yīng)用，屬于與植物耐逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物的逆境包括非生物逆境(如干旱、鹽堿和低溫等)和生物逆境(如真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等引起的病、蟲害以及雜草危害)。干旱、鹽堿和低溫是影響陸生植物生長和限制作物產(chǎn)量的三種主要的非生物脅迫因子；其中，鹽堿地對(duì)作物產(chǎn)量的影響占有很大的比重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界鹽堿地占全球陸地面積的7. 6%，隨著工業(yè)化進(jìn)程加快，中國的土壤鹽漬化面積不斷擴(kuò)大，目前鹽漬化土壤面積約有2600萬公頃，其中鹽堿耕地約有670萬公頃，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)對(duì)土地的利用。低溫作為經(jīng)常發(fā)生且危害嚴(yán)重的逆境因素之一，它不僅影響著植物的季節(jié)性生長，也影響著植物的地理性分布。鹽堿構(gòu)成的非生物逆境會(huì)對(duì)植物造成滲透脅迫，致使環(huán)境滲透勢(shì)低于植物細(xì)胞滲透勢(shì)而導(dǎo)致植物細(xì)胞失水，嚴(yán)重的可造成細(xì)胞膨壓完全喪失，甚至導(dǎo)致植物死亡。病蟲害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)、森林危害的重要生物脅迫因子。中國每年森林病蟲害發(fā)生面積約在1. 2億畝左右，2010年全國農(nóng)作物重大病蟲害仍為偏重發(fā)生年份，總體程度略重于上年，發(fā)生面積約為70億畝(次)，總體與上年基本持平。水稻、玉米、棉花等重要經(jīng)濟(jì)作物均存在嚴(yán)重的病蟲危害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。植物在適應(yīng)病原物侵染的過程中獲得了復(fù)雜的植物防衛(wèi)反應(yīng)(plant defense responses)機(jī)制。植物識(shí)別病原物后，通過一系列信號(hào)傳遞過程，最終誘導(dǎo)相關(guān)植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)。植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(transcription regulation)已成為植物防衛(wèi)反應(yīng)研究中最具活力的領(lǐng)域之一。然而， 單個(gè)植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的超表達(dá)僅能夠提高植物對(duì)某個(gè)病原物的抵抗能力，而一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的超表達(dá)能夠激活多個(gè)下游抗病基因的表達(dá)。因此，利用轉(zhuǎn)錄因子來改良植物的綜合抗病性，是一種非常有潛力的方法。植物抗逆基因工程是以導(dǎo)入個(gè)別功能基因來提高某種抗性，但達(dá)不到使植物的抗逆性得到綜合的、根本性改良的目的。植物的抗逆性并不是由單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因的表達(dá)來體現(xiàn)的，而是由多基因控制的數(shù)量性狀。雖然目前已陸續(xù)從各種植物中克隆出大量的抗逆相關(guān)基因，但這些基因大多數(shù)只能增加植物的某種單一抗性，并不能從整體上綜合提高植物的抗逆性。轉(zhuǎn)錄因子作為功能基因表達(dá)的調(diào)節(jié)開關(guān)，可以對(duì)不同的基因進(jìn)行精確的調(diào)節(jié)，在植物逆境信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，所以通過增強(qiáng)某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的作用，可促使多個(gè)與抗逆有關(guān)的功能基因表達(dá)，這是使植物抗逆性狀獲得綜合改良的一條非常有效的途徑。AP2/EREBP類蛋白是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，ERF(ethylene-responsive element binding factor)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，每個(gè)成員
3都含有一個(gè)由大約60個(gè)氨基酸組成的非常保守的DNA結(jié)合域。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，ERF類轉(zhuǎn)錄因子含有4個(gè)功能域，即DNA結(jié)合域(DNA-binding domain)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控域(transcription regulation domain)(包括激活和抑制域)，寡聚化位點(diǎn)(oligomerization)以及核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)。其中，高度保守的ERF/AP2DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有由60 70個(gè)氨基酸殘基組成的包含3個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋，通過與目的基因上游啟動(dòng)子區(qū)域中富含GC的順式作用元件(如DRE元件、GCC-box等)相互作用，參與調(diào)控植物細(xì)胞周期、生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、次生代謝、生物和非生物脅迫應(yīng)答及植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等多種信號(hào)途徑，在脅迫信號(hào)傳遞過程中起重要作用。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個(gè)與植物抵抗干旱、高鹽、低溫及病原菌等有關(guān)的功能基因的表達(dá)，從整體上增強(qiáng)植物的抗逆性，提高其穩(wěn)定性，對(duì)于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，并將有巨大的應(yīng)用前景。研究表明，大部分ERF基因的表達(dá)都受干旱、鹽堿、低溫、凍害、病害和機(jī)械傷害等逆境脅迫的誘導(dǎo)，克隆新的ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因，研究其基本的生物學(xué)特性和功能，可為整個(gè)植物抗逆基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及脅迫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，并為改良作物抗逆性提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。秋茄[Kandelia candel (L)Druce]是典型的鹽生植物一紅樹林樹種之一，葉子對(duì)生，果實(shí)細(xì)長，秋茄樹層通常高1. 5-6米。秋茄生長環(huán)境中土壤基質(zhì)鹽度高，受高鹽海水的周期性浸漬時(shí)間長，在長期的進(jìn)化過程中進(jìn)化出一套有別于陸生植物或淡水植物的耐鹽機(jī)制。秋茄具有極強(qiáng)的耐鹽堿能力，不僅在維護(hù)海岸生態(tài)平衡、環(huán)境監(jiān)測(cè)、水體凈化中起到重要作用，更主要的是由于該鹽生植物在長期生長進(jìn)化過程中形成了其特有的基因構(gòu)成及精密的表達(dá)調(diào)控方式，能夠合成并保持較多的耐鹽抗?jié)B透脅迫保護(hù)物質(zhì)。因此，從紅樹植物秋茄中克隆與抗逆性緊密相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，不僅能為基因工程育種提供優(yōu)良基因源，而且對(duì)于作物抗逆育種顯得尤為重要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種從紅樹林植物秋茄[Kandelia candel (L)Druce]中所分離、克隆的與抗逆性緊密相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA及其編碼蛋白。本發(fā)明目的之二是提供含有上述ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明目的之三是將所述的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA及其編碼蛋白應(yīng)用于提高或調(diào)節(jié)植物的脅迫抗性。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種從秋茄[Kandelia candel (L.)Druce]中所分離的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA，其核苷酸為(a)、(b)或(c)所示(a)、SEQ ID No. 1 所示的核苷酸；(b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的核苷酸；(c)、與SEQ ID NO 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸為SEQ ID N0:2所示。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的從秋茄中所分離的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA為SEQ ID No. 1所示的核苷酸。
本發(fā)明目的之二是提供由上述轉(zhuǎn)錄因子cDNA所編碼的能夠提高植物對(duì)環(huán)境脅迫抗性的ERF轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸為(a)或(b)所示(a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；(b) JfSEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 2所示ERF轉(zhuǎn)錄因子功能或活性的蛋白變體；優(yōu)選的，本發(fā)明所述的ERF轉(zhuǎn)錄因子為SEQ ID No. 2所示的氨基酸。所述的“多個(gè)”通常意味著2-8個(gè)，優(yōu)選為2-4個(gè)，這取決于ERF轉(zhuǎn)錄因子三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的“替換”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的“缺失”是指氨基酸殘基數(shù)量的減少，也即是分別缺少其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的“插入”是指氨基酸殘基序列的改變，相對(duì)天然分子而言， 所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備ERF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列變體或片段，其中所述誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。保守的取代是將一種氨基酸殘基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。本發(fā)明所述的ERF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因包括天然存在的序列和變體兩種形式。 “變體”意指基本相似的序列，對(duì)于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或/和替換。對(duì)于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定。變體多核苷酸還包括合成來源的多核苷酸，例如采用定點(diǎn)誘變或者是通過重組的方法得到的仍編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多核苷酸變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過以下分子生物技術(shù)手段來篩選或評(píng)價(jià)變體多核苷酸所編碼蛋白的功能或活性DNA結(jié)合活性，蛋白之間的相互作用，瞬時(shí)研究中基因表達(dá)的激活情況或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的效應(yīng)等。本發(fā)明提供了一種提高植物對(duì)環(huán)境脅迫抗性的方法，包括將本發(fā)明所分離的 ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA引入到植物或植物細(xì)胞中，能夠有效提高目標(biāo)植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性； 例如。可以將本發(fā)明ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA引入到目標(biāo)植物細(xì)胞中，培育篩選得到對(duì)環(huán)境脅迫的抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述的環(huán)境脅迫包括非生物逆境(干旱、低溫、鹽堿等)或生物逆境(如真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等引起的病蟲害以及雜草危害等)。本發(fā)明還提供了含有所述ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。將本發(fā)明所述ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接，得到可以在植物中表達(dá)該基因的植物表達(dá)載體?！翱刹僮鞯倪B接”指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。該植物表達(dá)載體可以由5'端非編碼區(qū)， SEQ ID No. 1所示的核苷酸和3'非編碼區(qū)組成，其中，所述的5‘端非編碼區(qū)可以包括啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列或/和翻譯增強(qiáng)序列；所述的啟動(dòng)子可以是組成性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子；所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，例如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將SEQ ID No. 1所示的核苷酸進(jìn)行優(yōu)化以增強(qiáng)在植物中的表達(dá)。例如?？刹捎媚繕?biāo)植物的偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化來合成多核苷酸以增強(qiáng)在目標(biāo)植物中的表達(dá)。本發(fā)明所述植物表達(dá)載體還可含有用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因以及賦予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的標(biāo)記基因還包括表型標(biāo)記，例如β-半乳糖苷酶和熒光蛋白等。本發(fā)明還涉及將所述的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA引入到植物中以提高植物的脅迫抗性； 所述的“引入”指將ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)部這樣的方式將多核苷酸或多肽轉(zhuǎn)化到植物中。將所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)法等。“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”指被引入的多核苷酸構(gòu)建體整合至植物細(xì)胞的基因組中并能通過其子代遺傳；“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暫時(shí)性表達(dá)或存在。所述轉(zhuǎn)化方案以及將所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物 (單子葉植物或雙子葉植物)或植物細(xì)胞的類型而變化。將所述多核苷酸或多肽引入植物細(xì)胞的合適方法包括顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移以及高速彈道轟擊等。在特定的實(shí)施方案中，可利用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將本發(fā)明的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA提供給植物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸來引入到植物中，通常，這樣的方法涉及將本發(fā)明的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA構(gòu)建體引入病毒DNA或RNA分子中。利用常規(guī)方法可使已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株(McCormick et al. Plant Cell Reports. 1986. 5 :81_84)。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類，包括但不限于單子葉植物或雙子葉植物。更優(yōu)選的，所述的目標(biāo)植物包括農(nóng)作物、蔬菜或觀賞植物、果樹等，例如， 可以是玉米、水稻、高粱、小麥、大豆、馬鈴薯、大麥、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等。將本發(fā)明ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA轉(zhuǎn)化到煙草中后，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量有明顯上升，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性有明顯的提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA能有效提高植物的耐鹽堿、抗病蟲害等環(huán)境脅迫抗性。本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度比與其它序列雜交的可檢測(cè)程度更高(例如超過本底至少2倍。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會(huì)不同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗滌條件可鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn)(Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, “ Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)。更具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度 PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度(在指定離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)(因?yàn)槟繕?biāo)序列過量存在，所以在1下在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件其中在pH 7.0到8.3下鹽濃度低于約1. OM鈉離子濃度，通常為約0. 01到1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對(duì)于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)而言為至少約30°C，而對(duì)于長探針(包括 (但不限于)大于50個(gè)核苷酸)而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下50%甲酰胺，5乂33(和SDS，在42°C 下培養(yǎng)；或5XSSC，1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2 X SSC中洗滌和在65°C下于0. SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長時(shí)間。術(shù)語“重組宿主細(xì)胞株”或“宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，宿主細(xì)胞還可為單子葉或雙子葉植物細(xì)胞。術(shù)語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括 PNA(肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；和 Cassol 等人，(1992) ；Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮口， 針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術(shù)語適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。


圖1 秋茄總RNA提取圖。圖2 簡并PCR擴(kuò)增結(jié)果；M =Marker 1 簡并PCR結(jié)果。圖 3 RACE-PCR 擴(kuò)增結(jié)果；M =Marker 1 =PCR 結(jié)果。圖 4 RACE-PCR 擴(kuò)增結(jié)果；M :DL2000Marker 1 :PCR 結(jié)果。圖5 =QqERF cDNA全長序列的擴(kuò)增結(jié)果；M :DNA Marker 1 :PCR產(chǎn)物。圖6 =QqERF氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果；a.擬南芥；b.辣椒；c.胡蘿卜； d.陸地棉；e.大豆；f.鈴鐺刺；g.番茄；h.水稻；i.秋茄；j.馬鈴薯。圖7 =QqERF亞細(xì)胞定位載體pl63_QqERF_GFP的構(gòu)建流程圖。
圖8 =QqERF轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)質(zhì)粒pbridge-QqERF的構(gòu)建流程圖。圖9 =QqERF 蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果；A :pl63-QqERF_GFP ；B 對(duì)照pl63_GFP。圖10 =QqERF轉(zhuǎn)錄激活功能驗(yàn)證結(jié)果。圖11 表達(dá)載體pC2301-3k_QqERF的構(gòu)建流程圖。圖12 表達(dá)載體pC2301-rd29A_QqERF的構(gòu)建流程圖。圖13 重組質(zhì)粒pC2301-3k_QqERF菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果；M :mark ； 1-20 菌落樣品； CK 陰性對(duì)照；CK+ 陽性對(duì)照。圖 14 重組質(zhì)粒 pC2301-rd29A_QqERF 菌落 PCR 擴(kuò)增結(jié)果；M :mark ； 1-20 菌落樣品；CK 陰性對(duì)照；CK+ 陽性對(duì)照。圖15 重組質(zhì)粒 pC2301-35s_QqERF 的酶切結(jié)果；1. XbaI 單酶切；2，Xbal+Kpnl 雙酶切；M :mark ； 1，質(zhì)粒；2，XbaI單酶切；3，Xbal+Kpnl雙酶切。圖 16 重組質(zhì)粒 pC2301-rd29a_QqERF 的酶切結(jié)果；1. XbaI 單酶切；2，Xbal+Kpnl 雙酶切；3，Pstl+Xbal雙酶切。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1秋茄ERF轉(zhuǎn)錄因子OiqERF)基因的克隆、生物信息學(xué)分析及結(jié)構(gòu)域的驗(yàn)證1材料與方法1. 1 材料1. 1. 1植物材料培養(yǎng)及脅迫處理秋茄枝條采集于深圳紅樹林自然保護(hù)區(qū)。用250mM的NaCl將木欖嫩枝浸泡處理證，摘取幼嫩葉片立即用液氮處理，保存于-80°C超低溫冰箱中備用。1.1.2菌株與質(zhì)粒
大腸桿菌(fecAericAia coll) DH5 α本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存
酵母菌株ΑΗ109 PMD19-T克隆載體 P163-GFP 載體 pBridge 質(zhì)粒
本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存購自TaKaRa公司中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院品質(zhì)所王天宇實(shí)驗(yàn)室提供 Clontech
農(nóng)桿菌菌株LBA4404本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存1. 1.3酶與試劑植物總RNA提取試劑盒與DNA膠回收試劑盒及高純質(zhì)粒小量制備試劑盒均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；Taq酶，3’ full RACE Kit和5’ full RACE Kit購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等購自NEB公司；第一鏈cDNA合成試劑盒購自MBI公司。
8引物合成和基因測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。氯仿，異丙醇，無水乙醇，異戊醇，蛋白胨，酵母提取物，NaCl, MgCl2, Tris飽和酚，磷酸二氫鈉等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?，氨芐青霉素，瓊脂糖，焦碳酸二乙酯(DEPC)，異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(Χ-gal)等分別購自北京百靈克生物公司。1.1.4 溶液1. TE(pH 8. 0) :10mmol/L Tris-HCl ； lmmol/L EDTA(pH 8. 0)。2. 50 X TAE (IL) =Tris 242. Og ；冰醋酸 57ml ；0. 5mMEDTA 100ml (pH 8. 0)。3. IM Tris-HCl (pH 8. 0，500ml) =Tris 60. 6g ；水 400ml ；濃 HCl 21. 0ml。4. 10XTE 緩沖液，ΙΧΤΕ/LiAc，鮭魚精 DNA(10mg/L)，PEG/LiAc, Z-緩沖液， Z-Buffer/X-gal solution，ONPG (鄰硝基苯 β-D-半乳糖苷)。5. 0. IM亞精胺，60mg/ml鎢粉懸液，無水乙醇，70%酒精。1. 1. 5主要實(shí)驗(yàn)操作儀器PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD)，_8(TC超低溫冰箱(SANYO)，高速冷凍離心機(jī)(Hettich)， 高速臺(tái)式離心機(jī)(Hettich)，電泳設(shè)備(Bio-RAD)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD)，Leica TCS SP2Confocal Spectral Microscope(UV-VIS)激光共聚焦顯微鏡，MK-20 干式恒溫器， PDS-1000/He 型基因槍，水浴鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，搖床，高壓滅菌鍋等。1.1.6 培養(yǎng)基1. 1.6. ILB液體培養(yǎng)基(lL，pH 7.4)蛋白胨 10. 0g，酵母提取物5. 0g，NaCllO. 0g。1. 1.6. 2LB 固體培養(yǎng)基(lL，pH 7.4)蛋白胨 10. 0g，酵母提取物 5. 0g，NaCllO. 0g， 瓊脂粉15. 0g。1. 1. 6. 3MS 培養(yǎng)基(1L, pH 5. 8)1.MS固體培養(yǎng)基(IL)
貯備液I 貯備液II 貯備液III
貯備液IV 貯備液V 蔗糖
植物凝膠2.貯存液 I (IL)
NH4NO3 KNO3
MgSO4 · 7H20 KH2PO4 3.貯存液 II (IL)
50ml
50ml
5ml
5ml
5ml
30g
2. 5g
33000mg 38000 mg 7400 mg 3400 mg
CaCl2 · 2H20 8800mg4.貯存液 III (IL)FeSO4 · 7H20 5560mgNa2-EDTA · 2H20 7460mg5.貯存液 IV (IL)
權(quán)利要求
1.從秋茄[Kandeliacandel (L.) Druce]中分離的ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA，其特征在于，其核苷酸為(a)、(b)或(c)所示(a)、SEQID No. 1所示的核苷酸；(b)、編碼SEQID No. 2所示氨基酸的核苷酸；(C)、與SEQ ID NO :1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼蛋白具有ERF轉(zhuǎn)錄因子功能或活性。
2.從秋茄[Kandeliacandel (L.)Druce]中分離的ERF轉(zhuǎn)錄因子全基因，其特征在于 其為SEQ ID No. 3所示的核苷酸。
3.權(quán)利要求1所述ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA所編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸為(a)或 (b)所示(a)、SEQID No. 2所示的氨基酸；(b)JfSEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 2所示ERF轉(zhuǎn)錄因子功能或活性的蛋白變體。
4.含有權(quán)利要求1所述cDNA或權(quán)利要求2所述全基因的表達(dá)載體。
5.按照權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體是植物表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求4或5所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的cDNA或權(quán)利要求2所述全基因在提高植物對(duì)環(huán)境脅迫抗性中的應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，包括構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述cDNA或權(quán)利要求2所述全基因的植物表達(dá)載體；將所構(gòu)建的植物表達(dá)載體引入到植物或植物細(xì)胞中，培育篩選得到對(duì)環(huán)境脅迫抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
9.權(quán)利要求3所述的蛋白在提高植物對(duì)環(huán)境脅迫抗性中的應(yīng)用。
10.按照權(quán)利要求7、8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的環(huán)境脅迫包括鹽堿或病蟲害。
全文摘要
本發(fā)明公開了秋茄ERF轉(zhuǎn)錄因子、其編碼基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用。本發(fā)明從紅樹林植物秋茄中分離得到一種ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA，其核苷酸為SEQ ID No.1所示。將本發(fā)明ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA轉(zhuǎn)化到煙草中后，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量有明顯上升，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性有明顯的提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明ERF轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)逆境信號(hào)，有效提高植物的耐鹽堿、抗病蟲害等環(huán)境脅迫抗性。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102168094SQ20111011322
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者吳燕民, 尉亞輝, 龐俊峰, 李聯(lián)社, 趙楊敏, 趙毅萍 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京永泰豐農(nóng)業(yè)科技有限公司