專利名稱：一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
微生物可對其產(chǎn)生抗性的抗生素現(xiàn)在已涵蓋了我們所已知的絕大多數(shù)種類自然的或者合成的化合物?？股禺a(chǎn)生菌都含有能抵御自身產(chǎn)生的抗生素的抗性元件，這些元件大多位于抗生素生物合成基因簇，屬于調(diào)控元件。環(huán)境中抗生素的存在使微生物在不生產(chǎn)最初抗生素的情況下也能從相近種屬中獲得或自主進(jìn)化得到高特異性的抗性元件。因此，對于抗性基因的研究一直是人們的興趣所在，尤其是抗生素產(chǎn)生菌的自我抗性機(jī)制。
要想對抗生素的自我抗性機(jī)制有詳細(xì)深入的了解，先要清楚不同的抗生素在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)?？股氐淖饔脵C(jī)理大致有以下幾種1)，對細(xì)胞壁的形成有抑制作用，如青霉素，頭孢菌素，磷霉素等；2)，影響細(xì)胞膜的功能，如多肽類抗生素；3)，抑制蛋白質(zhì)合成，如紅霉素，鏈霉素等；4)，干擾核酸代謝，如絲裂霉素，灰黃霉素等。對于作用于不同位置的抗生素，細(xì)胞采取了不同的抵御方式。如前所述，抗生素產(chǎn)生菌自我保護(hù)機(jī)制可以細(xì)化到許多種類，大多數(shù)生產(chǎn)菌不是單ー采用ー種機(jī)制，而是幾種機(jī)制共同起作用。龜裂鏈霉菌就是采用抗生素作用靶點(diǎn)的修飾和藥物溢流兩種方式來保護(hù)自身，免受土霉素(OTC)侵害，后者同時(shí)也是降低終產(chǎn)物抑制的有效手段。然而，為了提高土霉素的產(chǎn)量，本領(lǐng)域還有必要進(jìn)ー步研究保護(hù)龜裂鏈霉菌自身，提高土霉素產(chǎn)量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法，所述方法包括在龜裂鏈霉菌中增加土霉素抗性基因otrA或otrB的表達(dá)。在另ー優(yōu)選例中，在龜裂鏈霉菌中増加土霉素抗性基因otrB的表達(dá)。在另ー優(yōu)選例中，在龜裂鏈霉菌中增加ー個(gè)拷貝的土霉素抗性基因otrA或otrB。在另ー優(yōu)選例中，所述方法包括(I)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包含土霉素抗性基因otrA或otrB的序列；(2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化龜裂鏈霉菌，選擇基因組中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB序列的重組龜裂鏈霉菌。在另ー優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體中，土霉素抗性基因otrA或otrB的序列的5’端，包括強(qiáng)啟動(dòng)子ermE。在另ー優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pSET152載體。在另ー優(yōu)選例中，步驟(2)中，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化去甲基化菌株；從轉(zhuǎn)化的菌株中提取去甲基化的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化龜裂鏈霉菌。在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組的龜裂鏈霉菌，其基因組中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB的序列。在另ー優(yōu)選例中，所述的重組龜裂鏈霉菌是通過前面所述的方法制備獲得。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)土霉素的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述的重組的龜裂鏈霉菌，從而生產(chǎn)土霉素。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、重組質(zhì)粒 pSET152_otrB。圖2、pSET152-otrB 酶切鑒定圖譜。Lane I :分子量標(biāo)記 DL15000 ；Lane 2 =NdeI消化的 pSET152-otrB ；Lane 3 XbaI&NdeI 消化的 pSET152_otrB。圖3、電擊的轉(zhuǎn)化子篩選平板。圖 4、ET12567/pSET152-otrA、ET12567/pSET152-otrB 轉(zhuǎn)化子 PCR 鑒定。Lanel-7 otrA基因轉(zhuǎn)入的重組菌株；Lane 8-9 :陽性對照(PCR模板為空載pSET152質(zhì)粒，帶有apr)；Lane 10-16 :otrB基因轉(zhuǎn)入的重組菌株。Lane 17 :分子量標(biāo)記Marker III。圖5、重組菌株整合方式PCR鑒定圖。A為整合otrA之后的重組菌株染色體示意圖。B和C分別表示陽性重組菌株的PCR結(jié)果。圖6、平板實(shí)驗(yàn)篩選重組菌株。A為otrA基因增強(qiáng)重組菌株(SRI-A) ；B為otrB基因增強(qiáng)重組菌株(SRI-B)。圖7、20株otrA和otrB增強(qiáng)重組菌株發(fā)酵結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，找到了一種通過在龜裂鏈霉菌中増加土霉素抗性基因otrA或otrB的表達(dá)，保護(hù)龜裂鏈霉菌自身，提高土霉素產(chǎn)量的方法。所述方法可提供土霉
素產(chǎn)量50%以上。所述的“龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus) ”是ー種產(chǎn)土霉素的鏈霉菌,其可以從土壌中分離獲得。其形態(tài)為孢子絲螺旋形2 3圈，緊密，偶有松敞螺旋。孢子柱形，
0.8X1.6 1X1.7 微米。所述的“土霉素”化學(xué)名稱為6-甲基-4-ニ甲氨基)-3，5，6，10，12，12a-六羥基-1,11- ニ氧代-1,4,4a,5, 5a,6,11,12a -八氫 ~2~ 并四苯甲酸胺。分子式C22H24N2O9。其為四環(huán)素類抗生素，是廣譜抑菌劑。所述的“啟動(dòng)子”是指ー種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5，端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“外源的”。
如本文所用，“ otrA基因”或“otrB基因”是指ー類編碼膜蛋白的基因、或在嚴(yán)格條件下與所述基因序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表達(dá)對龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量具有顯著的促進(jìn)作用。該定義中還包含在嚴(yán)格條件下與“otrA基因”或“otrB基因”雜交的分子、或與上述分子高度同源的家族基因分子。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指⑴在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2 XSSC,0. 1% SDS，60°C;或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。NCBI已公開了 “otrA基因”或“otrB基因”的序列，例如“otrA基因”的序列參見GenBank登錄號(hào)X53401. I所示；“otrB基因”的序列參見GenBank登錄號(hào)AF061335. I所示。本發(fā)明的“otrA基因”或“otrB基因”的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。為了增加龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量，本發(fā)明人作了廣泛地研究，找到了適合于進(jìn)行改良的基因，并構(gòu)建了相應(yīng)的構(gòu)建物。因此，本發(fā)明提供了ー種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括“otrA基因”或“otrB基因”的表達(dá)盒。所述的表達(dá)盒具備基因表達(dá)所需的所有元件(包括啟動(dòng)子、編碼DNA以及終止子等)，從而可完整地表達(dá)出相應(yīng)的蛋白。通常，所述的構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括ー種載體，它含有所述的構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的ニ氫葉酸還原酶、新霉素抗性。優(yōu)選的，本發(fā)明的表達(dá)載體上的選擇性標(biāo)記是安普霉素(apr)抗性基因。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。包含上述的適當(dāng)多核苷酸序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?。在本發(fā)明的方法中，所述的宿主是龜裂鏈霉菌。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，例如磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。作為ー種優(yōu)選的方式，可用電轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)施例中，土霉素00TC兩個(gè)抗性基因otrA和otrB分別被克隆到鏈霉菌特異性整合質(zhì)粒PSET152上，酶切鑒定后電擊轉(zhuǎn)化SRI感受態(tài)細(xì)胞，使其發(fā)生特異性整、合。后以重組菌株基因組為模板，設(shè)計(jì)兩組引物驗(yàn)證重組質(zhì)粒整合方式。最后得到了龜裂鏈霉菌基因組上otrA或otrB基因增強(qiáng)的重組菌株。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在干本發(fā)明找到并驗(yàn)證了導(dǎo)致抗生素生物合成終止的原因，解決了土霉素產(chǎn)物對于龜裂鏈霉菌的反饋抑制，提高了抗生素產(chǎn)生菌自身抗性，從地提高抗生素產(chǎn)量。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I、pSET152-otrA/pSET152-otrB 構(gòu)建與去甲基化根據(jù)龜裂鏈霉菌Streptomyces rimosus M4018(購自 Pfize 公司)中 otrA、otrB基因序列設(shè)計(jì)引物，并在正向引物序列引入NdeI酶切位點(diǎn)，在反向引物序列引入XbaI酶切位點(diǎn)，具體引物為otrA 正向5' CGCCATATGATGAACAAGCTGAATCTGGG 3' (SEQ ID NO 2)；otrA 反向5' GGAAGCTTTCTAGATCACACGCGCTTGAGC 3' (SEQ ID NO : 3)。otrB 正向5' CGCCATATGGTGTCATCCGCAAATCCG 3' (SEQ ID NO 4)；otrB 反向5' CCAAGCTTGCTCTAGATCAGGCGTCCGACGC 3' (SEQ IDNO : 5)。以I U L Streptomyces rimosusM4018 菌總 DNA 為模板進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增反應(yīng)。PCR 反應(yīng)的總體系為25iiL，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性7min后開始循環(huán)，即94°C lmin，58°C 30s，72°C 2min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行延伸，即72°C延伸7min。otrA、otrB基因PCR產(chǎn)物分別用凝膠回收試劑盒回收，再將回收的PCR產(chǎn)物分別連接到PMD19T載體(Promega)上。16°C連接6h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli) ToplO感受態(tài)細(xì)胞，將細(xì)胞涂布在含 100 u g/mL Amp, 24 u g/mL IPTG，及 40 y g/mLX-gal 的 LB 平板上 37°C過夜培養(yǎng)。挑選陽性克隆進(jìn)行DNA測序分析。將菌落于試管中擴(kuò)培，以堿裂解法提取質(zhì)粒，用NdeI和XbaI雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收帶NdeI和XbaI酶切位點(diǎn)的otrA、otrB基因。用NdeI和XbaI雙酶切載體pSET152 (鏈霉菌整合質(zhì)粒，獲自UniversityofStrathclyde, Glasgow, UK),然后分別與獲得的帶NdeI和XbaI酶切位點(diǎn)的otrA或otrB基因進(jìn)行連接反應(yīng)。16°C過夜連接后，把連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E. Coli)ToplO感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布在含50 ii g/mL apr (Apramycin)的LB平板上過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆，擴(kuò)培后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。鑒定正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化去甲基化大腸桿菌ET12567 (獲自 University of Strathclyde, Glasgow, UK),并涂布在含 50 U g/mL apr 的LB平板上過夜培養(yǎng)。經(jīng)鑒定正確后保存于_20°C。獲得的重組質(zhì)粒pSET152-otrB的示意圖如圖I ;pSET152_otrA的圖譜類似于圖1，其中的otrB基因被otrA基因取代。由于在otr基因上游引入了 NdeI酶切位點(diǎn)，下游引入了 XbaI酶切位點(diǎn)，因此將平板上長出的菌落進(jìn)行擴(kuò)培后，提取質(zhì)粒用NdeI和XbaI進(jìn)行雙酶切鑒定，pSET152-otrB酶切分析圖譜見圖2。實(shí)施例2、龜裂鏈霉菌エ業(yè)菌電轉(zhuǎn)化將鑒定正確的大腸桿菌ET12567/pSET152-otrA 或 ET12567/pSET152_otrB 擴(kuò)培，提取去甲基化的質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)龜裂鏈霉菌エ業(yè)菌(購自山西大同同星抗生素有限公司)(SRI)感受態(tài)細(xì)胞，培 養(yǎng)于含500 u g/mL apr的TSA培養(yǎng)基(按照重量含TSB 3% ；AgarI. 5% )上，培養(yǎng)3-7天。挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)鑒定正確后保存于-20°C。電轉(zhuǎn)之后，30°C培養(yǎng)5-7天。轉(zhuǎn)化有ET12567/pSET152-otrB的菌落生長狀況如圖3。由于龜裂鏈霉菌エ業(yè)菌基因組中沒有Apramycin抗性基因，而陽性轉(zhuǎn)化子則因重組質(zhì)粒特異性整合到染色體上而獲得了此抗性基因。因此，在NCBI上查找到Apramycin抗性基因序列，設(shè)計(jì)引物(引物序列 F :5，-TGCAATACGAATGGCGAAAAG-3’ (SEQ ID NO 6)和 R 5’ -TCGGCCCAGITGACCCAGGG-3’ (SEQID NO :7))，以重組菌的總 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳圖如圖4。Apramycin抗性基因大小為750bp。實(shí)施例3、重組菌整合方式鑒定圖5A所示為整合之后的重組菌株染色體示意圖。如果重組質(zhì)粒與基因組進(jìn)行了正確的位點(diǎn)特異性重組，按照此圖，設(shè)計(jì)attB-F&apr-R和otrA-F&attB-R兩對鑒定引物對其整合方式進(jìn)行分子鑒定，理論片段大小分別為2077bp和4600bp。圖5B和C分別表示陽性重組菌株的PCR結(jié)果。引物序列為attB-F:5’ GTTCACCAACAGCTGGAGGC 3’ (SEQ ID NO :8)；apr-R:5’ -TCGGCCCAGTTGACCCAGGG-3’ (SEQ ID NO :9)。otrA-F :5' CGCCATATGATGAACAAGCTGAATCTGGG 3' (SEQ ID NO :10);attB-R:5，CGTCATGCCCGCAGTGACC 3，(SEQ ID NO :11)。如圖5所示，表示重組菌株確實(shí)是按照本發(fā)明人預(yù)期的方式發(fā)生位點(diǎn)特異性重組的。pSET152是鏈霉菌整合質(zhì)粒，質(zhì)粒上帶有紅霉素抗性基因啟動(dòng)子ermE，其序列如下(SEQ ID NO 1)gaattcggtaccagcccgacccgagcacgcgccggcacgcctggtcgatgtcggaccggagttcgaggtacgcggcttgcaggtccaggaaggggacgtccatgcgagtgtccgttcgagtggcggcttgcgcccgatgctagtcgcggttgateggcgatcgcaggtgcacgcggtcgatcttgacggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatgctgttgtgggcacaatcgtgccggttggtaggatctgcagccaagctctggaccgcccccgactcctgaccgccggccatccgtgaccaccgctcagcacgaaggagaacagaccgtggcagccgccgccaagatcgccatgtccagtgtggcgcccagtcaccggcaggggggcagcacccgcgccct
gctgacgccgtcgtcggtgggtgcgacctccggagagctcggtacccggggatcctctaga啟動(dòng)子ermE是能在鏈霉菌中組成型表達(dá)且比較強(qiáng)的啟動(dòng)子。pSET不含鏈霉菌復(fù)制起始位點(diǎn)，屬于鏈霉菌自殺型載體，若不能整合到染色體上，將因不能在鏈霉菌中復(fù)制而丟失。PSET152與基因組的位點(diǎn)特異性重組是依靠來自鏈霉菌噬菌體的のC31整合酶發(fā)揮作用的。鏈霉菌溫敏型噬菌體のC31的整合酶基因是絲氨酸重組酶家族中的ー員，這種酶能準(zhǔn)確地識(shí)別細(xì)菌附著位點(diǎn)(attB)和噬菌體附著位點(diǎn)(attP)，進(jìn)而介導(dǎo)整合。attB和attP最小活性序列長度分別為34和39bp。經(jīng)過位點(diǎn)特異性整合生成2個(gè)雜合位點(diǎn)attL與attR，attL與attR沒有顯著的DNA重復(fù)，不能作為整合酶重組的底物，反應(yīng)是單向不可逆的。のC31-int催化作用具有自主作用的特點(diǎn)，不需要外界的化學(xué)能源、蛋白質(zhì)輔助因子或者特殊的DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。實(shí)施例4、土霉素(OTC)生產(chǎn)實(shí)例將去甲基化重組質(zhì)粒(pSET152-otrA或pSET152-otrB)電轉(zhuǎn)化龜裂鏈霉菌エ業(yè)菌感受態(tài)細(xì)胞以后，培養(yǎng)在含有500 u g/mL Apramycin抗生素的TSA平板上，待長出菌落后， 再生長兩天，用扁平竹簽將菌落表面的灰白色孢子輕輕刮下，均勻規(guī)律地點(diǎn)至另ー塊已劃分好區(qū)域的TSA平板上。otrA基因增強(qiáng)重組菌株(SRI-A)共挑出85株，otrB基因增強(qiáng)重組菌株(SRI-B)共挑出120株。如圖6所示為部分平板背面示意圖。土霉素屬于四環(huán)素類抗生素，此類抗生素產(chǎn)生菌在生長的穩(wěn)定期，次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成常常伴有其他較深顏色色素的產(chǎn)生，所以觀察平板背面菌落的顔色，可以在一定程度上表明菌體抗生素合成的情況。依據(jù)這樣的原則，挑選背面顏色較深的SRI-A和SRI-B各10株，以未轉(zhuǎn)化的龜裂鏈霉菌エ業(yè)菌為對照(SRI)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，每株菌平行做3瓶以減小試驗(yàn)誤差。發(fā)酵試驗(yàn)的過程500mL搖瓶發(fā)酵，裝液量I % (v/v)，接種量I %，30°C，260rpm培養(yǎng)8天，培養(yǎng)基為常規(guī)エ業(yè)配方(購自山西大同同星抗生素有限公司)。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中土霉素的終濃度，各重組菌株的試驗(yàn)結(jié)果見圖7。從圖中各菌株土霉素產(chǎn)量比較可以看出，所挑選的10株otrA增強(qiáng)重組菌株OTC產(chǎn)量與原始菌株相比均無明顯變化；而otrB基因增強(qiáng)重組菌株有80% 土霉素產(chǎn)量均較原始菌株有顯著的提高，且B-80菌株OTC產(chǎn)量較原始菌株提高了 73. 7%。從這ー結(jié)果可以看出，otrA基因的增強(qiáng)大體上對龜裂鏈霉菌エ業(yè)菌土霉素的產(chǎn)量沒有明顯影響，而otrB基因的增強(qiáng)卻能在一定程度上提高土霉素產(chǎn)量。結(jié)論與總結(jié)在細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)中，有很多對細(xì)胞生長或者對次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生具有正向調(diào)節(jié)作用的因子。本發(fā)明人在對這些細(xì)胞進(jìn)行基因改造吋，總是試圖增強(qiáng)這些調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，使其更利于產(chǎn)物的合成。通常采用的方法包括在基因上游加入強(qiáng)啟動(dòng)子，增加這些調(diào)節(jié)因子的應(yīng)答元件的供應(yīng)量，以及最常用的特異性重組等。本發(fā)明利用帶有ermE強(qiáng)啟動(dòng)子的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒PSET152，構(gòu)建帶有土霉素抗性基因的重組質(zhì)粒，再將其導(dǎo)入SRI基因組中，利用質(zhì)粒上的attP位點(diǎn)與基因組上的attB位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，使SRI基因組中的土霉素抗性基因増加一個(gè)拷貝，且這個(gè)拷貝是在強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控之下的。我們知道，細(xì)胞不能無限制的合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，抗生素合成的中止不是由于其產(chǎn)生菌細(xì)胞體失去活力，而是以下三種可能的原因使其終止1)抗生素生物合成途徑中一個(gè)或更多的酶發(fā)生了不可逆衰退；2)胞內(nèi)積累的抗生素產(chǎn)生了較強(qiáng)的反饋抑制作用；3)抗生素生物合成所需前體的耗竭。如果能克服其中導(dǎo)致抗生素生物合成終止的原因，那么可以預(yù)測細(xì)胞將源源不斷的合成所需要的抗生素，這對于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用是相當(dāng)有利的。而本發(fā)明所做的研究正是試圖解決產(chǎn)物的反饋抑制，提高抗生素產(chǎn)生菌自身抗性，從而提高抗
生素產(chǎn)量。細(xì)胞對抗生素具有與生俱來的抗性，這ー特性不僅限于抗生素產(chǎn)生菌，許多細(xì)菌和真菌也會(huì)在長期進(jìn)化過程中形成對某些抗生素的抗性，這就形成了所說的耐藥性?？股仄毡榇嬖谟诃h(huán)境中(尤其是土壤環(huán)境中)，對細(xì)菌的生存造成了壓力。在長期的進(jìn)化過程中，抗生素耐藥基因在細(xì)菌中已經(jīng)普遍存在。在非抗生素產(chǎn)生菌中，抗生素耐藥基因的表達(dá)主要是為了應(yīng)對環(huán)境的抗生素壓力，而抗生素產(chǎn)生菌(如鏈霉菌)除了受到環(huán)境中的抗生素壓カ外，還首當(dāng)其沖地受到自身所產(chǎn)生的抗生素的壓力，因而其抗生素耐藥基因的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制就比非抗生素產(chǎn)生菌復(fù)雜，抗生素耐藥基因參與了抗生素的合成調(diào)控，以確?？股啬退幮缘募皶r(shí)表達(dá)，從而免受自身抗生素的破壞。 在細(xì)菌中，至少存在以下幾種抗生素耐藥機(jī)制(I)合成鈍化抗生素的酶，如弗氏鏈霉菌的氨基糖苷耐藥性主要通過產(chǎn)生催化抗生素共價(jià)修飾的酶；(2)改變細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，如膜蛋白的缺失或變異、內(nèi)膜滲透性的改變等；(3)通過主動(dòng)排出機(jī)制降低細(xì)胞內(nèi)的抗生素積累，如抗生鏈霉菌(S. an tibioticus)oleC基因所控制的竹桃霉素主動(dòng)外排；(4)改變核糖體祀位，如從卡那霉素產(chǎn)生菌卡那霉素鏈霉菌(S. kana2my ceti2cus)中分離得到的一種誘導(dǎo)性卡那霉素耐藥基因通過修飾核糖體，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，可以賦予淺青紫鏈霉菌、淡紫灰鏈霉菌(S. Iavend u Iae)和微小鏈霉菌卡那霉素耐藥性；(5)改變靶酶，如青霉素結(jié)合蛋白；(6)過量合成靶酶；(7)存在抗生素抑制的旁路。有研究表明，抗生素合成基因與耐藥基因具有協(xié)調(diào)表達(dá)的效應(yīng)。主要表現(xiàn)在1)抗生素耐藥基因一般早于抗生素合成而表達(dá)，耐藥基因可能具有雙重功能，首先它能夠使抗生素產(chǎn)生菌免于自身抗生素的破壞；其次，它又是激活抗生素合成基因的調(diào)節(jié)環(huán)路中的ー個(gè)重要成分，這確保了耐藥性的建立早于抗生素的合成；2)細(xì)胞大多具有誘導(dǎo)耐藥性；3)抗生素合成基因與耐藥基因的協(xié)調(diào)表達(dá)。ー些鏈霉菌具有2種或更多的抗生素耐藥機(jī)制，至少有I種耐藥基因與抗生素合成基因緊密連鎖?？股馗弋a(chǎn)菌株的篩選也伴隨著耐藥水平的増加，反之亦然。所以研究抗生素耐藥基因?qū)τ趯?shí)際生活和生產(chǎn)具有十分重要的意義I)，有助于闡明抗生素合成調(diào)控的途徑；2)，用作載體選擇標(biāo)記；3)減少基因污染；4)先分離耐藥基因，再分離合成基因簇，已經(jīng)成為ー個(gè)經(jīng)典的克隆策略；5)篩選高耐藥菌株以分離抗生素高產(chǎn)菌株；6)應(yīng)用于藥物設(shè)計(jì)。土霉素抗性基因保護(hù)SRI不被自身產(chǎn)生的OTC所損傷。但是這種保護(hù)有一定的限度。當(dāng)胞內(nèi)OTC達(dá)到一定濃度時(shí),otrB蛋白的相對不足會(huì)導(dǎo)致OTC不能及時(shí)被運(yùn)送到胞夕卜，從而造成胞內(nèi)OTC的過量積累，同時(shí)未被otrA蛋白修飾過的核糖體便會(huì)成為多余OTC攻擊的目標(biāo)，這樣便對自身造成了損傷。當(dāng)本發(fā)明人將SRI中抗性基因的拷貝數(shù)和表達(dá)增強(qiáng)以后，額外的保護(hù)蛋白就能彌補(bǔ)這些不足。另外，由于OTC是一系列復(fù)雜生物反應(yīng)合成的產(chǎn)物，合成過程中酶的酶活會(huì)受到終產(chǎn)物OTC的反饋抑制。也即當(dāng)OTC生產(chǎn)到一定量時(shí)，會(huì)將產(chǎn)物已充足的信息反饋給細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)因子，這些因子會(huì)進(jìn)ー步降低產(chǎn)物合成的酶活，這樣不僅可以防止過量產(chǎn)物可能對菌體造成的損害，又能節(jié)約細(xì)胞內(nèi)的資源，使底物都得到充分利用。由于otrB編碼的膜蛋白可將OTC運(yùn)送至胞外，將此基因過量表達(dá)后，便能將更多的OTC運(yùn)送至胞外，使胞內(nèi)OTC —直維持在較低水平，可有效解除或降低反饋抑制。鏈霉菌一般都對自身產(chǎn)生的抗生素具有耐受性，然而對不同種類鏈霉菌所產(chǎn)生的抗生素可能敏感?？股厣锖铣苫虼刂邪股啬退幓?，這些耐藥基因所表達(dá)的耐藥機(jī)制對該基因簇所編碼合成的抗生素具有很強(qiáng)的選擇性。耐藥水平與抗生素合成水平呈正相關(guān)，抗生素產(chǎn)生能力的提高應(yīng)該是抗生素合成調(diào)控基因的超量表達(dá)。這說明表達(dá)抗生素耐藥性的酶是抗生素生物合成途徑的限速酶。綜上，本發(fā)明以增強(qiáng)抗生素產(chǎn)生菌自身抗性為主線，結(jié)合龜裂鏈霉菌エ業(yè)菌株高生產(chǎn)性能，分別將SRI中兩個(gè)抗性基因增強(qiáng)，得到了 OTC高產(chǎn)菌株。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每ー篇文獻(xiàn)被単獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
權(quán)利要求
1.一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述方法包括在龜裂鏈霉菌中増加土霉素抗性基因OtrA或OtrB的表達(dá)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在龜裂鏈霉菌中増加土霉素抗性基因OtrB的表達(dá)。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在龜裂鏈霉菌中増加一個(gè)拷貝的土霉素抗性基因otrA或otrB。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包含土霉素抗性基因otrA或otrB的序列； (2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化龜裂鏈霉菌，選擇基因組中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB序列的重組龜裂鏈霉菌。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體中，土霉素抗性基因otrA或otrB的序列的5’端,包括強(qiáng)啟動(dòng)子ermE。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于，所述的表達(dá)載體是pSET152載體。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化去甲基化菌株；從轉(zhuǎn)化的菌株中提取去甲基化的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化龜裂鏈霉菌。
8.—種重組的龜裂鏈霉菌，其特征在于，其基因組中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB的序列。
9.如權(quán)利要求8所述的龜裂鏈霉菌，其特征在于，其是通過權(quán)利要求1-7任一所述的方法制備獲得。
10.一種生產(chǎn)土霉素的方法，其特征在于，所述方法包括 培養(yǎng)權(quán)利要求8或9所述的重組的龜裂鏈霉菌，從而生產(chǎn)土霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法。揭示了一種通過在龜裂鏈霉菌中增加土霉素otrA基因或otrB基因的表達(dá)，保護(hù)龜裂鏈霉菌自身，提高土霉素產(chǎn)量的方法。所述方法獲得的龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量顯著提高。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102757975SQ20111010732
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者儲(chǔ)炬, 姚高峰, 莊英萍, 張嗣良, 鄭子靜, 郭美錦, 錢江潮 申請人:華東理工大學(xué)