專(zhuān)利名稱(chēng)：口蹄疫滅活疫苗安全種毒載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種ロ蹄疫滅活疫苗安全種毒載體及應(yīng)用，即在該載體基礎(chǔ)上構(gòu)建不同血清型的ロ蹄疫滅活疫苗安全生產(chǎn)種毒。屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
ロ蹄疫是由ロ蹄疫病毒引起偶蹄動(dòng)物的ー種急性、熱性、高度傳染性病毒性疾病。該病除ー些島國(guó)外，曾廣泛流行世界各地，給世界畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為控制和撲滅ロ蹄疫世界各國(guó)投入巨資，截止2007年5月，OIE公布59個(gè)國(guó)家為非免疫的無(wú)ロ蹄疫國(guó)家，9個(gè)國(guó)家部分地區(qū)為非免疫的無(wú)ロ蹄疫地區(qū)，7個(gè)國(guó)家或地區(qū)為免疫無(wú)ロ蹄疫國(guó)家。ロ蹄疫目前仍然在亞洲、非洲、南美部分國(guó)家和地區(qū)流行。無(wú)ロ蹄疫國(guó)家為了防止ロ蹄疫的傳入和再次爆發(fā)，特別是發(fā)達(dá)國(guó)家制定了一系列近乎殘酷的國(guó)際貿(mào)易條例，限制ロ蹄疫流 行國(guó)家動(dòng)物及其產(chǎn)品世界貿(mào)易。OIE也將該病列為頭號(hào)動(dòng)物疫病，所以ロ蹄疫素有“政治經(jīng)濟(jì)病”之稱(chēng)(謝慶閣主編，ロ蹄疫，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004 )。ロ蹄疫預(yù)防控制策略主要包括兩大類(lèi)其一是以撲殺為主的綜合防控措施，是無(wú)ロ蹄疫的發(fā)達(dá)國(guó)家主要采取的措施，其ニ是以免疫為主的綜合防控措施，是ロ蹄疫流行國(guó)家和經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)無(wú)ロ蹄疫國(guó)家所采取的主要措施，也是歐洲大多數(shù)國(guó)家60年代和南美部分國(guó)家80年代成功的控制和撲滅ロ蹄疫的主要措施，疫苗在其中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。針對(duì)我國(guó)及其周邊國(guó)家和地區(qū)ロ蹄疫流行狀況，我國(guó)采取以免疫為主，實(shí)施全國(guó)大面積普遍免疫結(jié)合局部撲殺和其它綜合防控措施控制ロ蹄疫。實(shí)施免疫為主的綜合防控措施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之ー是疫苗。易感動(dòng)物在感染ロ蹄疫病毒或免疫ロ蹄疫病毒抗原以后,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗ロ蹄疫病毒抗體，該抗體可以抵抗同型病毒的再次感染，所以人們自1925年開(kāi)始就研究出ロ蹄疫病毒滅活疫苗用于ロ蹄疫的預(yù)防控制。為了提高疫苗的免疫效カ和安全性對(duì)ロ蹄疫疫苗進(jìn)行了不斷的探索和改進(jìn)。對(duì)傳統(tǒng)滅活疫苗改進(jìn)了滅活劑，由傳統(tǒng)的甲醛滅活改為更安全的BEI，為了提高免疫效カ將氫氧化鋁水劑佐劑改為更為有效的免疫持續(xù)期更長(zhǎng)的礦物油佐劑。探索了弱毒疫苗的可行性，先后研制了非易感動(dòng)物傳代、化學(xué)試劑或溫度誘變等方法致弱疫苗毒株，60年代在臨床上試用，發(fā)現(xiàn)很難找到毒力與免疫原性的平衡點(diǎn)，加上ロ蹄疫病毒宿主范圍廣，致弱毒株在不同宿主之間毒カ差異比較大，逐漸停用或禁用。90年代人們采用基因工程方法，改變結(jié)構(gòu)蛋白及病毒受體結(jié)合位點(diǎn)“RGD”或刪除致病基因“L蛋白”編碼基因，構(gòu)建新型基因工程致弱毒株，實(shí)驗(yàn)研究表明這些毒株可以作為弱毒疫苗毒株免疫動(dòng)物，而且安全性能比傳統(tǒng)致弱毒株高，但考慮到使用弱毒疫苗毒株不利于感染與免疫鑒別診斷而未廣泛使用。ロ蹄疫基因工程疫苗，包括原核、真核表達(dá)系統(tǒng)，植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗原，DNA疫苗,各種載體系統(tǒng)(腺病毒、痘苗病毒、偽狂犬病毒等)構(gòu)建的載體疫苗,合成肽疫苗等一度給ロ蹄疫安全高效疫苗的研究帶來(lái)了希望，但至今除豬用合成肽疫苗據(jù)報(bào)道有效果以外，沒(méi)有一種通過(guò)國(guó)家或地區(qū)審評(píng)批準(zhǔn)上市的ロ蹄疫新型疫苗。ロ蹄疫預(yù)防控制仍然采用傳統(tǒng)滅活疫苗，是經(jīng)過(guò)歷史考驗(yàn)的最為有效的ロ蹄疫疫苗，但作為傳統(tǒng)疫苗不可否認(rèn)具有自身的缺陷。ロ蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)和檢驗(yàn)必須使用強(qiáng)毒株病毒，疫苗生產(chǎn)首先采用強(qiáng)毒株在BHK21細(xì)胞中大量繁殖，經(jīng)過(guò)滅活、純化，配以適當(dāng)?shù)淖魟┤榛?。成品疫苗還必須使用免疫本動(dòng)物強(qiáng)毒株攻毒進(jìn)行檢驗(yàn)。世界上嚴(yán)格規(guī)定ロ蹄疫疫苗制造、ロ蹄疫病毒研究必須在生物安全3級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室或疫苗生產(chǎn)車(chē)間必須有高度安全的防泄漏系統(tǒng)，必須有高效空氣過(guò)濾系統(tǒng)，疫苗制備抗原必須徹底滅活ロ蹄疫病毒，防止病毒泄漏擴(kuò)散造成疫病暴發(fā)，所以滅活疫苗的安全性一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。甲醛是ロ蹄疫滅活疫苗最初采用的滅活劑，但由于甲醛滅活凝固蛋白，易造成病毒大量聚集滅活不徹底，后來(lái)更換為BEI，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道歐洲80年代前后發(fā)生幾次ロ蹄疫與疫苗滅活不徹底有夫，歐盟于1990年停止使用疫苗。歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家建有ロ蹄疫疫苗抗原庫(kù)，用以配制緊急疫苗，但他們明確規(guī)定不能在本國(guó)生產(chǎn)滅活抗原，其保存抗原都是在非洲、南美等生產(chǎn)廠家生產(chǎn)滅活以后購(gòu)進(jìn)儲(chǔ)藏的。位于英國(guó)的世界ロ蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室周邊曾在70年代發(fā)生過(guò)一次南非2型ロ蹄疫，據(jù)報(bào)道因?qū)嶒?yàn)室泄漏造成。據(jù)2005年世界ロ蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室年度報(bào)告指出，近年來(lái)全世界C 型ロ蹄疫發(fā)生很少，2004年肯尼亞發(fā)生一次C型ロ蹄疫可能與當(dāng)?shù)厥褂靡呙缬蟹颍b于此建議世界范圍停止使用C型疫苗。2007年英國(guó)發(fā)生一次0型ロ蹄疫，分離毒株鑒定與1976年分離的實(shí)驗(yàn)室毒株OlBFS相近，本次暴發(fā)ロ蹄疫可能與發(fā)生地附近疫苗廠下水道泄漏有關(guān)。鑒于ロ蹄疫滅活疫苗采用強(qiáng)毒株生產(chǎn)，存在嚴(yán)重的安全隱患，本發(fā)明根據(jù)ロ蹄疫病毒的生物學(xué)特性，米用反向遺傳操作技術(shù)，研發(fā)了 ロ蹄疫基因工程缺失弱毒株，該毒株缺失了 ロ蹄疫病毒毒力基因之一的L蛋白基因，L蛋白編碼基因是ロ蹄疫病毒的主要毒力基因，該蛋白可以有效的阻斷宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，特別是宿主病毒感染之后無(wú)法啟動(dòng)非特異性免疫應(yīng)答一干擾素系統(tǒng)，該基因工程弱毒株對(duì)乳鼠、豚鼠等試驗(yàn)動(dòng)物不致病，對(duì)ロ蹄疫毒易感動(dòng)物毒力顯著降低。在此弱毒株的基礎(chǔ)上，我們刪除了主要表面結(jié)構(gòu)蛋白基因插入了ー個(gè)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了弱毒株ロ蹄疫感染性克隆為基礎(chǔ)的ロ蹄疫病毒基因工程弱毒載體，可以將不同血清型(0、Asia1、A)強(qiáng)毒制苗種毒或田間分離強(qiáng)毒的任何ロ蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因插入該ロ蹄疫病毒基因工程弱毒載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞拯救出活病毒，該病毒維持致弱特性，并呈現(xiàn)所插入外源基因編碼蛋白的抗原結(jié)構(gòu)和免疫原性。用該毒株大量培養(yǎng)抗原制備疫苗，制備疫苗維持了疫苗生產(chǎn)毒株抗原性，但提高了疫苗制造過(guò)程中的生物安全性。ロ 蹄疫病韋(Foot-and-mouth disease virus)屬小 RNA 病韋科(Picornaviridae) ロ瘡病毒屬(Aphthovirus),是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)最早的動(dòng)物病毒。病毒粒子無(wú)囊膜，呈二十面體立體對(duì)稱(chēng)，直徑約23-30nm，X線晶體衍射三維立體結(jié)構(gòu)為表面相對(duì)光滑的球形，由60個(gè)分子的結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4包裹著ー個(gè)分子的RNA病毒基因組組成。ロ蹄疫病毒基因組RNA長(zhǎng)約8. 3kb，為單股正鏈RNA，具有感染性，含有ー個(gè)長(zhǎng)的開(kāi)放讀碼框(0RF)，兩側(cè)為Y UTR和:V UTR0 ロ蹄疫病毒RNA 5' UTR比較長(zhǎng)，大約1300nt，5'端無(wú)mRNA特有的帽結(jié)構(gòu)，而共價(jià)連接ー個(gè)病毒編碼多肽VPg (3B)。3' UTR由一段約IOOnt的序列和Poly (A)尾巴組成，與病毒RNA的感染性和穩(wěn)定性、激活5' UTR IRES等有關(guān)。
FMDV基因組中最長(zhǎng)的部分是翻譯約2330氣基酸聚蛋白的編碼序列，其蛋白翻譯和加工同時(shí)進(jìn)行。ロ蹄疫病毒編碼蛋白分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，按照基因組編碼順序分別為L(zhǎng)蛋白、P1-2A衣殼前體蛋白、P2前體蛋白、P3前體蛋白，分別經(jīng)病毒蛋白酶和宿主細(xì)胞蛋白酶加工成15種成熟蛋白。L蛋白具有自身切割功能，將其從Pl前體蛋白上解1 (Jakuo Kronovetr, I'lm Skern. Foot-and-moutn disease virus leader proteinase: apapain—like enzyme requiring an acidic environment in the active site. FEBSLetters 2002 (528) 58 62);具有裂解翻譯起始因子eIF4G，抑制帽結(jié)構(gòu)mRNA翻譯功能(Piccone. M. E. ,M. Zellner,T. F. Kumosinski,et al.1dentification of the active-siteresidues of tne L protemaseoi foot-and-mouth disease virus, j.ゾirol. 1995
(69):4950 - 4956) ;L蛋白具有顯著抑制動(dòng)物先天性抗ロ蹄疫應(yīng)答作用，主要通過(guò)抑制干擾素表達(dá)，降低動(dòng)物先天性對(duì)病毒抵抗能力，造成病毒大量繁殖和迅速擴(kuò)散。L蛋白不是病毒復(fù)制所必需的病毒蛋白，L蛋白缺失病毒對(duì)易感動(dòng)物致病カ明顯 下降(Maria ElisaPiccone,Elizabeth Rieder, Peter W. Mason,et al. The Foot-and—Mouth Disease VirusLeader Proteinase GeneIs Not Required for Viral Replication. JOURNAL OF VIROLOGY1995(69):5376-5382)。FMDV基因組PI區(qū)，編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白VP4，VP2，VP3和VPI，但在FMDV基因組翻譯蛋白加工工程中，是通過(guò)2A (19個(gè)氨基酸多肽)自身切割為P12A前體蛋白形式存在，隨后由3C進(jìn)ー步加工成VP0、VP3和VP1。VP0、VP3、VP1可以組裝成空衣殼，也可以與病毒RNA組裝成前病毒顆粒，隨著VPO以ー種目前尚不清楚的機(jī)制降解為VP4和VP2而形成完整的具有感染性的病毒顆粒。X-射線晶體衍射技術(shù)解析病毒衣殼的精細(xì)結(jié)構(gòu)，VP1-VP3位于病毒衣殼表面，不同血清型病毒之間差異比較大，VP4位于內(nèi)部，不同血清型病毒之間相對(duì)保守，變異程度不大。該病毒的表面比較光滑，而無(wú)其他小RNA病毒所具有的凹陷結(jié)構(gòu)，但有ー些微小的環(huán)狀突起，是病毒的主要中和位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)所在(Nuria Verdaguer,Mauricio G. Mateul, David Andreu, et a1. Structure of the major antigenic loopoffoot-and-mouth disease virus complexed with aneutralizing antibody:directinvolvement of theArg-Gly-Asp motif in the interaction.The EMBO Journal,1995(14) :1690-1696)。ロ蹄疫病毒抗原表位多為結(jié)構(gòu)依賴(lài)性表位，所以ロ蹄疫病毒的抗原性和免疫原性取決于結(jié)構(gòu)蛋白。反向遺傳操作技術(shù)是研究RNA病毒基因組特性的新型常規(guī)技術(shù)已被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所掌握，利用ロ蹄疫病毒基因組為正單股RNA，基因組本身具有感染性的特性，將基因組在體外轉(zhuǎn)錄為DNA形式克隆至大腸桿菌質(zhì)粒之中，可以方便的對(duì)基因組進(jìn)行基因操作，再在體外制備出RNA，將RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新獲得病毒的ー項(xiàng)技術(shù)。美國(guó)梅島動(dòng)物疫病研究中心于80年代末期成功的構(gòu)建了 A型和0型ロ蹄疫病毒的感染性克隆，并通過(guò)L蛋白編碼基因缺失獲得了 L蛋白缺失A型ロ蹄疫病毒。我國(guó)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所也成功的構(gòu)建了豬源0型ロ蹄疫病毒感染性克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建ー種ロ蹄疫滅活疫苗安全種毒載體，可在載體中插入任意A型或Asia I型或0型ロ蹄疫毒株結(jié)構(gòu)蛋白基因而獲得相應(yīng)嵌合病毒，以嵌合病毒為疫苗生產(chǎn)種毒制備ロ蹄疫滅活疫苗。1.該類(lèi)疫苗毒株安全性高，因缺失L蛋白，病毒對(duì)乳鼠、豚鼠、豬的致病力大大降低，不引起臨床癥狀和病理反應(yīng)，但可以在BHK-21細(xì)胞中正常繁殖；2.該類(lèi)疫苗毒株通過(guò)插入口蹄疫任意流行毒株結(jié)構(gòu)蛋白基因快速構(gòu)建嵌合病毒，可快速生產(chǎn)與流行毒匹配性良好的疫苗；3.該類(lèi)疫苗毒株通過(guò)將嵌合病毒的感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞拯救，獲得大量病毒，從而可作為ロ蹄疫疫苗種毒株，避免了 ロ蹄疫疫苗生產(chǎn)檢驗(yàn)中使用強(qiáng)毒，又不影響疫苗的免疫原性，確保疫苗的針對(duì)性適時(shí)性提高疫苗生產(chǎn)安全性。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的1. ロ蹄疫病毒重組載體的構(gòu)建，其特征在于該載體的構(gòu)建包括如下步驟
(I) ロ蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的構(gòu)建是以ロ蹄疫病毒0/CHA/90全長(zhǎng)感染性克隆(Qizu Zhao, Juan M. Pacheco, and Peter ff. Mason. Evaluation of GeneticallyEngineered Derivatives of a Chinese Strain of Foot-and—Mouth Disease VirusReveals a Novel Ceil_Binding Site Which Functions in Cell Culture and inAnimals.JOURNAL OF VIR0L0GYV,2003 (3) ,3269 - 3280 ；0ffice International desEpizooties. 1990. OIE BuIL 102:724.)為基礎(chǔ)，使用序列I和序列2所述的ー對(duì)引物及序列4和序列5所述的ー對(duì)引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增刪除Lb基因，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，以Xba I /Not I酶切連接到CHA90全長(zhǎng)感染性克隆中構(gòu)建而成，命名為p43-CHA90-LL ；(2)結(jié)構(gòu)蛋白基因的刪除及酶切位點(diǎn)的引入是以CHA90全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒為模板，使用序列8和序列9所述的ー對(duì)引物及序列10和序列11所述的ー對(duì)引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增，刪除結(jié)構(gòu)蛋白Pl大部分基因(VP2、VP3、VP1)，同時(shí)通過(guò)同義突變引入酶切位點(diǎn)Ssp1、SgrA I，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，以Kpn I酶切連接至(I)項(xiàng)構(gòu)建的p43-CHA90-LL中，構(gòu)建獲得的陽(yáng)性克隆命名為p43-CHA90-LL-Vector，該重組載體p43-CHA90-LL_Vector轉(zhuǎn)入到已大腸埃希氏菌中，被命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli )p43-CHA90-LL_Vector株,該菌株于2012年11月29日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6898。ロ蹄疫病毒重組載體的應(yīng)用，包括(I)含ロ蹄疫病毒流行株病毒結(jié)構(gòu)蛋白的感染性克隆構(gòu)建，其構(gòu)建是通過(guò)PCR擴(kuò)增ロ蹄疫病毒不同流行株病毒的相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白部分，插入到重組載體p43-CHA90-LL-Vector，通過(guò)病毒拯救，構(gòu)建了分別含0型、Asia I型和A型不同流行毒株的ロ蹄疫嵌合病毒。(2) ロ蹄疫嵌合病毒的拯救，是含0型、Asia I型和A型不同流行毒株的嵌合病毒感染性克隆質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄制備成RNA或直接將質(zhì)粒DNA與T7聚合酶表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，成功拯救出病毒。(3)將缺失L蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白或兩者均缺失的ロ蹄疫病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建獲得的包含0型、Asia I型或A型不同毒株的嵌合病毒通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)大量繁殖病毒，用于ロ蹄疫疫苗生產(chǎn)，制備相應(yīng)型毒株的滅活疫苗，其滅活疫苗的制備方法為將ロ蹄疫嵌合病毒接種生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)90%以上時(shí)收獲病毒，經(jīng)滅活、純化、濃縮處理后，加入油佐劑(如Mantanide ISA206)乳化而成。
具體實(shí)施方案一、ロ蹄疫滅活疫苗安全種毒載體的構(gòu)建1. ロ蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的構(gòu)建以CHA90株ロ蹄疫病毒全長(zhǎng)感染性克隆(本發(fā)明人構(gòu)建，見(jiàn)圖1)為基礎(chǔ)，用序列I和序列2所述的ー對(duì)引物及序列4和序列5所述的ー對(duì)引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增刪除Lb基因，如圖2所示，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體(Takara公司)，測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，以Xba I /Not I酶切連接到CHA90全長(zhǎng)感染性克隆中構(gòu)建而成，命名為P43-CHA90-LL。
2.結(jié)構(gòu)蛋白基因的刪除及酶切位點(diǎn)的引入以ロ蹄疫病毒CHA90株全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒為模板，用序列8和序列9所述的一對(duì)引物及序列10和序列11所述的ー對(duì)引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增，刪除結(jié)構(gòu)蛋白Pl大部分基因，同時(shí)通過(guò)同義突變引入酶切位點(diǎn)Ssp1、SgrA I，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體(Takara公司)，測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒(Omega公司)，以Kpn I酶切連接至p43-CHA90_LL中，構(gòu)建獲得的陽(yáng)性克隆(載體)命名為p43-CHA90-LL-Vector (如圖3所示)，該載體已轉(zhuǎn)入到大腸埃希氏菌中，該株帶有p43-CHA90-LL-Vector 的大腸埃希氏菌(購(gòu)自 TransGen Biotech 公司)于 2012 年 11 月 29日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6898。ニ、ロ蹄疫滅活疫苗安全種毒載體的應(yīng)用1. ロ蹄疫嵌合病毒cDNA感染性克隆的構(gòu)建(I)用序列12和序列13所述的ー對(duì)引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得A型A/HuBWH/CHA/2009株的Pl基因(包括VP2、VP3、VPl),同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)Ssp I ,SgrA I，經(jīng)克隆測(cè)序，篩選陽(yáng)性菌落，細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，以Ssp I /SgrA I雙酶切連接至p43-CHA90-LL-Vector中，獲得A型毒株的相應(yīng)嵌合病毒cDNA感染性克?。?2)用序列14和序列15所述的ー對(duì)引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得 Asia I 型 Asial/Jiangsu/China/2005 的 Pl 基因(包括 VP2、VP3、VPl )，同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)Ssp I , SgrA I，經(jīng)克隆測(cè)序，篩選陽(yáng)性菌落，細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，以Ssp I /SgrA I雙酶切連接至p43-CHA90-LL-Vector中，獲得Asia I型毒株的相應(yīng)嵌合病毒cDNA感染性克隆；(3)用序列16和序列17所述的ー對(duì)引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得O型不同拓?fù)湫投局?ME-SA拓?fù)湫蚉anasia譜系0/HB/07-4株、Cathay拓?fù)湫托仑i毒II譜系0/GX/09-7株和SEA拓?fù)湫蚆ya98譜系0/XJ/10-11株)的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1)，同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)Ssp I , SgrA I，經(jīng)克隆測(cè)序，篩選陽(yáng)性菌落，細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，以Ssp I /SgrA I雙酶切連接至p43-CHA90-LL-Vector中，獲得O型不同毒株的相應(yīng)嵌合病毒cDNA感染性克隆。利用本發(fā)明構(gòu)建的載體p43-CHA90-LL-VeCtor，可以根據(jù)國(guó)外ロ蹄疫流行動(dòng)態(tài)和免疫原性分析結(jié)果，采用人工DNA合成技木，合成對(duì)我國(guó)將造成威脅的ロ蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因，制成嵌合病毒，制備疫苗，作為技術(shù)儲(chǔ)備應(yīng)急使用。免除了將我國(guó)尚未流行的境外強(qiáng)毒株引入開(kāi)展儲(chǔ)備性研究造成病毒擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的體外轉(zhuǎn)錄將A型或Asia I型或0型嵌合病毒cDNA感染性克隆質(zhì)粒線性化處理，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成RNA。線性化DNA :用限制性?xún)?nèi)切酶處理A型或Asia I型或0型嵌合病毒cDNA感染性克隆質(zhì)粒使其線性化
質(zhì)粒30pL 10xbuffer5f.1L
IOxBSAS^iL
Swal I3|xL
ddH07^iL
總量50pL25で酶切12 16小時(shí)。去RNase :加入蛋白酶K消化酶切產(chǎn)物，以達(dá)到去除RNase的效果
0.5moI/L EDTAI^L
10%SDSl\ih
蛋白酶KI^iL
Givcogen from ovster Tvpex2I uL
STE buffer46(_iL
線性化質(zhì)粒50pL
總體積IOOjiL苯酚氯仿抽提在100 ii L去RNase的線性化質(zhì)粒中加入100 U L苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)，游潤(rùn)混合，4°C, 12000r/min 離心 15min ；酒精沉淀取上清約80 90ii L，加入2. 5倍體積的無(wú)水こ醇，1/10倍體積的3mol/L醋酸鈉，混勻，放置_20°C沉淀30分鐘，4°C，12000r/min離心15min ；DNA溶解棄上清，在37°C干燥15min，加入15 ii L無(wú)核酶水。RNA轉(zhuǎn)錄按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,加入以下成分。DNA模板5pL
IOXbuffer2jLiL
酶混合物2卟
各種 dNTP2\xh
無(wú)核酶水3h.L
總體積20gL39 °C作用2 3小時(shí)，電泳檢測(cè)。 3.病毒拯救通過(guò)電轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將A型或Asia I型或0型嵌合病毒RNA轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，成功拯救出相應(yīng)病毒。轉(zhuǎn)染后48 72小時(shí)可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞產(chǎn)生病變(CPE)，經(jīng)過(guò)傳代觀察CPE，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定病毒拯救成功。4.病毒傳代將轉(zhuǎn)染RNA培養(yǎng)48 72小時(shí)、BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)95%CPE后收獲病毒液，按照5 10%的接毒量接種生生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞。5. RT-PCR檢測(cè)病毒用Trizol法或試劑盒提取病毒液中RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用引物(No. 15，No. 16)擴(kuò)增A型、0型、Asia I型ロ蹄疫病毒VPl基因，測(cè)序，每隔2代進(jìn)行一次PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系如下
IOxbufferSjllL
dNTP3 |iiL
上游引物2pL
下游引物2pL
Taq-HS0.3uL
H2O32.7uL
cDNA5ドし
總體積50pL混勻后按照以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增
95lC2min
951 30sI
55 C30s 3OcycIe
72 0CImin
72 TJ IOnvin用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)A型、0型、Asia I型PCR目的條帶大小分別為745bp，745bp，798bp06.病毒遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)將姆次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送測(cè)序，一直檢測(cè)至15代，A型、
0型、Asia I嵌合病毒VPl基因中僅出現(xiàn)少量堿基突變，氨基酸未出現(xiàn)突變。
7. FMD抗原檢測(cè)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(雙夾心ELISA方法)檢測(cè)各血清型嵌合病毒，結(jié)果均為陽(yáng)性。三、ロ蹄疫滅活疫苗的制備1.病毒的繁殖(I)通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)病毒將傳代至8 12代的病毒液作為生產(chǎn)種子批，凍存于-80°C冰箱，繁殖病毒時(shí)取病毒液解凍，按照5 10%的比例接種生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞，每瓶1. 5L，培養(yǎng)24 48小時(shí)，待細(xì)胞病變(CPE)出現(xiàn)95%以上時(shí)收獲病毒，凍存于_20°C待檢。(2)通過(guò)懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)病毒取8 12代的生產(chǎn)種子批病毒液,接種5L發(fā)酵罐，通過(guò)逐級(jí)放大至1000L，待懸浮BHK-21細(xì)胞病變達(dá)到95%以上時(shí)收獲病毒，病毒液凍存于-20°C待檢。(3)制苗毒液的檢驗(yàn)I)無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典ニ零一零年版三部中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010，本發(fā)明稱(chēng)《中國(guó)獸藥典》)附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉囷生長(zhǎng)；2)支原體檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄49頁(yè)進(jìn)行，無(wú)支原體生長(zhǎng)；3)病毒含量測(cè)定TCID5。測(cè)定將病毒液10倍系列稀釋至10_8，分別接種生長(zhǎng)良好的96孔BHK-21細(xì)胞，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，每孔接種100 u L，放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小吋，觀察細(xì)胞病變并計(jì)算TCID5tlt5各株ロ蹄疫嵌合病毒毒價(jià)均超過(guò)104TCID5(l/mL。146S含量測(cè)定取病毒液50ml在4°C，8000r/min條件下離心30min，以除去滅活抗原液中殘留的細(xì)胞碎片；取上清液，加入等體積三氯こ烯，充分混勻后，4°C 8000r/min離心30min。離心后，取出上清液，裝入超速離心管中，4°C 40000r/min離心3. 5h。離心后，棄上清液，往每只離心管內(nèi)加入0. 5ml TNE緩沖液(pH 7. 6)，用超聲波處理充分分散沉淀物。第2天取出濃縮的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度頂部，然后4°C 35000r/min離心2. 5h，離心結(jié)束后，使用蠕動(dòng)泵從離心管底部開(kāi)始抽吸液體，每約0. 5ml收集一管，經(jīng)紫外分光光度測(cè)定OD259nm值，計(jì)算45% 35%間蔗糖梯度處最高峰值的146S抗原含量。經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量較低，所有病毒146S含量為0. 4 1. 5 ii g。而懸浮培養(yǎng)可以大大提供病毒中146S的含量,可達(dá)3. 0 7. Oii g。4) ロ蹄疫嵌合病毒對(duì)動(dòng)物致病性檢驗(yàn)乳鼠試驗(yàn)每株ロ蹄疫嵌合病毒用體重18 22g乳鼠8只，每只皮下注射病毒液0.5ml，觀察7日，所有乳鼠健活。證明A型或Asia I型或0型不同毒株的ロ蹄疫嵌合病毒對(duì)乳鼠無(wú)致病カ或較弱。本動(dòng)物試驗(yàn)根據(jù)流行毒株主要感染動(dòng)物的不同，分為豬體實(shí)驗(yàn)和牛體試驗(yàn)，如A型ロ蹄疫主要侵害牛，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用牛；如0型ロ蹄疫緬甸98譜系毒株對(duì)豬和牛均有較強(qiáng)的感染性，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用豬和牛。 豬體試驗(yàn)每株ロ蹄疫嵌合病毒用30 40日齡的健康易感仔豬(乳鼠中和抗體滴度彡1:4或細(xì)胞中和抗體滴度彡1:8或ELISA抗體效價(jià)彡1:8和3ABC抗體檢測(cè)OD值小于0. 2) 2頭，各兩側(cè)耳根后肌肉注射2mL病毒液，每頭共4mL，連續(xù)觀察14天，所有豬只健活，表明所有毒株對(duì)豬無(wú)致病力或較弱。牛體試驗(yàn)用病毒液接種3頭牛，每頭牛2mL，接種牛舌背面皮內(nèi)共計(jì)20點(diǎn)，每點(diǎn)0. lmL，逐日觀察4日。接著每頭牛肌肉注射病毒液6mL，繼續(xù)觀察6日，所有牛未出現(xiàn)ロ蹄疫特征性臨床癥狀。2.病毒液滅活及阻斷向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，調(diào)節(jié)使其終濃度為0. 002mol/L。將病毒液的溫度保持在30±1°C，連續(xù)滅活28小吋。滅活結(jié)束后，立即在滅活病毒液中加入過(guò)濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度為2%，并加入硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%，充分混勻，取樣后迅速置4°C保存，同時(shí)抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。3.滅活病毒液的濃縮當(dāng)使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)需濃縮抗原，懸浮培養(yǎng)時(shí)不需濃縮。利用PELLIC0N盒式超濾系統(tǒng)(100K NMWL MILLIP0R膜堆)，對(duì)滅活病毒液濃縮3倍。4. 146s含量的測(cè)定同病毒含量測(cè)定中146S含量測(cè)定，經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中ロ蹄疫 嵌合病毒146S含量較低,所有病毒146S含量可達(dá)到0. 3 1. 3 ii g。懸浮培養(yǎng)中病毒146S的含量可達(dá)3.0 7. Oii g。5.乳化通過(guò)濃縮或稀釋將ロ蹄疫滅活抗原中146S含量定量至2. 0 3. Oii g/頭份，疫苗乳化用油佐劑為Montanide ISA 206 (法國(guó)SEPPIC公司產(chǎn)品)。疫苗配制比例為，滅活抗原佐劑=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。四、成品疫苗檢驗(yàn)1.物理性狀檢驗(yàn)外觀淡粉紅色略帶粘滯性乳狀液。劑型用清潔吸管吸取少許滴于清潔冷水表面,成云霧狀擴(kuò)散,為水包油包水(W/0/W)劑型。粘度用ImL吸管(下口內(nèi)徑為1. 2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其自然流出，記錄流出0. 4ml疫苗所需時(shí)間為3秒，檢驗(yàn)合格。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，管底析出的水相為0. 03mL,符合規(guī)定。2.無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)；3.安全檢驗(yàn)( I)豚鼠和小白鼠檢驗(yàn)每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗2. OmL,同時(shí)用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,觀察7天。接種豚鼠和小白鼠無(wú)局部反應(yīng)和全身不良反應(yīng)，均健活，判定疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物安全。用本動(dòng)物檢驗(yàn)根據(jù)疫苗接種對(duì)象的不同，決定選擇豬或(和)牛。(2)豬體試驗(yàn)每批疫苗均接種2頭仔豬，每頭耳根后兩側(cè)肌肉分點(diǎn)注射2頭份(4mL),連續(xù)觀察14天，結(jié)果均未出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)，所有仔豬均健活，證明疫苗對(duì)仔豬安全。牛體試驗(yàn)用疫苗接種3頭牛，每頭牛2mL，接種牛舌背面皮內(nèi)共計(jì)20點(diǎn)，每點(diǎn)0. lmL，逐日觀察4日。接著每頭牛肌肉注射疫苗6mL，繼續(xù)觀察6日，所有牛未出現(xiàn)ロ蹄疫癥狀和不良反應(yīng)。4.效カ檢驗(yàn)首先測(cè)定疫苗破乳后ロ蹄疫病毒146S含量。同時(shí)通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)定疫苗的ro5Q，根據(jù)免疫對(duì)象不同，分為豬苗和牛苗。(I)疫苗破乳及146S含量測(cè)定在疫苗中加入等量的三氯こ烯或三氯甲烷，震蕩混勻，12000r/min離心取上清，然后按照146S含量測(cè)定步驟操作，疫苗中146S含量達(dá)1.7 2.8iig/ 頭份。(2)豬苗效檢試驗(yàn)用疫苗免疫40kg左右健康豬15頭，分為3個(gè)劑量組，每組5頭，分別為I頭份(2mL)，1/3頭份(0. 67mL), 1/9頭份(0. 22mL)劑量組。免疫28天后，用檢驗(yàn)用毒進(jìn)行攻毒，每個(gè)攻毒組各設(shè)對(duì)照豬3頭。每頭豬耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠組織毒，連續(xù)觀察10天，對(duì)照組均應(yīng)在I蹄以上出現(xiàn)臨床癥狀。按Karbeir法計(jì)算被檢疫苗的 PD5tl。(3)牛苗效檢試驗(yàn)每批疫苗用試驗(yàn)牛15頭，分為3組，每組5頭，將待檢疫苗按 使用劑量為2mL/頭份，分成I頭份、1/3頭份、1/9頭份3個(gè)劑量組，每ー劑量組分別于頸部肌肉注射5頭牛。接種21日后，連同對(duì)照組2頭，進(jìn)行攻毒，每頭牛舌上表面內(nèi)側(cè)分兩點(diǎn)皮內(nèi)注射牛ロ蹄疫A型病毒強(qiáng)毒，每點(diǎn)0.1mL (共0.2mL，含IO4ID5tlX攻毒后連續(xù)觀察10日。對(duì)照牛均應(yīng)至少3蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫牛僅在接種舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍，其它部位無(wú)病變時(shí)判為保護(hù)。除舌面以外任一部位出現(xiàn)典型ロ蹄疫水泡或潰瘍時(shí)判為不保護(hù)。根據(jù)免疫牛的保護(hù)數(shù)，按Khrbei 法計(jì)算被檢疫苗的ro5Q。


圖1 ロ蹄疫CHA90全長(zhǎng)cDNA感染性克隆示意2缺失L蛋白的ロ蹄疫病毒CHA90感染性克隆示意3 ロ蹄疫滅活疫苗安全種毒載體感染性克隆(p43-CHA90-LL-Vector)示意4 ロ蹄疫嵌合病毒示意圖，P1’可為A型或Asia I型或0型任意毒株的Pl置換區(qū)本發(fā)明涉及的微生物資源本發(fā)明構(gòu)建獲得的陽(yáng)性克隆命名為p43-CHA90-LL-Vector，該重組載體p43-CHA90-LL-Vector已轉(zhuǎn)入到大腸埃希氏菌中，被命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)p43-CHA90-LL-Vector株，該菌株于2012年11月29日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6898。本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明涉及ー種ロ蹄疫滅活疫苗安全種毒載體及應(yīng)用，即在該載體基礎(chǔ)上構(gòu)建不同血清型的ロ蹄疫滅活疫苗安全生產(chǎn)種毒。本發(fā)明中構(gòu)建的嵌合病毒既保留了經(jīng)典疫苗毒株細(xì)胞適應(yīng)性良好的優(yōu)點(diǎn)，又能通過(guò)插入流行毒株的結(jié)構(gòu)蛋白克服抗原匹配性不高的缺點(diǎn)，可快速拯救病毒進(jìn)行ロ蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)；以本載體構(gòu)建的A型或Asia I型或0型不同毒株嵌合病毒為弱毒，均具有良好的生物安全性，因病毒中缺失了 L蛋白，在自然條件下不發(fā)生毒カ返強(qiáng)，并且病毒對(duì)乳鼠、豬或牛的致病力大大降低或者無(wú)致病性。安全性高，不會(huì)引起ロ蹄疫疫情的發(fā)生，非常具有實(shí)用價(jià)值。實(shí)施例實(shí)施例1
—A型ロ蹄疫嵌合病毒的構(gòu)建及疫苗生產(chǎn)一、A型ロ蹄疫嵌合病毒的構(gòu)建1. A型ロ蹄疫嵌合病毒感染性克隆的構(gòu)建通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得A型(引物No. 12，No. 13)(上海英駿生物技術(shù)有限公司)A/HuBWH/CHA/2009株的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1 )，同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)Ssp I , SgrA I (序列18)，經(jīng)克隆測(cè)序，篩選陽(yáng)性菌落，細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，以Ssp I /SgrA I雙酶切連接至p43-CHA90-LL-Vector中，獲得A型嵌合病毒cDNA感染性克隆。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的體外轉(zhuǎn)錄將A型嵌合病毒cDNA感染性克隆質(zhì)粒線性化處理，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成RNA。3.病毒拯救通過(guò)電轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將A型嵌合病毒RNA轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，成功拯救出相應(yīng)病毒。轉(zhuǎn)染后48 72小時(shí)可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞產(chǎn)生病變(CPE)，經(jīng)過(guò)傳 代觀察CPE，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定病毒(A-WH-LL)拯救成功。4.病毒傳代將轉(zhuǎn)染RNA培養(yǎng)48 72小時(shí)、BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)95%CPE后收獲病毒液，按照5 10%的接毒量接種生生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞。5.病毒檢測(cè)通過(guò)PCR和雙夾心ELISA方法檢測(cè)均為A型ロ蹄疫陽(yáng)性。PCR產(chǎn)物測(cè)序?yàn)锳型ロ蹄疫嵌合病毒。ニ、A型ロ蹄疫嵌合病毒滅活疫苗的生產(chǎn)1.病毒的繁殖取8 12代的生產(chǎn)種子批病毒液，接種5L發(fā)酵罐，通過(guò)逐級(jí)放大至1000L，待懸浮BHK-21細(xì)胞病變達(dá)到95%以上時(shí)收獲病毒，病毒液凍存于_20°C待檢。2 制苗毒液的檢驗(yàn)(I)無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)；(2)支原體檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄49頁(yè)進(jìn)行，無(wú)支原體生長(zhǎng)；(3)病毒含量測(cè)定(測(cè)定TCID5tl):將病毒液10倍系列稀釋至10_8，分別接種生長(zhǎng)良好的96孔BHK-21細(xì)胞，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，每孔接種IOOii L，放置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小吋，觀察細(xì)胞病變并計(jì)算TCID5tlt5 A型ロ蹄疫嵌合病毒毒價(jià)達(dá)到105 8TCID5(l/mL。3.病毒液滅活及阻斷向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，調(diào)節(jié)使其終濃度為0. 002mol/L。將病毒液的溫度保持在30±1°C，連續(xù)滅活28小吋。滅活結(jié)束后，立即在滅活病毒液中加入過(guò)濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度為2%，并加入硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%，充分混勻，取樣后迅速置4°C保存，同時(shí)抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。4. 146s含量的測(cè)定取滅活抗原50ml在4°C，8000r/min條件下離心30min，以除去滅活抗原液中殘留的細(xì)胞碎片；取上清液，加入等體積三氯こ烯，充分混勻后，4°C 8000r/min離心30min。離心后，取出上清液，裝入超速離心管中，4°C 40000r/min離心3. 5h。離心后，棄上清液，往每只離心管內(nèi)加入0.5ml TNE緩沖液(pH 7. 6)，用超聲波處理充分分散沉淀物。第2天取出濃縮的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度頂部，然后4°C 35000r/min離心2. 5h，離心結(jié)束后，使用蠕動(dòng)泵從離心管底部開(kāi)始抽吸液體，每約0. 5ml收集一管，經(jīng)紫外分光光度測(cè)定OD 259 值，計(jì)算45%-35%間蔗糖梯度處最高峰值的146S抗原含量。經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量較低,所有病毒146S含量為0. 3 1. 3 ii g。而懸浮培養(yǎng)可以大大提高病毒中146S的含量，可達(dá)3. O 7. Oiig。5.乳化疫苗乳化用油佐劑為Montanide ISA 206 (法國(guó)SEPPIC公司產(chǎn)品)。疫苗配制比例為，滅活抗原佐劑=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的檢驗(yàn)L物理性狀檢驗(yàn)外觀淡粉紅色略帶粘滯性乳狀液。劑型用清潔吸管吸取少許滴于清潔冷水表面，成云霧狀擴(kuò)散，為水包油包水(W/0/W)劑型。粘度用ImL吸管(下口內(nèi)徑為1. 2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗 lmL，令其自然流出，記錄流出0. 4ml疫苗所需時(shí)間為3秒，檢驗(yàn)合格。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，管底析出的水相為0. 03mL,符合規(guī)定。2.無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)；3.安全檢驗(yàn)豚鼠和小白鼠檢驗(yàn)每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗
2.OmL,同時(shí)用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,觀察7天。接種豚鼠和小白鼠無(wú)局部反應(yīng)和全身不良反應(yīng)，均健活，判定疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物安全。牛體試驗(yàn)用疫苗接種3頭牛，每頭牛2mL，接種牛舌背面皮內(nèi)共計(jì)20點(diǎn)，每點(diǎn)0. lmL，逐日觀察4日。接著每頭牛肌肉注射疫苗6mL，繼續(xù)觀察6日，所有牛未出現(xiàn)ロ蹄疫癥狀和不良反應(yīng)。4 效カ檢驗(yàn)每批疫苗用試驗(yàn)牛15頭，分為3組，每組5頭，將待檢疫苗按使用劑量為2mL/頭份，分成I頭份、1/3頭份、1/9頭份3個(gè)劑量組，每ー劑量組分別于頸部肌肉注射5頭牛。接種21日后，連同對(duì)照組2頭，進(jìn)行攻毒，每頭牛舌上表面內(nèi)側(cè)分兩點(diǎn)皮內(nèi)注射牛ロ蹄疫A型病毒強(qiáng)毒，每點(diǎn)0.1mL (共0. 2mL，含IO4ID5tlX攻毒后連續(xù)觀察10日。對(duì)照牛均應(yīng)至少3蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫牛僅在舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍，其它部位無(wú)病變時(shí)判為保護(hù)。除舌面以外任一部位出現(xiàn)典型ロ蹄疫水泡或潰瘍時(shí)判為不保護(hù)。經(jīng)KArber 法計(jì)算被檢疫苗的PD50 為 10. 05PD50/ 頭份。實(shí)施例2——0型ロ蹄疫Cathay拓?fù)湫颓逗喜《镜臉?gòu)建及疫苗生產(chǎn)—、0型ロ蹄疫Cathay拓?fù)湫颓逗喜《镜臉?gòu)建1.0型ロ蹄疫Cathay拓?fù)湫颓逗喜《靖腥拘钥寺〉臉?gòu)建通過(guò)PCR擴(kuò)增(No. 16，No. 17)(上海英駿生物技術(shù)有限公司)獲得Cathay拓?fù)湫托仑i毒II譜系0/GX/09-7株的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1)，同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)Ssp1、SgrA I (序列21)，經(jīng)克隆測(cè)序，篩選陽(yáng)性菌落，細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，以Ssp I /SgrA I雙酶切連接至p43-CHA90-LL-Vector中，獲得0型ロ蹄疫Cathay拓?fù)湫颓逗喜《綾DNA感染性克隆。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的體外轉(zhuǎn)錄將0型ロ蹄疫Cathay拓?fù)湫颓逗喜《綾DNA感染性克隆質(zhì)粒線性化處理,通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成RNA。3.病毒拯救通過(guò)電轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將0型Cathay拓?fù)湫颓逗喜《綬NA轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，成功拯救出相應(yīng)病毒。轉(zhuǎn)染后48 72小時(shí)可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞產(chǎn)生病變(CPE)，經(jīng)過(guò)傳代觀察CPE，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定病毒(O-GX-LL)拯救成功。4.病毒傳代將轉(zhuǎn)染RNA培養(yǎng)48 72小時(shí)、BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)95%CPE后收獲病毒液，按照5 10%的接毒量接種生生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞。5.病毒檢測(cè)通過(guò)PCR和雙夾心ELISA方法檢測(cè)均為0型ロ蹄疫陽(yáng)性。PCR產(chǎn)物測(cè)序?yàn)?型ロ蹄疫Cathay拓?fù)湫?_GX_LL嵌合病毒。ニ、0型ロ蹄疫Cathay拓?fù)湫颓逗喜《緶缁钜呙缟a(chǎn)1.病毒繁殖取8 12代的生產(chǎn)種子批病毒液，接種5L發(fā)酵罐，通過(guò)逐級(jí)放大至 1000L，待懸浮BHK-21細(xì)胞病變達(dá)到95%以上時(shí)收獲病毒，病毒液凍存于_20°C待檢。2.制苗毒液的檢驗(yàn)(I)無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)；(2)支原體檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄49頁(yè)進(jìn)行，無(wú)支原體生長(zhǎng)；(3)病毒含量測(cè)定(測(cè)定TCID5tl):將病毒液10倍系列稀釋至10_8，分別接種生長(zhǎng)良好的96孔BHK-21細(xì)胞，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，每孔接種100 u L，放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小吋，觀察細(xì)胞病變并計(jì)算TCID5tlt5 0型ロ蹄疫Cathay拓?fù)湫颓逗喜《径緝r(jià)達(dá)到106 0TCID50/mLo(4)病毒液滅活及阻斷向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，調(diào)節(jié)使其終濃度為0. 002mol/L。將病毒液的溫度保持在30±1°C，連續(xù)滅活28小吋。滅活結(jié)束后，立即在滅活病毒液中加入過(guò)濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度為2%，并加入硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%，充分混勻，取樣后迅速置4°C保存，同時(shí)抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。(5) 146s含量的測(cè)定取滅活抗原50ml在4°C,8000r/min條件下離心30min,以除去滅活抗原液中殘留的細(xì)胞碎片；取上清液，加入等體積三氯こ烯，充分混勻后，4°C8000r/min離心30min。離心后，取出上清液，裝入超速離心管中，4°C 40000r/min離心
3.5h。離心后，棄上清液，往每只離心管內(nèi)加入0.5ml TNE緩沖液(pH 7. 6)，用超聲波處理充分分散沉淀物。第2天取出濃縮的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度頂部，然后4°C 35000r/min離心2. 5h，離心結(jié)束后，使用蠕動(dòng)泵從離心管底部開(kāi)始抽吸液體，每約0. 5ml收集一管，經(jīng)紫外分光光度測(cè)定OD259nm值，計(jì)算45%-35%間蔗糖梯度處最高峰值的146S抗原含量。經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量較低,所有病毒146S含量為0. 3 1. 3 ii g。而懸浮培養(yǎng)可以大大提高病毒中146S的含量,可達(dá)3. 0 5. 0 ii g。(6)乳化疫苗乳化用油佐劑為Montanide ISA 206 (法國(guó)SEPPIC公司產(chǎn)品)。疫苗配制比例為，滅活抗原佐劑=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的檢驗(yàn)I 物理性狀檢驗(yàn)外觀淡粉紅色略帶粘滯性乳狀液。劑型用清潔吸管吸取少許滴于清潔冷水表面，成云霧狀擴(kuò)散，為水包油包水(W/0/W)劑型。粘度用ImL吸管(下口內(nèi)徑為1. 2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其自然流出，記錄流出0. 4ml疫苗所需時(shí)間為3秒，檢驗(yàn)合格。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，管底析出的水相為o. 03mL,符合規(guī)定。2.無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)；3.安全檢驗(yàn)豚鼠和小白鼠檢驗(yàn)每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗
2.OmL,同時(shí)用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,觀察7天。接種豚鼠和小白鼠無(wú)局部反應(yīng)和全身不良反應(yīng)，均健活，判定疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物安全。豬體試驗(yàn)每批疫苗均接種2頭仔豬，每 頭耳根后兩側(cè)肌肉分點(diǎn)注射2頭份(4mL)，連續(xù)觀察14天，結(jié)果均未出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)，所有仔豬均健活，表明疫苗對(duì)仔豬安全。4 效カ檢驗(yàn)用疫苗免疫40kg左右健康豬15頭，分為3個(gè)劑量組，每組5頭，分別為I頭份(2mL), 1/3頭份(0. 67mL), 1/9頭份(0. 22mL)劑量組。免疫28天后，用檢驗(yàn)用毒進(jìn)行攻毒，每個(gè)攻毒組各設(shè)對(duì)照豬3頭。每頭豬耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠組織毒，連續(xù)觀察10天，對(duì)照組出現(xiàn)ロ蹄疫臨床癥狀。按FOhter法計(jì)算被檢疫苗的I3D5tl為8. 06PD50/頭份。實(shí)施例3——0型ロ蹄疫M(jìn)E-SA拓?fù)湫颓逗喜《镜臉?gòu)建及疫苗生產(chǎn)一、0型ロ蹄疫M(jìn)E-SA拓?fù)湫头簛喍局昵逗喜《镜臉?gòu)建1.0型ロ蹄疫M(jìn)E-SA拓?fù)湫颓逗喜《靖腥拘钥寺〉臉?gòu)建通過(guò)PCR擴(kuò)增(No. 16，No. 17)(上海英駿生物技術(shù)有限公司)獲得ME-SA拓?fù)湫头簛喿V系0/HB/07-4株的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1)，同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)Ssp I ,SgrA I (序列20)，經(jīng)克隆測(cè)序，篩選陽(yáng)性菌落，細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，以Ssp I /SgrA I雙酶切連接至p43-CHA90-LL-Vector中，獲得0型ロ蹄疫M(jìn)E-SA拓?fù)湫头簛喿V系嵌合病毒cDNA感染性克隆。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的體外轉(zhuǎn)錄將0型ロ蹄疫M(jìn)E-SA拓?fù)湫颓逗喜《綾DNA感染性克隆質(zhì)粒線性化處理,通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成RNA。3.病毒拯救通過(guò)電轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將0型ME-SA拓?fù)湫颓逗喜《綬NA轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，成功拯救出相應(yīng)病毒。轉(zhuǎn)染后48 72小時(shí)可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞產(chǎn)生病變(CPE)，經(jīng)過(guò)傳代觀察CPE，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定病毒(O-HB-LL)拯救成功。4.病毒傳代將轉(zhuǎn)染RNA培養(yǎng)48 72小時(shí)、BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)95%CPE后收獲病毒液，按照5 10%的接毒量接種生生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞。5.病毒檢測(cè)通過(guò)PCR和雙夾心ELISA方法檢測(cè)均為0型ロ蹄疫陽(yáng)性。PCR產(chǎn)物測(cè)序?yàn)?型ロ蹄疫M(jìn)E-SA拓?fù)湫蚈-HB-LL嵌合病毒。ニ、0型ロ蹄疫M(jìn)E-SA拓?fù)湫颓逗喜《緶缁钜呙缟a(chǎn)1.病毒繁殖取8 12代的生產(chǎn)種子批病毒液，接種5L發(fā)酵罐，通過(guò)逐級(jí)放大至1000L，待懸浮BHK-21細(xì)胞病變達(dá)到95%以上時(shí)收獲病毒，病毒液凍存于_20°C待檢。2.制苗毒液的檢驗(yàn)(I)無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典ニ零一零年版三部中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010，本發(fā)明稱(chēng)《中國(guó)獸藥典》)附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉囷生長(zhǎng)；(2)支原體檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄49頁(yè)進(jìn)行，無(wú)支原體生長(zhǎng)；
(3)病毒含量測(cè)定(測(cè)定TCID5tl):將病毒液10倍系列稀釋至10_8，分別接種生長(zhǎng)良好的96孔BHK-21細(xì)胞，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，每孔接種100 u L，放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小吋，觀察細(xì)胞病變并計(jì)算TCID5tlt5 0型ロ蹄疫M(jìn)E-SA拓?fù)湫颓逗喜《径緝r(jià)達(dá)到106 0TCID50/mLo(4)病毒液滅活及阻斷向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，調(diào)節(jié)使其終濃度為0. 002mol/L。將病毒液的溫度保持在30±1°C，連續(xù)滅活28小吋。滅活結(jié)束后，立即在滅活病毒液中加入過(guò)濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度為2%，并加入硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%，充分混勻，取樣后迅速置4°C保存，同時(shí)抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。(5) 146s含量的測(cè)定取滅活抗原50ml在4°C,8000r/min條件下離心30min,以除去滅活抗原液中殘留的細(xì)胞碎片；取上清液，加入等體積三氯こ烯，充分混勻后，4°C 8000r/min離心30min。離心后，取出上清液，裝入超速離心管中，4°C 40000r/min離心
3.5h。離心后，棄上清液，往每只離心管內(nèi)加入0.5ml TNE緩沖液(pH 7. 6)，用超聲波處理充分分散沉淀物。第2天取出濃縮的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度頂部，然后4°C 35000r/min離心2. 5h，離心結(jié)束后，使用蠕動(dòng)泵從離心管底部開(kāi)始抽吸液體，每約0. 5ml收集一管，經(jīng)紫外分光光度測(cè)定OD259nm值，計(jì)算45% 35%間蔗糖梯度處最高峰值的146S抗原含量。經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量較低,所有病毒146S含量為0. 3 1. g。而懸浮培養(yǎng)可以大大提高病毒中146S的含量,可達(dá)3. 0 7. Oii g。(6)乳化疫苗乳化用油佐劑為Montanide ISA 206 (法國(guó)SEPPIC公司產(chǎn)品)。疫苗配制比例為，滅活抗原佐劑=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的檢驗(yàn)I 物理性狀檢驗(yàn)外觀淡粉紅色略帶粘滯性乳狀液。劑型用清潔吸管吸取少許滴于清潔冷水表面，成云霧狀擴(kuò)散，為水包油包水(W/0/W)劑型。粘度用ImL吸管(下口內(nèi)徑為1. 2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗ImL,令其自然流出，記錄流出0.4ml疫苗所需時(shí)間為3秒，檢驗(yàn)合格。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，管底析出的水相為0. 03mL,符合規(guī)定。2.無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)；3.安全檢驗(yàn)豚鼠和小白鼠檢驗(yàn)每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗
2.OmL，同時(shí)用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL，觀察7天。接種豚鼠和小白鼠無(wú)局部反應(yīng)和全身不良反應(yīng)，均健活，判定疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物安全。豬體試驗(yàn)每批疫苗均接種2頭仔豬，每頭耳根后兩側(cè)肌肉分點(diǎn)注射2頭份(4mL)，連續(xù)觀察14天，結(jié)果均未出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)，所有仔豬均健活，表明疫苗對(duì)仔豬安全。4 效カ檢驗(yàn)用疫苗免疫40kg左右健康豬15頭，分為3個(gè)劑量組，每組5頭，分別為I頭份(2mL), 1/3頭份(0. 67mL), 1/9頭份(0. 22mL)劑量組。免疫28天后，用檢驗(yàn)用毒進(jìn)行攻毒，每個(gè)攻毒組各設(shè)對(duì)照豬3頭。每頭豬耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠組織毒，連續(xù)觀察10天，對(duì)照組出現(xiàn)ロ蹄疫臨床癥狀。按Karbei 法計(jì)算被檢疫苗的I3D5tl為12. 5IPD5tl/頭份。實(shí)施例4——0型ロ蹄疫SEA拓?fù)湫颓逗喜《镜臉?gòu)建及疫苗生產(chǎn)一、0型ロ蹄疫SEA拓?fù)湫颓逗喜《镜臉?gòu)建1.0型ロ蹄疫SEA拓?fù)湫颓逗喜《靖腥拘钥寺〉臉?gòu)建通過(guò)PCR擴(kuò)增(No. 16，No. 17)(上海英駿生物技術(shù)有限公司)獲得SEA拓?fù)湫途挼?8譜系0/XJ/10-11株的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1)，同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)Ssp I ,SgrA I (序列22)，經(jīng)克隆測(cè)序，篩選陽(yáng)性菌落，細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，以Ssp I /SgrA I雙酶切連接至p43-CHA90-LL-Vector中，獲得0型ロ蹄疫SEA拓?fù)湫颓逗喜《綾DNA感染性克隆。 2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的體外轉(zhuǎn)錄將0型ロ蹄疫SEA拓?fù)湫颓逗喜《綾DNA感染性克隆質(zhì)粒線性化處理，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成RNA。3.病毒拯救通過(guò)電轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將0型SEA拓?fù)湫颓逗喜《綬NA轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，成功拯救出相應(yīng)病毒。轉(zhuǎn)染后48 72小時(shí)可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞產(chǎn)生病變(CPE)，經(jīng)過(guò)傳代觀察CPE，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定病毒(O-XJ-LL)拯救成功。4.病毒傳代將轉(zhuǎn)染RNA培養(yǎng)48 72小時(shí)、BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)95%CPE后收獲病毒液，按照5 10%的接毒量接種生生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞。5.病毒檢測(cè)通過(guò)PCR和雙夾心ELISA方法檢測(cè)均為0型ロ蹄疫陽(yáng)性。PCR產(chǎn)物測(cè)序?yàn)?型ロ蹄疫SEA拓?fù)湫蚈-XJ-LL嵌合病毒。ニ、0型ロ蹄疫SEA拓?fù)湫颓逗喜《緶缁钜呙缟a(chǎn)1.病毒繁殖取8 12代的生產(chǎn)種子批病毒液，接種5L發(fā)酵罐，通過(guò)逐級(jí)放大至1000L，待懸浮BHK-21細(xì)胞病變達(dá)到95%以上時(shí)收獲病毒，病毒液凍存于_20°C待檢。2.制苗毒液的檢驗(yàn)(I)無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典ニ零一零年版三部中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010，本發(fā)明稱(chēng)《中國(guó)獸藥典》)附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉囷生長(zhǎng)；(2)支原體檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄49頁(yè)進(jìn)行，無(wú)支原體生長(zhǎng)；(3)病毒含量測(cè)定(測(cè)定TCID5tl):將病毒液10倍系列稀釋至10_8，分別接種生長(zhǎng)良好的96孔BHK-21細(xì)胞，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，每孔接種100 u L，放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小吋，觀察細(xì)胞病變并計(jì)算TCID5tlt5 0型ロ蹄疫SEA拓?fù)湫颓逗喜《径緝r(jià)達(dá)到106 0TCID50/mLo(4)病毒液滅活及阻斷向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，調(diào)節(jié)使其終濃度為0. 002mol/L。將病毒液的溫度保持在30±1°C，連續(xù)滅活28小吋。滅活結(jié)束后，立即在滅活病毒液中加入過(guò)濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度為2%，并加入硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%，充分混勻，取樣后迅速置4°C保存，同時(shí)抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。(5) 146s含量的測(cè)定取滅活抗原50ml在4°C,8000r/min條件下離心30min,以除去滅活抗原液中殘留的細(xì)胞碎片；取上清液，加入等體積三氯こ烯，充分混勻后，4°C8000r/min離心30min。離心后，取出上清液，裝入超速離心管中，4°C 40000r/min離心
3.5h。離心后，棄上清液，往每只離心管內(nèi)加入0.5ml TNE緩沖液(pH 7. 6)，用超聲波處理充分分散沉淀物。第2天取出濃縮的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度頂部，然后4°C 35000r/min離心2. 5h，離心結(jié)束后，使用蠕動(dòng)泵從離心管底部開(kāi)始抽吸液體，每約0. 5ml收集一管，經(jīng)紫外分光光度測(cè)定OD259nm值，計(jì)算45%-35%間蔗糖梯度處最高峰值的146S抗原含量。經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量較低,所有病毒146S含量為0. 3 1. 3 ii g。而懸浮培養(yǎng)可以大大提高病毒中146S的含量,可達(dá)3. 0 5. 0 ii g。(6)乳化疫苗乳化用油佐劑為Montanide ISA 206 (法國(guó)SEPPIC公司產(chǎn)品)。疫苗配制比例為，滅活抗原佐劑=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的檢驗(yàn)1.物理性狀檢驗(yàn)外觀淡粉紅色略帶粘滯性乳狀液。劑型用清潔吸管吸取少許滴于清潔冷水表面，成云霧狀擴(kuò)散，為水包油包水(W/0/W)劑型。粘度用ImL吸管(下口內(nèi)徑為1. 2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其自然流出，記錄流出0. 4ml疫苗所需時(shí)間為3秒，檢驗(yàn)合格。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，管底析出的水相為0. 03mL,符合規(guī)定。2.無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)；3.安全檢驗(yàn)豚鼠和小白鼠檢驗(yàn)每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗
2.OmL,同時(shí)用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,觀察7天。接種豚鼠和小白鼠無(wú)局部反應(yīng)和全身不良反應(yīng)，均健活，判定疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物安全。豬體試驗(yàn)每批疫苗均接種2頭仔豬，每頭耳根后兩側(cè)肌肉分點(diǎn)注射2頭份(4mL)，連續(xù)觀察14天，結(jié)果均未出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)，所有仔豬均健活，表明疫苗對(duì)仔豬安全。4 效カ檢驗(yàn)用疫苗免疫40kg左右健康豬15頭，分為3個(gè)劑量組，每組5頭，分別為I頭份(2mL), 1/3頭份(0. 67mL), 1/9頭份(0. 22mL)劑量組。免疫28天后，用檢驗(yàn)用毒進(jìn)行攻毒，每個(gè)攻毒組各設(shè)對(duì)照豬3頭。每頭豬耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠組織毒，連續(xù)觀察10天，對(duì)照組出現(xiàn)ロ蹄疫臨床癥狀。按KSrber法計(jì)算被檢疫苗的I3D5tl為8. 06PD50/頭份。實(shí)施例5——Asia I ロ蹄疫嵌合病毒的構(gòu)建及疫苗生產(chǎn)一、Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒的構(gòu)建 l.Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒感染性克隆的構(gòu)建通過(guò)PCR擴(kuò)增(No. 14，No. 15)(上海英駿生物技術(shù)有限公司)獲得AsiaI型江蘇株(JSL)的Pl基因(包括VP2、VP3、VPl),同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)Ssp I , SgrA I (序列19)，經(jīng)克隆測(cè)序，篩選陽(yáng)性菌落，細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，以Ssp I /SgrA I雙酶切連接至p43-CHA90-LL-Vector中，獲得Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒cDNA感染性克隆。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的體外轉(zhuǎn)錄將Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒cDNA感染性克隆質(zhì)粒線性化處理，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成RNA。
3.病毒拯救通過(guò)電轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將Asia I型嵌合病毒RNA轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，成功拯救出相應(yīng)病毒。轉(zhuǎn)染后48 72小時(shí)可引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞產(chǎn)生病變(CPE)，經(jīng)過(guò)傳代觀察CPE，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定病毒(Asia1-JSL-LL)拯救成功。4.病毒傳代將轉(zhuǎn)染RNA培養(yǎng)48 72小時(shí)、BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)95%CPE后收獲病毒液，按照5 10%的接毒量接種生生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞。5.病毒檢測(cè)通過(guò)PCR和雙夾心ELISA方法檢測(cè)均為Asia I型ロ蹄疫陽(yáng)性。PCR產(chǎn)物測(cè)序?yàn)锳sia I型ロ蹄疫嵌合病毒。ニ、Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒滅活疫苗生產(chǎn)1.病毒繁殖取8 12代的生產(chǎn)種子批病毒液，接種5L發(fā)酵罐，通過(guò)逐級(jí)放大至 1000L，待懸浮BHK-21細(xì)胞病變達(dá)到95%以上時(shí)收獲病毒，病毒液凍存于_20°C待檢。2.制苗毒液的檢驗(yàn)(I)無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典ニ零一零年版三部中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010，本發(fā)明稱(chēng)《中國(guó)獸藥典》)附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉囷生長(zhǎng)；(2)支原體檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄49頁(yè)進(jìn)行，無(wú)支原體生長(zhǎng)；(3)病毒含量測(cè)定(測(cè)定TCID5tl):將病毒液10倍系列稀釋至10_8，分別接種生長(zhǎng)良好的96孔BHK-21細(xì)胞，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，每孔接種100 u L，放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小吋，觀察細(xì)胞病變并計(jì)算TCID5tlt5 Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒毒價(jià)達(dá)到IO6 tlTCID5ci/
mLo(4)病毒液滅活及阻斷向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液,調(diào)節(jié)使其終濃度為0. 002mol/L。將病毒液的溫度保持在30±1°C，連續(xù)滅活28小吋。滅活結(jié)束后，立即在滅活病毒液中加入過(guò)濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度為2%，并加入硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%，充分混勻，取樣后迅速置4°C保存，同時(shí)抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。(5) 146s含量的測(cè)定取滅活抗原50ml在4°C,8000r/min條件下離心30min,以除去滅活抗原液中殘留的細(xì)胞碎片；取上清液，加入等體積三氯こ烯，充分混勻后，4°C8000r/min離心30min。離心后，取出上清液，裝入超速離心管中，4°C 40000r/min離心
3.5h。離心后，棄上清液，往每只離心管內(nèi)加入0.5ml TNE緩沖液(pH 7. 6)，用超聲波處理充分分散沉淀物。第2天取出濃縮的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度頂部，然后4°C 35000r/min離心2. 5h，離心結(jié)束后，使用蠕動(dòng)泵從離心管底部開(kāi)始抽吸液體，每約0. 5ml收集一管，經(jīng)紫外分光光度測(cè)定OD259nm值，計(jì)算45%-35%間蔗糖梯度處最高峰值的146S抗原含量。經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量較低,所有病毒146S含量為0. 3 1-3 ii go而懸浮培養(yǎng)可以大大提高病毒中146S的含量,可達(dá)3. 0 7. Oii g。(6)乳化疫苗乳化用油佐劑為Montanide ISA 206 (法國(guó)SEPPIC公司產(chǎn)品)。疫苗配制比例為，滅活抗原佐劑=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的檢驗(yàn)1.物理性狀檢驗(yàn)外觀淡粉紅色略帶粘滯性乳狀液。劑型用清潔吸管吸取少許滴于清潔冷水表面，成云霧狀擴(kuò)散，為水包油包水(W/0/W)劑型。
粘度用ImL吸管(下口內(nèi)徑為1. 2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其自然流出，記錄流出0. 4ml疫苗所需時(shí)間為3秒，檢驗(yàn)合格。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，3000r/min離心15min，管底析出的水相為0. 03mL,符合規(guī)定。2.無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中國(guó)獸藥典》附錄42頁(yè)進(jìn)行，無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)；3.安全檢驗(yàn)豚鼠和小白鼠檢驗(yàn)每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗2. OmL,同時(shí)用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,觀察7天。接種豚鼠和小白鼠無(wú)局部反應(yīng)和全身不良反應(yīng)，均健活，判定疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物安全。豬體試驗(yàn)每批疫苗均接種2頭仔豬，每頭耳根后兩側(cè)肌肉分點(diǎn)注射2頭份(4mL),連續(xù)觀察14天，結(jié)果均未出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)，所有仔豬均健活，表明疫苗對(duì) 仔豬安全。4.效カ檢驗(yàn)用疫苗免疫40kg左右健康豬15頭，分為3個(gè)劑量組，每組5頭，分別為I頭份(2mL), 1/3頭份(0. 67mL), 1/9頭份(0. 22mL)劑量組。免疫28天后，用檢驗(yàn)用毒進(jìn)行攻毒，每個(gè)攻毒組各設(shè)對(duì)照豬3頭。每頭豬耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠組織毒，連續(xù)觀察10天，對(duì)照組出現(xiàn)ロ蹄疫臨床癥狀。按Kjjrber法計(jì)算被檢疫苗的I3D5tl為15. 59PD50/頭份。
權(quán)利要求
1.口蹄疫病毒重組載體的構(gòu)建，其特征在于該載體的構(gòu)建包括如下步驟 (1)口蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的構(gòu)建是以口蹄疫病毒CHA90全長(zhǎng)感染性克隆為基礎(chǔ)，使用序列I和序列2所述一對(duì)引物及序列4和序列5所述一對(duì)引物通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增刪除Lb基因，將PCR產(chǎn)物(序列7)克隆至pMDlS-T載體(Takara產(chǎn)品)，測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，以Xba I /Not I酶切連接到CHA90全長(zhǎng)感染性克隆中構(gòu)建而成，命名為P43-CHA90-LL ； (2)結(jié)構(gòu)蛋白基因的刪除及酶切位點(diǎn)的引入是以CHA90全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒為模板，使用序列8和序列9所述一對(duì)引物及序列10和序列11通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增，刪除結(jié)構(gòu)蛋白Pl大部分基因(VP2、VP3、VPl )，同時(shí)通過(guò)同義突變引入酶切位點(diǎn)Ssp1、SgrA I，將PCR產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體(Takara產(chǎn)品)，測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，以Kpn I酶切連接至(I)項(xiàng)構(gòu)建的P43-CHA90-LL中，構(gòu)建獲得的陽(yáng)性克隆命名為p43-CHA90-LL-Vector，該重組載體p43-CHA90-LL_Vector已轉(zhuǎn)入到大腸埃希氏菌中，該株帶有p43-CHA90-LL_Vector的大腸埃希氏菌于2012年11月29日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為=CGMCCNo.6898。
2.如權(quán)利要求1中所述口蹄疫病毒重組載體的應(yīng)用，其特征在于；(I)含口蹄疫病毒流行株病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的感染性克隆構(gòu)建；(2)含口蹄疫流行毒株結(jié)構(gòu)蛋白的嵌合病毒拯救，及病毒繁殖；(3)疫苗制備。
3.如權(quán)利要求2中所述口蹄疫病毒重組載體的應(yīng)用，其特征在于含口蹄疫病毒流行株病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的感染性克隆構(gòu)建，其構(gòu)建是通過(guò)PCR擴(kuò)增口蹄疫病毒不同流行株病毒的相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白部分的DNA序列，插入到重組載體p43-CHA90-LL-Vector，通過(guò)病毒拯救，構(gòu)建了分別含O型、Asia I型和A型不同流行毒株的口蹄疫嵌合病毒。
4.如權(quán)利要求2中所述口蹄疫病毒重組載體的應(yīng)用，其特征在于口蹄疫嵌合病毒的拯救，是含O型、Asia I型和A型不同流行毒株的嵌合病毒感染性克隆質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄制備成RNA或直接將質(zhì)粒DNA與T7聚合酶表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，成功拯救出病毒。
5.如權(quán)利要求4中所述口蹄疫病毒重組載體的應(yīng)用，其特征在于將缺失L蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白或兩者均缺失的口蹄疫病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建獲得的包含O型、Asia I型或A型不同毒株的嵌合病毒通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)大量繁殖病毒，用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)，制備相應(yīng)型毒株的滅活疫苗，其滅活疫苗的制備方法為將口蹄疫嵌合病毒接種生長(zhǎng)良好的BHK-21細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)90%以上時(shí)收獲病毒，經(jīng)滅活、純化、濃縮處理后，加入油佐劑(如MantanideISA206)乳化而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種口蹄疫滅活疫苗安全種毒載體及應(yīng)用，即在該載體基礎(chǔ)上構(gòu)建不同血清型的口蹄疫滅活疫苗安全生產(chǎn)種毒。本發(fā)明中構(gòu)建的嵌合病毒既保留了經(jīng)典疫苗毒株細(xì)胞適應(yīng)性良好的優(yōu)點(diǎn)，又能通過(guò)插入流行毒株的結(jié)構(gòu)蛋白克服抗原匹配性不高的缺點(diǎn)，可快速拯救病毒進(jìn)行口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)；以本載體構(gòu)建的A型或Asia Ⅰ型或O型不同毒株嵌合病毒為弱毒，均具有良好的生物安全性，因病毒中缺失了L蛋白，在自然條件下不發(fā)生毒力返強(qiáng)，并且病毒對(duì)乳鼠、豬或牛的致病力大大降低或者無(wú)致病性。安全性高，不會(huì)引起口蹄疫疫情的發(fā)生，非常具有實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K39/135GK103014043SQ201210508638
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者趙啟祖, 鄒興啟, 朱元源, 徐璐, 范學(xué)政, 王琴, 沈青春, 王芳, 寧宜寶 申請(qǐng)人:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所