專利名稱：釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶催化合成共軛亞油酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶催化合成共軛亞油酸的方法。
背景技術(shù)：
共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，以下簡稱CLA)是含有順式或反式共軛雙鍵的十八碳二烯酸，是必需脂肪酸亞油酸(Linoleic acid，以下簡稱LA)衍生而成的一組位置和構(gòu)象異構(gòu)體的總稱。許多微生物能利用自身的亞油酸異構(gòu)酶將亞油酸轉(zhuǎn)化成共軛亞油酸。但目前應(yīng)用的亞油酸異構(gòu)酶主要存在以下問題酶的重組表達方式一般是細胞內(nèi)表達和分泌表達，細胞內(nèi)表達時由于酶不能與細胞外底物接觸，從而極大地影響酶的催化效率，而且酶分子集聚在細胞內(nèi)形成反饋抑制，也影響表達效率；分泌表達的主要缺點是表達效率不高，而且也不能實現(xiàn)完全分泌表達，總有相當(dāng)一部分表達產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)，從而也不能實現(xiàn)酶與細胞外底物的完全接觸。這兩種表達方式都導(dǎo)致酶的催化效率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶催化合成共軛亞油酸的方法，將亞油酸異構(gòu)酶展示在細胞壁上，可以直接接觸到底物，進而提高共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化效率。一種釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶催化合成共軛亞油酸的方法，包括將釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶加入到含有亞油酸的緩沖液中，振蕩反應(yīng)；所述的釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶通過如下方法制備將攜帶重組質(zhì)粒的釀酒酵母K601，接種到Y(jié)PG培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集菌體，洗滌，得到釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶；所述的重組質(zhì)粒包括原始載體pYES2和插入原始載體PYES2的目的基因，所述目的基因由依次連接的Mf α 1信號肽基因、亞油酸異構(gòu)酶基因、釀酒酵母α-凝集素基因C端錨定區(qū)基因組成，所述的Mf α 1信號肽基因插入到原始載體pYES2中GALl啟動子的下游。所述的亞油酸異構(gòu)酶基因Iai來源于植物乳桿菌(LactcAacillusplantarum) 1ρ15-2-1，其保藏號為CGMCC No. 3782，該菌株的分離、純化及鑒定方法已在中國專利申請 201010251108. X 中公開，GenBank 號為 HQ831447，堿基序列如 SEQ ID NO 1 所示；Mf α 1 酵母信號肽基因來自釀酒酵母，GenBank號為YPL187，堿基序列如SEQ ID NO 3 ；酵母α -凝集素C端錨定區(qū)基因sag的GenBank號為YJR004C，堿基序列如SEQ IDNO 2所示。所述的釀酒酵母K601為標(biāo)準試驗菌株，它可以商業(yè)購買或從保藏機構(gòu)獲得。所述的緩沖液為磷酸緩沖液。所述的緩沖液中亞油酸的濃度為3mg/ml。所述的振蕩反應(yīng)溫度為28 32°C。所述的振蕩反應(yīng)時間為6 80h。本發(fā)明通過將亞油酸異構(gòu)酶基因插入到載體pYES2中，導(dǎo)入到釀酒酵母K601中，攜帶重組質(zhì)粒的釀酒酵母K601經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，亞油酸異構(gòu)酶通過Mf α 1酵母信號肽分泌到細胞外，并利用亞油酸異構(gòu)酶下游的凝集素錨定蛋白錨定在釀酒酵母細胞壁上，使亞油酸異構(gòu)酶展示表達在釀酒酵母細胞外表面，直接與底物亞油酸接觸，提高共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化效率，降低生成成本。


圖1是酵母細胞壁展示表達載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是PCR鑒定酵母轉(zhuǎn)化子的電泳結(jié)果圖。圖3是酵母細胞表面展示亞油酸異構(gòu)酶酶活測定圖。圖4酵母細胞表面展示亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化合成CLA的氣相色譜圖；A 陰性對照菌株(轉(zhuǎn)有空載體pYES》轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的氣相色譜圖；B:重組酵母菌菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的氣相色譜圖；C :LA和CLA甲酯標(biāo)樣的氣相色譜圖，其中1為LA ;2為c9tlI-CLA ；3為tl0cl2_CLA。
具體實施例方式實施例1酵母展示重組質(zhì)粒的構(gòu)建分別以植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) 1ρ15_2_1和釀酒酵母K601基因組DNA為模板，利用表1中的引物，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為10XPCR buffer(含 Mg2+)5y L，dNTPs(25mM)4y L，引物 1 禾口弓丨物 2 (10 μ Μ)各 1 μ L，基因組 DNA 1 μ g，ExTaqDNA 聚合酶1U，加無菌超純水至終體積50 μ L ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性 30s，48°C退火30s (基因mf α 1) /50°C退火40s (亞油酸異構(gòu)酶基因Iai和酵母α -凝集素 C端含321aa的錨定區(qū)基因sag)，72°C延伸lmin，反應(yīng)30個循環(huán)；72°C延伸5min。得到信號肽基因mf al (SEQ ID NO :3)、亞油酸異構(gòu)酶基因Iai (SEQ ID NO=D和酵母α -凝集素 C端含321氨基酸的錨定區(qū)基因sag (SEQ ID NO 2)。表1所用引物序列
j丨物引物序列(下劃線部分為酶切位點)引物用途及酶切位點
MFa 1-5'CGAAGCTTATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC擴增酵母信號肽 (/Λ>ζ(1ΙΙΙ )
MFa 1-3'CGGAATTCAGCTTCAGCCTCTCTTTTATCC擴增酵母信號肽 (EcoR I )SAGl-5，CGCTCGAGAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC擴增酵母凝集素基因 sag (Λ7ζο I ) SAG 1-3'CGTCTAGATTAGAATAGCAGGTACGACAAAAGCAG擴增酵母凝集素基因 sag (J a I ) LAI-5，CGGAATTCATGGTTAAAAGTAAAGCAATTATGATTG擴增/α,·基因(￡coRI )
LAI-3 ‘ CGCTCGAGGTCAAACATCTTCTTAGTTG_擴增 fa,·基因(Ζ/ζο I )_將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD 18_T simple (pMDS)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，得到質(zhì)粒pMDS-lai、pMDS-mf a 1和pMDS-sag。首先用HindIII和EcoR I雙酶切質(zhì)粒pMDS-mf α 1和空載體pYES2，回收基因片段mf α 1和載體pYES2并連接，構(gòu)建 pYES2-mf α 1 (ρYM)載體；再用EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pMDS-lai和ρYM,回收Iai基因片段并將之插入載體PYM中，構(gòu)建pYES2-mf α 1-lai (pYML)載體；最后用Β ο I和)(baI 雙酶切質(zhì)粒pMDS-sag和pYML，回收基因片段sag和載體pYML并連接，構(gòu)建酵母展示表達載體pYES2-mf α 1-lai-sag (pYMLS)。結(jié)果如圖1所示，從N端到C端為GALl啟動子 +mf α l+lsii+sEig。實施例2重組酵母的獲得及篩選SD(尿嘧啶缺失型)固體篩選培養(yǎng)基(g/L) :SD+2%瓊脂粉
SD培養(yǎng)基成分(g/L) :16. 8g酵母氮源；0. 77g尿嘧啶缺失型氨基酸；2g半乳糖。載體pYES2上有URA基因，重組酵母菌能夠在缺失尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長，因此選用SD固體篩選培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。將上述重組質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)化到釀酒酵母細胞K601中，用Bio-Rad的基因電擊轉(zhuǎn)化儀(BTX)，將電擊杯轉(zhuǎn)入電擊座中，進行電擊轉(zhuǎn)化，條件為電壓為1.5KV;電容25yF; 電阻200 Ω ；電擊時間k ；然后在SD固體篩選培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，30°C、培養(yǎng)48h，篩選得到轉(zhuǎn)化子；最后對獲得的轉(zhuǎn)化子進行亞油酸異構(gòu)酶基因的PCR擴增鑒定，結(jié)果如圖2所示，與陰性對照菌株(CK)相比，重組酵母菌菌株均能擴增出約1700bp的條帶，說明質(zhì)粒pYMLS已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到釀酒酵母K601中。實施例3重組酵母酶活測定及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析YPG誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分(g/L) :10g蛋白胨；5g酵母膏；IOg半乳糖。將上述獲得的重組酵母菌接種到Y(jié)PG誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)4 后，離心 (3000r/min, IOmin,)收集菌體細胞，將收集的菌體細胞經(jīng)生理鹽水(0.9% ν/ν)洗滌兩次后，加入到含有3mg/ml亞油酸的磷酸緩沖液中(0. lmol/1, pH7. 0) ；30°C，180rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每隔6小時取樣測定亞油酸異構(gòu)酶的酶活，以攜帶空載體PYES2的酵母菌菌體細胞的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為對照，結(jié)果如圖3所示，由圖可知隨著培養(yǎng)時間的增加，重組酵母菌菌體細胞的酶活逐漸增加，在20h時達到最大，為40. 5U/ml，之后逐漸下降；而攜帶空載體pYES2 的酵母菌體細胞基本檢測不到亞油酸異構(gòu)酶酶活。將上述重組酵母菌的轉(zhuǎn)化20h時產(chǎn)物經(jīng)兩倍體積正己烷提取后，用氣相色譜檢測，如圖4所示，圖中A:陰性對照菌株(轉(zhuǎn)有空載體pYES2)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的氣相色譜圖；B:重組酵母菌菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的氣相色譜圖；C =LA和CLA甲酯標(biāo)樣的氣相色譜圖，其中1為LA ;2 為 c9tIl-CLA ；3 為 tl0cl2-CLA。LA和CLA甲酯標(biāo)樣的檢測表明LA的出峰時間為30. 46min，而CLA中的兩種異構(gòu)體c9t 11-CLA和t IOc 12-CLA得到了較好的分離，其保留時間分別為32. 62min和 32. 83min (圖4C)；利用氣相色譜分析法分別對對照菌株和重組酵母菌菌株細胞合成的CLA 產(chǎn)物進行分析，結(jié)果如圖4中A和B。通過與圖4C中LA和CLA甲酯標(biāo)樣的保留時間比對， 轉(zhuǎn)有空載體PYES2的陰性對照菌株培養(yǎng)液催化LA后其產(chǎn)物中并沒有明顯的CLA產(chǎn)生(圖 4A)；而含有酵母展示表達載體pYMLS的釀酒酵母工程菌株培養(yǎng)液催化LA后產(chǎn)物在保留時間為30. 28和32. 45min時出現(xiàn)典型峰(圖4B)，比對圖4C中LA和CLA甲酯標(biāo)樣的保留時間得知，二者分別為LA和c9tlI-CLA0且剩余LA的峰面積為15682. 3，c9tIl-CLA的峰面積為5800. 3，不考慮產(chǎn)物提取及甲酯化過程中的LA損失，則約有27. 0%的LA轉(zhuǎn)化合成了 c9tll-CLA。
權(quán)利要求
1.一種釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶催化合成共軛亞油酸的方法，包括將釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶加入到含有亞油酸的pH6. 0-7. 0的緩沖液中，振蕩反應(yīng)；所述的釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶通過如下方法制備將攜帶重組質(zhì)粒的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) K601，接種到Y(jié)PG培養(yǎng)基中， 誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集菌體，洗滌，得到釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶；所述的重組質(zhì)粒包括原始載體PYES2和插入原始載體pYES2的目的基因，所述目的基因由依次連接的Mf α 1信號肽基因、亞油酸異構(gòu)酶基因、酵母α -凝集素C端錨定區(qū)基因組成，所述的Mfa 1信號肽基因插入到原始載體PYES2中GALl啟動子的下游。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的亞油酸異構(gòu)酶基因堿基序列如SEQ ID NO 1 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的酵母α-凝集素C端錨定區(qū)基因堿基序列如SEQ ID NO 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的Mfα 1信號肽基因堿基序列如SEQ ID NO 3 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的緩沖液為磷酸緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的緩沖液中亞油酸的濃度為:3mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的振蕩反應(yīng)的溫度為^_32°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的振蕩反應(yīng)時間為6 80h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶催化合成共軛亞油酸的方法，將含有重組質(zhì)粒的釀酒酵母K601，接種到Y(jié)PG培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體，洗滌，得到釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶催；然后將得到的釀酒酵母展示亞油酸異構(gòu)酶加入到含有亞油酸的緩沖液中，振蕩反應(yīng)。本發(fā)明將亞油酸異構(gòu)酶展示表達在釀酒酵母細胞外表面，直接與底物亞油酸接觸，提高共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化效率，降低生成成本。
文檔編號C12R1/865GK102206688SQ201110106809
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者何國慶, 劉佩, 周倩, 阮暉 申請人:浙江大學(xué)