專利名稱：表達(dá)a型口蹄疫病毒空衣殼重組腺病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組腺病毒，尤其涉及表達(dá)A型口蹄疫病毒空衣殼的重組復(fù)制缺損型腺病毒及其構(gòu)建方法，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該重組復(fù)制缺損型腺病毒在制備預(yù)防或治療口蹄疫疫苗中的應(yīng)用，屬于口蹄疫的防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口蹄疫是豬、牛、羊等主要家畜和其它家養(yǎng)、野生偶蹄動(dòng)物共患的一種急性、熱性、 高度接觸性傳染病，易感動(dòng)物達(dá)70多種?？谔阋叩呐R床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水泡。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報(bào)的動(dòng)物傳染病。目前，有三分之二的 OIE成員國(guó)流行FMD，時(shí)刻威脅著無(wú)FMD國(guó)家和地區(qū)的家畜安全和畜產(chǎn)品貿(mào)易。口蹄疫病毒 (Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，其最大顆粒直徑為觀納米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七個(gè)血清型A、0、C、南非1、南非2、南非3和亞洲1型，以及65個(gè)以上亞型。0型口蹄疫為全世界流行最廣的一個(gè)血清型，中國(guó)流行的口蹄疫主要為0、A、C三種血清型?？谔阋卟《靖餮逯g沒(méi)有交叉保護(hù)，即使是同一血清型的不同亞型之間抗原差異程度也較大，以至于一種亞型的疫苗可能不完全保護(hù)同一血清型中其它亞型FMDV的感染，給口蹄疫的防治帶來(lái)了極大的困難。疫苗接種是成功預(yù)防、控制乃至最終消滅口蹄疫的最有效手段。目前用于防治口蹄疫的疫苗主要有合成肽疫苗滅活疫苗和兩種。合成肽疫苗是基于病毒的主要抗原位點(diǎn)，利用病毒的主要抗原位點(diǎn)的一部份氨基酸序列合成具有一定結(jié)構(gòu)的多肽，用于免疫動(dòng)物誘導(dǎo)中和抗體而達(dá)到保護(hù)的目的。但是，如果在病毒的主要抗原位點(diǎn)上發(fā)生關(guān)鍵氨基酸的突變，就會(huì)導(dǎo)致合成肽疫苗免疫保護(hù)效力的喪失。FMD滅活疫苗在消滅歐洲的口蹄疫以及控制世界其他國(guó)家的口蹄疫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。但是，滅活疫苗在生產(chǎn)中需要密閉設(shè)施來(lái)繁殖有毒力的病毒，存在活病毒逃逸的潛在風(fēng)險(xiǎn)，世界上一些地區(qū)FMD的暴發(fā)似乎與滅活疫苗中殘存的活病毒有關(guān)。此外，制備 FMD滅活疫苗的抗原未經(jīng)提純，含有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，難于進(jìn)行感染動(dòng)物和免接種動(dòng)物的鑒別診斷。如今成為研究熱點(diǎn)的口蹄疫候選疫苗包括減毒活疫苗，蛋白質(zhì)亞單位疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗和重組病毒疫苗等。到目前為止，證明最有效的FMD新型疫苗是人5型復(fù)制缺損型腺病毒(Ad5)表達(dá)的口蹄疫病毒空衣殼。Ad5作為一個(gè)理想的載體的重要原因是因?yàn)槠涿庖邉?dòng)物后不產(chǎn)生針對(duì)Ad5的中和抗體，排除了二次免疫的干擾。鑒于FMD滅活疫苗的上述缺點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外研究者都在尋求一種更加安全有效的口蹄疫疫苗。理想的口蹄疫疫苗應(yīng)具有病毒的完整抗原譜，其免疫原性類似于天然的病毒顆粒， 并且沒(méi)有病毒的核酸，不能自主復(fù)制等特點(diǎn)。以缺損型腺病毒(Ad5)為載體的口蹄疫病毒空衣殼疫苗完全滿足了上述要求，可被視為病毒減毒活疫苗和亞單位蛋白質(zhì)疫苗的結(jié)合， 這樣既可以避免亞單位疫苗需要佐劑和多次接種注射的缺陷，又可以誘導(dǎo)全面而持久的免疫反應(yīng)，而且其免疫動(dòng)物后不產(chǎn)生針對(duì)Ad5的中和抗體，排除了二次免疫的干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供編碼A型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組P1-2A-3C ；本發(fā)明的目的之二是提供一株攜帶所述亞基因組P1-2A-3C并能夠穩(wěn)定表達(dá)A型口蹄疫病毒空衣殼的重組缺損型腺病毒；本發(fā)明的目的之三是提供一種構(gòu)建上述重組缺損型腺病毒的方法；本發(fā)明目的之四是將所構(gòu)建的重組缺損型腺病毒應(yīng)用于制備成預(yù)防或治療A型口蹄疫的疫苗或試劑。為了實(shí)現(xiàn)上述之目的，本發(fā)明首先提供了編碼A型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組 P1-2A-3C，其核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示。構(gòu)建FMD病毒空衣殼的前提是必須保證得到完整、精確的FMDV基因組結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上才能正確拼接FMDV的P1-2A和3C亞基因組，否則將對(duì)口蹄疫病毒空衣殼的形成造成很大的影響。只有口蹄疫P1-2A-3C亞基因組序列的拼接正確，3C蛋白酶才能充分裂解口蹄疫前體蛋白并完成病毒衣殼組裝，這對(duì)后期的動(dòng)物免疫試驗(yàn)的效果會(huì)產(chǎn)生重要甚至決定性影響。此外，本發(fā)明在拼接口蹄疫P1-2A-3C亞基因組序列時(shí)加入了非結(jié)構(gòu)蛋白2B片段，該片段起到了免疫佐劑作用，能提高口蹄疫病毒空衣殼對(duì)本動(dòng)物尤其是豬的免疫保護(hù)效果。還需要說(shuō)明一點(diǎn)的是，在拼接編碼口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組時(shí)，本發(fā)明中所用的 A型FMDV序列與國(guó)內(nèi)外在拼接編碼口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組時(shí)所用到的FMDV序列不屬同一基因型。Mayr 等(Mayr, G. A. , Chinsangaram, J. , Grubman, M. J. , 1999, Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing the capsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate. Virology 263,496-506.)構(gòu)建了含A型FMDV基因組P1-2A-3C的重組腺病毒，并對(duì)其中構(gòu)建的一株重組腺病毒的3C蛋白酶基因進(jìn)行了突變，從而使3C蛋白酶不能發(fā)揮裂解蛋白的作用，在后期的動(dòng)物免疫試驗(yàn)中此株重組腺病毒就不能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體。本發(fā)明將所拼接的編碼口蹄疫病毒空衣殼的P1-2A-3C亞基因組序列導(dǎo)入到腺病毒中篩選得到穩(wěn)定表達(dá)FMD病毒空衣殼的重組腺病毒，該重組腺病毒免疫的小鼠產(chǎn)生了高水平的口蹄疫病毒中和抗體，這也進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明在體外正確地拼接了編碼口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組P1-2A-3C。篩選獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)A型FMDV空衣殼的重組腺病毒是本發(fā)明的另一重要之目的。為此，本發(fā)明提供了一株攜帶有SEQ ID No. 1所示的編碼A型口蹄疫病毒空衣殼亞基因組的重組缺損型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)；本發(fā)明將所篩選的滴度為7. 9 X 108PFU/ml的第 8代重組缺損型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)提交專利認(rèn)可的微生物保藏機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏號(hào)是=CGMCC No. 5718 ；分類命名是人血清5型復(fù)制缺損型腺病毒；保藏時(shí)間是 2012年1月16日；保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。將本發(fā)明重組腺病毒rAdV-A-P12A3C在HEK-293細(xì)胞上培養(yǎng)，用FMDV共享表位單克隆抗體4B2進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)為陽(yáng)性，其培養(yǎng)上清用Western blot檢測(cè)呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的陽(yáng)性反應(yīng)，表明重組腺病毒所攜帶的編碼A型口蹄疫病毒空衣殼亞基因組在HEK-293細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定、高效的表達(dá)。本發(fā)明采用一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定重組腺病毒rAdV-A-P12A3C在 HEK-293細(xì)胞中的復(fù)制能力，病毒在接種后60h復(fù)制水平達(dá)到高峰；本發(fā)明重組腺病毒的滴度達(dá)7.9X108PFU/ml。重組腺病毒rAdV-A_P12A3C所攜帶的外源基因在病毒傳代過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)A型口蹄疫病毒的衣殼蛋白并形成口蹄疫病毒空衣殼。將本發(fā)明重組腺病毒rAdV-A_P12A3C接種小鼠，在一免后3周出現(xiàn)中和抗體 (1 11)，隨后抗體水平逐漸升高，加強(qiáng)免疫后5周(一免后11周)中和抗體達(dá)到高峰 (1 223)，之后抗體水平逐漸下降，到第23周接種鼠的中和抗體水平接近陰性。試驗(yàn)研究表明，中和試驗(yàn)預(yù)測(cè)疫苗效力的精確度大于80. 0%，雖然不同實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果存在一定的差異。例如，預(yù)測(cè)保護(hù)率在73。6% 87%時(shí)的中和抗體滴度，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室為1.31ogl0， 而另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定值為1.681ogl0 ；Leonard B等在巴西、英國(guó)和德國(guó)進(jìn)行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)來(lái)源于765頭豬的攻毒試驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)分析表明，在95%的置信度，平均中和抗體滴度大于 1. 741ogl0時(shí)，動(dòng)物的保護(hù)率大于62. 5%。中和滴度檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)A 型口蹄疫病毒空衣殼的缺損腺病毒在小鼠體內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)高水平的中和抗體，作為預(yù)防A 型口蹄疫的疫苗具有重要的開發(fā)價(jià)值。總之，本發(fā)明所構(gòu)建的重組缺損腺病毒rAdV-A_P12A3C滴度高，在病毒傳代過(guò)程中穩(wěn)定地表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼，所表達(dá)的口蹄疫病毒空衣殼在小鼠體內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)高水平的中和抗體并可抵抗病毒的攻擊，可作為預(yù)防0型口蹄疫的疫苗。本發(fā)明重組缺損腺病毒所制備的疫苗不含有口蹄疫病毒遺傳物質(zhì)，因此不具有感染性；不必加佐劑，安全性更高，副作用更??；本發(fā)明疫苗接種動(dòng)物后，可獲得更持久的免疫反應(yīng)和較長(zhǎng)的免疫保護(hù)期； 本發(fā)明疫苗以復(fù)制缺損型腺病毒作為載體，其在體內(nèi)不復(fù)制，再次接種時(shí)不干擾疫苗的免疫效果。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建所述重組缺損型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)的方法，包括以下步驟將SEQ ID No. 1所示的亞基因組和腺病毒穿梭質(zhì)?？刹僮餍缘倪B接，得到重組腺病毒穿梭表達(dá)載體；將重組腺病毒穿梭表達(dá)載體與腺病毒骨架載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得了以質(zhì)粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將克隆化重組腺病毒基因組線型化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得重組缺損型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)。其中，所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒選自p-aiuttle，p-Shuttle-CMV, pAdTrack或 pAdTrack-CMV ；所述的病毒骨架載體質(zhì)粒選自pAdEasy-Ι或pAdEasy-2。


圖1重組腺病毒rAd-A-P12A3C感染HEK-293細(xì)胞引起的細(xì)胞病變；(A)感染 rAdV-A-P12A3C 的 HEK-293 細(xì)胞；(B)正常 HEK-293 細(xì)胞。圖 2 重組腺病毒 rAd-A-P12A3C 在 HEK-293 細(xì)胞中的 PCR 鑒定；1 :DL10, 000DNA Marker ；2-4 第 4 代，6 代和 8 代 rAdV-A_P12A3C ；5 腺病毒對(duì)照 Ad5。圖3間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)重組腺病毒rAd-A-P 12A3C感染的HEK-293細(xì)胞； A. rAd-A-P 12A3C 感染的 HEK-293 細(xì)胞；B. Ad5 感染的 HEK-293 細(xì)胞。圖4用Wfestern blot分析FMDV空衣殼在重組腺病毒rAd-A_P12A3C感染細(xì)胞中的表達(dá)；1 =Marker ；2 人5型缺損型腺病毒感染的HEK-293細(xì)胞；3_5 第4代、6代和8代 rAd-A-P12A3C 感染的 HEK-293 細(xì)胞；6 :FMDV。圖5重組腺病毒rAdV-A_P12A3C的一步生長(zhǎng)曲線。圖6重組腺病毒rAdV-A_P12A3C接種BALB/c小鼠中和抗體的動(dòng)態(tài)變化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。質(zhì)粒、載體和生化試劑腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι、腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV、大腸桿菌BJ5183感受態(tài)菌以及HEK-293細(xì)胞均購(gòu)自Mratagene公司。大腸桿菌JM109、DH5 α感受態(tài)細(xì)胞由本發(fā)明人試驗(yàn)室保存。PmeI和PacI均為NEB公司產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent 購(gòu)自 QIAGEN 公司?？谔阋卟《?VP2 單克隆抗體 4B2 (Yongzhong Yu, Haiwei Wang, Lei Zhao, Chunyuan Zhang, Zhigang Jiang, Li Yu*. Fine Mapping of a Foot-and—Mouth Disease Virus Epitope Recognized by Serotype-independent Monoclonal Antibody 4B2. The Journal of Microbiology, 2011,49 (1) :94-101.)由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室制備并保存。無(wú)外源基因表達(dá)的腺病毒(Ad5)由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。實(shí)施例1重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定1. A型FMDV亞基因組P1、2A2B和3C基因的合成根據(jù)A型FMDV的基因組序列，合成P1-2A2B-3C亞基因組(SEQ ID No. 1)，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為P-A-P12A3C。質(zhì)粒p-A-P12A3C含有kozka序列和起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。2.重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建將p-A-P 12A3C質(zhì)粒和腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV進(jìn)行Mil和EcoRV雙酶切， 膠回收純化酶切后的產(chǎn)物，與穿梭載體連接，并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)菌，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取菌落接種至5mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、 酶切和測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名pShuttle-A-P12A3C。3.重組腺病毒質(zhì)粒的獲得將pShuttle-A-P12A3C用限制性內(nèi)切酶RneI線性化，電轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-I的BJ5183感受態(tài)菌(AdEasy-l-BJ518 中。經(jīng)卡那霉素抗性篩選，提取質(zhì)粒， 用I^cI酶切鑒定，將陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證正確的命名為pAdV-A-P12A3C。4.轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒pAdV-A_P12A3C轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)菌，大量增殖重組質(zhì)粒。用中量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組腺病毒質(zhì)粒，用I^acI酶切，乙醇沉淀滅菌，超凈工作臺(tái)無(wú)菌吹干，用無(wú)菌超純水溶解沉淀，使質(zhì)粒的終濃度為l_2g/L。用QIAGEN公司轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。5.重組腺病毒的純化與鑒定
將獲得的初代重組腺病毒(命名為rAdV-A_P12A3C)反復(fù)凍融后，離心取上清，接種HEK-293細(xì)胞，連續(xù)傳8代，觀察細(xì)胞病變情況；轉(zhuǎn)染重組腺病毒質(zhì)粒后10d，HEK-293細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變特征，細(xì)胞變圓、變大、并脫落。當(dāng)80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收獲病毒，反復(fù)凍融3次后接種HEK-293細(xì)胞，連續(xù)傳8代。在傳至第5代時(shí)，細(xì)胞于接種病毒后對(duì)-4他開始出現(xiàn)CPE(圖1A)，而對(duì)照組(圖1B)細(xì)胞單層完整，形態(tài)規(guī)則。取2代、4代、6代和8代病毒，用蛋白酶K處理后，用PCR檢測(cè)目的基因。取第2 代、4代、6代和8代重組腺病毒，用DNA提取試劑盒提取重組病毒DNA，用引物A-U(5’ TTG TCG ACC CAC CAT GGG GGC AGG GCA ATC TAG C 3，)禾PA-L(5'TAG ATA TCT TAC TAT TCA TGG TGT GGC TCA GGG T 3’ )擴(kuò)增A型口蹄疫病毒P1_2A、2B和3C基因，檢測(cè)外源基因在重組腺病毒內(nèi)的穩(wěn)定性。由圖2可見(jiàn)，第2代、4代、6代和8代重組腺病毒均能檢出3. 5kb 的目的基因，說(shuō)明目的基因在重組腺病毒中穩(wěn)定存在。同時(shí)取4代、6代和8代重組腺病毒感染的HEK-293細(xì)胞，用口蹄疫病毒非血清型依賴的單抗4B2進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)及Western blot分析，以檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。間接免疫熒光試驗(yàn)將HEK-293細(xì)胞鋪于96孔板中，當(dāng)長(zhǎng)到90%單層時(shí)，接種15M0I (Multiplicities of infection) rAdV-A_P12A3C，24h 后棄去培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，將 rAdV-A_P12A3C 感染的HEK-293細(xì)胞用預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定15min，加入抗FMDV的單克隆抗體4B2，37°C作用lh，用PBST洗滌后，加入熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG(Sigma)于37°C作用45min，PBST洗滌后自然干燥，加入緩沖甘油，于熒光顯微鏡下觀察。試驗(yàn)結(jié)果表明重組腺病毒rAdV-A_P12A3C感染的細(xì)胞在熒光顯微鏡下出現(xiàn)特異的綠色熒光(圖3A)，而對(duì)照細(xì)胞則檢測(cè)不到熒光(圖:3B)，表明重組腺病毒所攜帶的目的基因(SEQ ID No. 1)在HEK-293細(xì)胞中得到穩(wěn)定的表達(dá)。試驗(yàn)例1P12A3C基因在重組腺病毒感染細(xì)胞中的表達(dá)和穩(wěn)定性分析1、Western blot用單克隆抗體4B2對(duì)第4代、6代、8代的重組腺病毒rAdV-A_P12A3C進(jìn)行^festern blot分析將感染rAdV-A-P12A3C的HEK-293細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時(shí)設(shè)立口蹄疫全病毒蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，野生型腺病毒感染的HEK-293細(xì)胞作為陰性對(duì)照，之后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶封閉后，加入抗FMDV的單克隆抗體4B2(1 1000稀釋)，37°C 作用lh，用PBST洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG (Sigma，1 10，000稀釋)， 37°C作用lh，洗滌后加入DAB溶液顯色。試驗(yàn)結(jié)果表明，與單克隆抗體4B2發(fā)生免疫反應(yīng)的條帶與FMDV空衣殼VP0、VP3、 VPl的分子量大小相當(dāng)(圖4)，說(shuō)明rAd-A-P12A3C在感染的HEK-293細(xì)胞中復(fù)制能產(chǎn)生口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VPO、VP1、VP3，并且穩(wěn)定地表達(dá)。2、重組腺病毒增殖滴度的測(cè)定分別用10M0I劑量的第8代重組腺病毒(rAdV-A_P12A3C)和野生型腺病毒(Ad5) 接種HEK493細(xì)胞，在接種后iai、24h、3Mi、4ai、60h和72h收取病毒并進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定 (Kleina L G. , Grubman M J. 1992. Antiviral Effects of a Thiol Protease Inhibitor on Foot-and-Mouth Disease Virus. J. Virol. 66 :7168-7175.)，建立重組腺病毒與野生型腺病毒的一步生長(zhǎng)曲線。分別用10M0I劑量的第4代、6代、8代和10代重組腺病毒 (rAdV-A-P12A3C)接種HEK-293細(xì)胞，在接種后60h收取病毒并進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定，檢測(cè)不同代
次重組病毒的病毒滴度。經(jīng)病毒滴度測(cè)定，繪制出第8代重組腺病毒rAdV-A_P12A3C與其親本病毒的一步生長(zhǎng)曲線，即病毒增殖滴度與生長(zhǎng)時(shí)間的相關(guān)性曲線，反映病毒生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，結(jié)果表明，隨著重組腺病毒感染HEK-293細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒滴度逐漸升高，在 60h時(shí)，病毒的滴度達(dá)到峰值，隨后開始下降。試驗(yàn)例2 BALB/c鼠的免疫接種在獲得穩(wěn)定高效表達(dá)A型口蹄疫空衣殼的重組腺病毒后，首先在BALB/c小鼠體內(nèi)檢測(cè)該重組腺病毒的免疫原性。7周齡BALB/c鼠25只，購(gòu)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，用免疫熒光方法檢測(cè)人腺病毒5型抗體為陰性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成5組，每組5只。 A組接種5X IO7PFU第8代的重組腺病毒rAdV-A-P12A3C，部位為后腿肌肉，用PBS稀釋， 在第一次免疫后第6周以相同劑量加強(qiáng)免疫；B組接種加法國(guó)佐劑ISA 206的重組腺病毒rAdV-A-P12A3C，免疫劑量、免疫次數(shù)及間隔時(shí)間同A組，佐劑與病毒比例為1 1，即 100 μ 1病毒+100 μ 1佐劑/mouse ；C組接種100 μ 1 A型口蹄疫BEI滅活疫苗，在第一次免疫后第6周以相同劑量加強(qiáng)免疫；D組接種100 μ 1 A型口蹄疫商品化滅活疫苗。E組接種 100 μ 1 Ad5腺病毒。免疫1周后采血以后每隔2周采血一次直到23周。1.微量細(xì)胞中和試驗(yàn)(1)病毒毒價(jià)的測(cè)定將病毒接種于單層細(xì)胞，37°C吸附Ih后加入維持液，置溫箱培養(yǎng)；逐日觀察，待細(xì)胞病變(CPE)達(dá)75%以上，收獲病毒懸液凍融3次，以3000r/min離心 lOmin，取上清液，定量分裝成Iml于1. 5ml EP管置_70°C保存?zhèn)溆?，選用的病毒對(duì)細(xì)胞有較穩(wěn)定的致病力。從_70°C冰箱取一 EP管保存的病毒，將病毒在96孔培養(yǎng)板上作10系列稀釋，即10^,10^,10"3……，每孔病毒懸液量為50 μ 1，每個(gè)稀釋度作8孔，每孔加入100 μ 1 細(xì)胞懸液，每塊板的最后一行設(shè)8孔細(xì)胞對(duì)照，制備細(xì)胞懸液的濃度可以使細(xì)胞在24h內(nèi)長(zhǎng)滿單層為度。把培養(yǎng)板置5% CO2溫箱37°C培養(yǎng)，從48-7 逐日觀察細(xì)胞病變，記錄結(jié)果。 按Reed和Muench兩氏法計(jì)算TCID5(1。(殷震，劉景華，動(dòng)物病毒學(xué)，第2版，北京科學(xué)出版社，1997，336 340.)，舉例說(shuō)明見(jiàn)表1。表1 TCID5tl計(jì)算(接種劑量50 μ 1)
權(quán)利要求
1.編碼A型口蹄疫病毒空衣殼的的亞基因組，其特征在于其核苷酸序列為SEQID No. 1所示。
2.權(quán)利要求1所述的亞基因組編碼的蛋白。
3.攜帶有權(quán)利要求1所述的亞基因組的重組腺病毒。
4.按照權(quán)利要求3所述的重組腺病毒rAdV-A-P12A3C，其特征在于，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 5718。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求3或4所述的重組腺病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將SEQ ID No. 1所示的亞基因組和腺病毒穿梭質(zhì)?？刹僮鞯倪B接，得到重組腺病毒穿梭表達(dá)載體；將重組腺病毒穿梭表達(dá)載體與腺病毒骨架載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得了以質(zhì)粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將克隆化重組腺病毒基因組線型化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得重組缺損型腺病毒。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒選自p-amttle、 p-Shuttle-CMV、pAdTrack 或 pAdTrack-CMV。
7.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的病毒骨架載體質(zhì)粒選自pAdEasy-1 或 pAdEasy-2。
8.權(quán)利要求1所述亞基因組在制備預(yù)防或治療口蹄疫的藥物或試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2所述蛋白在制備預(yù)防或治療口蹄疫的藥物或試劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)A型口蹄疫病毒空衣殼的重組腺病毒在制備預(yù)防或治療口蹄疫的藥物或試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達(dá)A型口蹄疫病毒空衣殼重組腺病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明將SEQIDNo.1所示的編碼A型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組和腺病毒穿梭質(zhì)粒可操作性連接得到重組腺病毒穿梭表達(dá)載體；將該重組腺病毒穿梭表達(dá)載體與腺病毒骨架載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了以質(zhì)粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將其線型化后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得本發(fā)明重組復(fù)制缺損型腺病毒。本發(fā)明重組復(fù)制缺損腺病毒滴度高，在復(fù)制過(guò)程中能夠形成A型口蹄疫病毒空衣殼并在病毒傳代過(guò)程中穩(wěn)定地表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼，所表達(dá)的口蹄疫病毒空衣殼在小鼠體內(nèi)可持續(xù)誘導(dǎo)高水平的中和抗體并可抵抗口蹄疫病毒的攻擊，可將其制備成預(yù)防或治療口蹄疫疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102533798SQ20121003011
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者于力 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所