專利名稱：一種大豆胞囊線蟲抗性基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆胞囊線蟲抗性基因及其應(yīng)用，屬于含有編碼蛋白的RNA或 DNA的化合物庫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在我國，尤其是在我國東北地區(qū)，由于濫墾、濫牧、濫砍濫伐等現(xiàn)象的日益加劇，使得耕地沙化、干旱及鹽堿地的面積逐年增加。據(jù)報(bào)道，全國鹽堿地面積逾5億畝，黑龍江省重度鹽堿地面積為1600萬畝(《鹽堿地改造與有機(jī)產(chǎn)業(yè)發(fā)展論壇》，2010)。由于大豆胞囊線蟲喜干旱、堿性的土壤環(huán)境(濕度60%，pH 8. 0)，因此土地沙化、干旱及鹽堿地面積的擴(kuò)大造成了大豆胞囊線蟲危害的日益嚴(yán)重。大豆胞囊線蟲是危害世界大豆生產(chǎn)的主要病蟲害之一，也是危害我國大豆生產(chǎn)的主要病蟲害。具有為害面積廣泛、為害程度嚴(yán)重，致病性強(qiáng)的特點(diǎn)，土壤一經(jīng)感染這類病蟲害極難根除，目前選育具有良好適應(yīng)性的抗性品種是防治大豆胞囊線蟲最經(jīng)濟(jì)有效的措施。而對(duì)抗病基因的研究是抗性品種選育的基礎(chǔ)。因此克隆大豆胞囊線蟲抗性基因具有重要意義。目前，已經(jīng)確定的大豆胞囊線蟲抗性位點(diǎn)約有100多個(gè)，但是根據(jù)這些位點(diǎn)克隆的基因卻鮮有報(bào)道。隨著大豆基因組測(cè)序的完成，采用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行基因的挖掘已經(jīng)成為可能，另外，無論是來自單子葉植物的還是雙子葉植物的抗性基因，在結(jié)構(gòu)上都有一些保守性，這為抗病基因的挖掘提供了便利條件。大豆胞囊線蟲對(duì)大豆的侵染具有特異性，因此，挖掘到的候選基因無法在擬南芥等模式植物中驗(yàn)證其抗性，而大豆又是公認(rèn)的難以轉(zhuǎn)化的植物，因此，找到一種能夠快速進(jìn)行抗性候選基因功能驗(yàn)證的方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種大豆胞囊線蟲抗性基因。所述大豆胞囊線蟲抗性核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，1)其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的核苷酸序列能夠雜交且能夠表達(dá)的DNA分子；3)與1)中所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達(dá)的mRNA分子；4)與1)中所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達(dá)的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。含有以上任一所述核苷酸序列的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體為將上述編碼基因插入pGFP⑶S獲得的重組載體。擴(kuò)增以上任一所述核苷酸序列的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增權(quán)利要求1所述核苷酸序列所用的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4 所示。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種大豆胞囊線蟲抗性基因應(yīng)用的方法。所述基因片段在不含有此基因的植物組織中的表達(dá)應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述植物組織為根、莖、葉、花或種子。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物為煙草，所述雙子葉植物為擬南芥及任何栽培或者野生大豆。所述表達(dá)為過表達(dá)。所述表達(dá)和/或所述過表達(dá)是通過含有大豆胞囊線蟲胞囊、蟲卵、幼蟲的試驗(yàn)土樣及溶液在溫室條件下進(jìn)行表達(dá)。所述幼蟲為二齡幼蟲，所述土樣為將病土和無菌細(xì)沙以3 1的比例均勻混合制備的試驗(yàn)病土，所述溶液為每毫升至少含有400個(gè)蟲卵的懸浮液，所述溫室條件為光照模式day/night = 16h/8h ；溫度模式day/night = 28°C /250C0表達(dá)分析結(jié)果顯示，該基因在抗病親本中特異表達(dá)，而在感病親本中不表達(dá)，且在抗病親本的根部的表達(dá)量明顯高于葉片中的表達(dá)量。將本發(fā)明中的基因序列與CaMV 35S啟動(dòng)子連接在一起后采用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染大豆子葉節(jié)的方法，誘導(dǎo)感大豆胞囊線蟲的品種產(chǎn)生毛狀根，并在其誘導(dǎo)的過程中將目的基因轉(zhuǎn)入毛狀根中。將轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行接種鑒定。實(shí)驗(yàn)證明，在接種15天后，轉(zhuǎn)基因陽性根內(nèi)的雌蟲數(shù)明顯少于對(duì)照植株根內(nèi)的雌蟲數(shù)；接種30天后，轉(zhuǎn)基因陽性毛狀根表面的胞囊數(shù)目也少于對(duì)照，且與對(duì)照相比，葉片無明顯的發(fā)病癥狀。表明該基因在大豆對(duì)胞囊線蟲的抗性中起一定的作用。在我國，尤其是在我國東北地區(qū)，由于濫墾、濫牧、濫砍濫伐等現(xiàn)象的日益加劇，使得耕地沙化、干旱及鹽堿地的面積逐年增加。由于大豆胞囊線蟲喜干旱、堿性的土壤環(huán)境 (濕度60%，pH 8. 0)，因此土地沙化、干旱及鹽堿地面積的擴(kuò)大造成了大豆胞囊病害的日益嚴(yán)重。因此克隆大豆胞囊線蟲抗性基因具有重要意義，不僅能有效指導(dǎo)常規(guī)育種，而且還可以為大豆的轉(zhuǎn)基因育種事業(yè)提供優(yōu)良的基因資源。因此，將本發(fā)明的基因在常規(guī)育種工作中導(dǎo)入到感大豆胞囊線蟲的品種中，可獲得對(duì)大豆胞囊線蟲具有抗性的大豆新品種，在大豆生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖lGml6上抗病基因簇內(nèi)基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果示意圖1 =SRC-J-I ；2 :SRC-J-2 ；3 :SRC-J-3 ；4 :SRC-J-4 ；5 :SRC-J-5 ；6 :SRC-J_6 ；M =Marker DL2000圖2SRC-J-6蛋白結(jié)構(gòu)的hterPrc^can分析示意3SRC-J-6半定量RT-PCR結(jié)果示意圖1 黑農(nóng)37葉子2 黑農(nóng)37根部3 =L-IO葉子4 =L-IO根部圖4SRC-J-6轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定示意圖1-8 植株 2、3、5、7、9、10、16、CK ;M1 :DL2000marker
圖5為發(fā)狀根品紅染色示意圖a 植株10 ；b 植株16 ；c 陰性對(duì)照；d 空白對(duì)照
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。DNA片段回收采用博大泰克公司回收試劑盒，并按其說明書進(jìn)行操作。所有無機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購自上海化學(xué)試劑廠，試劑均為國產(chǎn)分析純，引物由上海生工公司合成。Ependorf梯度式PCR擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司。植物材料大豆(Glycine maX(L. )Merrill.)抗胞囊線蟲品種‘L-10’，記載在王梓貞，大豆胞囊線蟲非小種特異性抗性品種的抗性評(píng)價(jià)與農(nóng)藝性狀相關(guān)分析，[J].大豆科學(xué)，2009， (04).中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。大豆(Glycine max (L. )Merrill.)感胞囊線蟲品種‘黑農(nóng)37’，記載在王彬如，高產(chǎn)大豆新品種黑農(nóng)37選育與推廣，[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，1993，(01).中。以感病品種黑農(nóng)37和本實(shí)驗(yàn)室選育的非特異抗性品系L-IO為親本，構(gòu)建的140 個(gè)F2 6和F2 7的重組自交系材料，記載在王梓貞，大豆胞囊線蟲非小種特異性抗性品種的抗性評(píng)價(jià)與農(nóng)藝性狀相關(guān)分析，[J].大豆科學(xué)，2009，(04).中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。大豆(Glycine max(L. ) Merri 11.)具有高轉(zhuǎn)化效率的品種‘東農(nóng)50’，記載在段瑩瑩，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)和下胚軸轉(zhuǎn)化方法的比較及優(yōu)化，[J]·大豆科學(xué)，2010，(04). 中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌株(保存編號(hào)ACCC10060)，由澳大利亞的Allen Kerr分離， 并由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，記載在Cho H J，High efficiencyinduction of soybean hairy roots and progagation of the soybean cyst nematode. Planta,2000, 210 :195-204.中。大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種采集自伊春大豆連作地塊。并由教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。記載在王梓貞，大豆胞囊線蟲非小種特異性抗性品種的抗性評(píng)價(jià)與農(nóng)藝性狀相關(guān)分析，[J].大豆科學(xué)，2009，(04).中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得NCPPB^559。大豆胞囊線蟲14號(hào)生理小種采集自黑龍江省農(nóng)科院大慶分院實(shí)驗(yàn)病圃，并由教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。記載在王梓貞，大豆胞囊線蟲非小種特異性抗性品種的抗性評(píng)價(jià)與農(nóng)藝性狀相關(guān)分析，[J].大豆科學(xué)，2009，(04).中，公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。pMD-18T vector,購自 TAKARA 公司。載體 pGFPGUS,記載在 Cho H J, High efficiency induction of soybean hairyroots and progagation ofthe soybean cyst nematode.Planta,2000,210 195-204.中。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶等均購自TAKARA公司。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
實(shí)施例1大豆抗胞囊線蟲基因核苷酸序列大豆胞囊線蟲抗性核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或?yàn)橄?)-3)任一所示，1)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO. 1限定的核苷酸序列能夠雜交且能夠表達(dá)的DNA分 子；2)與SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達(dá)的mRNA分 子；3)與SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達(dá)的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC,0. 5% SDS的溶液中，在65で下雜交，然后用2XSSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。擴(kuò)增以上任一所述DNA片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，例如SEQ ID NO. 3 與 SEQ ID NO. 4。SEQ ID NO. 2屬于與SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠 表達(dá)的DNA分子。實(shí)施例2大豆抗胞囊線蟲基因的獲得1.基因的克隆1)植物總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄分別取接種線蟲后12h的レ10、黑農(nóng)37的根部及 葉部組織，提取RNA，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，18S和^S RNA帶型清晰可辨，紫外分 光光度記檢測(cè)0D2e。/0D_比值在1. 9 2. O之間，說明RNA完整性好、純度高。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 參照promega ImProm-II (Promega)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作。2)抗病候選基因全長(zhǎng)序列的克隆分別以上述反轉(zhuǎn)錄的L-10、黑農(nóng)37的根部及 葉的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)好的基因特異引物(SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)并采用降落式 PCR的方法克隆目的基因。反應(yīng)的體系及程序如表1所示。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，鋒個(gè)樣品各 取Sii L進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增長(zhǎng)度與預(yù)期的產(chǎn)物長(zhǎng)度一致。表1抗病候選基因PCR反應(yīng)體系及程序
權(quán)利要求
1.一種大豆胞囊線蟲抗性基因，其特征在于核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，1)其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的核苷酸序列能夠雜交且能夠表達(dá)的DNA分子；3)與1)中所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達(dá)的mRNA分子；4)與1)中所述核苷酸序列具有90%以上同源性，且能夠表達(dá)的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述載體為用于克隆的pMDlS-T載體、 用于表達(dá)的pGFPGUS、pBI121、pCAMBIA載體或用于RNAi的pJawohl8載體。
4.含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述核苷酸序列所用的引物，其核苷酸序列如SEQID NO. 3及SEQ ID NO. 4 所示。
6.權(quán)利要求1所述核苷酸序列在植物組織中表達(dá)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物組織為根、莖、葉、花或種子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特在在于所述單子葉植物為煙草，所述雙子葉植物為擬南芥及任何栽培或者野生大豆。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)為過表達(dá)，通過含有大豆胞囊線蟲胞囊、蟲卵、幼蟲的試驗(yàn)土樣及溶液在溫室條件下進(jìn)行表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆胞囊線蟲抗性基因及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的cDNA片段(SRC-J-6)，來源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)品種L-10，其核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；2)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列能夠雜交且能夠表達(dá)的DNA分子；3)與1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能夠表達(dá)的mRNA分子；4)與1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能夠表達(dá)的DNA分子。將本發(fā)明公開的基因轉(zhuǎn)化植物組織后，能顯著提高轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)胞囊線蟲的抗性。本發(fā)明公開的大豆胞囊線蟲抗性基因具有重要意義，不僅能有效指導(dǎo)常規(guī)育種，而且還可以為大豆的轉(zhuǎn)基因育種事業(yè)提供優(yōu)良的基因資源，在大豆生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102206651SQ201110106658
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者?，|, 李文濱, 韓英鵬 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)