專利名稱：具有增加產(chǎn)量的植物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并關(guān)注用于增加植物產(chǎn)量的方法。更特別地，本發(fā)明涉及通過將細(xì)胞周期蛋白A的核酸，優(yōu)選地編碼細(xì)胞周期蛋白A蛋白的核酸導(dǎo)入植物來增加植物產(chǎn)量的方法，所述核酸有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。本發(fā)明也涉及在植物種子組織中具有增加的細(xì)胞周期蛋白A核酸表達(dá)和/或在植物種子組織中具有細(xì)胞周期蛋白A蛋白的經(jīng)調(diào)節(jié)的活性和/或水平的植物，該植物和相應(yīng)的野生型植物相比以及和相應(yīng)的其中組成型表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A的轉(zhuǎn)基因植物相比，具有增加的產(chǎn)量。
不斷增加的世界人口和農(nóng)業(yè)上可供利用的可耕作土地的供給不斷下降刺激了旨在提高農(nóng)業(yè)效率的農(nóng)業(yè)研究。常規(guī)的作物和園藝改進(jìn)方法使用選擇育種技術(shù)來鑒定具有理想特性的植物。然而，這樣的選擇育種技術(shù)具有幾個(gè)缺點(diǎn)，即這些技術(shù)通常非常費(fèi)力并且產(chǎn)生通常含有異源遺傳成分的植物，該異源遺傳成分并非總能引起可從親本植株傳遞的理想性狀。分子生物學(xué)上的進(jìn)步已使人類能夠修飾動(dòng)物和植物的種質(zhì)。植物的基因工程使得能夠進(jìn)行遺傳物質(zhì)(通常以DNA或RNA的形式)的分離和操作，以及隨后將該遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物。這樣的技術(shù)能夠產(chǎn)生具有各種改善的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)藝或園藝性狀的作物或植物。尤其具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的性狀是產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來自作物的可測量的產(chǎn)物經(jīng)濟(jì)值。這可以數(shù)量和/或質(zhì)量表示。產(chǎn)量直接依賴于幾個(gè)因素，例如器官的數(shù)量和大小、植物的結(jié)構(gòu)(例如，分枝的數(shù)目)、種子的產(chǎn)量等。根的發(fā)育、營養(yǎng)的吸收和壓力耐受性在確定產(chǎn)量上也是重量的因素。可通過優(yōu)化上述因素中的一種來增加作物產(chǎn)量，這種優(yōu)化可通過修飾植物的內(nèi)在生長機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。
植物的內(nèi)在生長機(jī)制存在于統(tǒng)稱為“細(xì)胞周期”的高度有序的事件序列中。通過細(xì)胞周期的推進(jìn)是所有多細(xì)胞生物的生長和發(fā)育所必需的，對(duì)細(xì)胞的增殖是至關(guān)重要的。細(xì)胞周期的主要組成成分在酵母、哺乳動(dòng)物和植物中是高度保守的。通常將細(xì)胞周期分為下列按順序發(fā)生的時(shí)期G0-G1-S-G2-M。DNA復(fù)制或合成通常發(fā)生在S期(“S”表示DNA合成)，而染色體的有絲分裂分離發(fā)生在M期(“M”表示有絲分裂)，其間間隔以間期，G1(DNA復(fù)制前細(xì)胞生長的時(shí)期)和G2(DNA復(fù)制后，細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期)。胞質(zhì)分裂(M期的最后步驟)后，細(xì)胞分裂完成。已退出細(xì)胞周期和已變成靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞被稱為處在G0期。可刺激處于該時(shí)期的細(xì)胞使之重新進(jìn)入細(xì)胞周期的G1期。G1、G2和G0中的“G”表示“間期”。細(xì)胞周期過程的完成使細(xì)胞分裂期間的子細(xì)胞接受親本基因組的完全拷貝。
細(xì)胞分裂由兩個(gè)主要的細(xì)胞周期事件即DNA合成的起始和有絲分裂的起始所控制。這些關(guān)鍵事件的每一個(gè)轉(zhuǎn)換均由特定蛋白復(fù)合物(參與DNA的復(fù)制和分裂)代表的關(guān)卡(checkpoint)控制。在哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞中，在G1/S邊界DNA合成所必需的基因的表達(dá)由轉(zhuǎn)錄因子的E2F家族調(diào)節(jié)(La Thangue，1994；Muller等人，2001；De Veylder等人.，2002)。細(xì)胞周期的進(jìn)入由E2F/Rb復(fù)合物調(diào)節(jié)/觸發(fā)，該復(fù)合物可整合信號(hào)并使細(xì)胞周期基因的轉(zhuǎn)錄能夠被激活。細(xì)胞周期的不同時(shí)期之間的轉(zhuǎn)換，和由此產(chǎn)生的通過細(xì)胞周期的推進(jìn)，是通過不同的異源二聚絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(通常稱作周期蛋白依賴性激酶(CDKs))的形成和激活來推動(dòng)的。這些激酶活性的前提條件是與特定的細(xì)胞周期蛋白的物理結(jié)合，激活的時(shí)間選擇主要依賴于細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合誘導(dǎo)結(jié)合的CDK的N端末瓣(N-terminal lobe)發(fā)生構(gòu)象變化，并促進(jìn)該復(fù)合物的定位和底物特異性。當(dāng)單體CDKs與周期蛋白結(jié)合時(shí)被激活，因此具有激酶活性。細(xì)胞周期蛋白水平在細(xì)胞周期中波動(dòng)，從而代表確定CDK活化的時(shí)間選擇的主要因子。這些在細(xì)胞周期中含有細(xì)胞周期蛋白和CDK的復(fù)合物的周期性活化介導(dǎo)了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換(關(guān)卡)的時(shí)間調(diào)控。其他調(diào)節(jié)CDK活性的因子包括CDK抑制劑(CKIs或ICKs、KIPs、CIPs、INKs)、激活CDK的激酶(CAKs)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亞基(CKS)(Mironov等人1999；Reed 1996)。
已描述擬南芥A型周期蛋白(A1、A2和A 3)(包含10種周期蛋白)的三個(gè)不同亞類。在Vandepoele等人.(The Plant Cell，Vol.14，903-916，April 2002)中已報(bào)道了兩個(gè)A1型基因(CYCA1；1和CYCA1；2)、四個(gè)A2型基因(CYCA2；1、CYCA2；2、CYCA2；3和CYCA2；4)、和四個(gè)A3型基因(CYCA3；1、CYCA3；2、CYCA3；3和CYCA3；4)。
國際申請(qǐng)WO 01/85946描述了幾種細(xì)胞周期蛋白，包括細(xì)胞周期蛋白As。已提到細(xì)胞周期蛋白可在農(nóng)業(yè)中用于改善植物的生長特性，例如特定組織或器官的生長速率或大小、植物的結(jié)構(gòu)或形態(tài)、增加的作物產(chǎn)量、提高的對(duì)環(huán)境逆境條件(例如干旱、鹽、溫度或營養(yǎng)缺乏)的耐受性、提高的對(duì)濫用細(xì)胞周期的植物病原體的耐受性或用作靶以幫助鑒定CCPs的抑制劑或激活劑，所述抑制劑或激活劑可用作除草劑或植物生長調(diào)節(jié)劑。
可通過許多方法增加產(chǎn)量，一些方法令人驚奇。例如，在20世紀(jì)60年代對(duì)小麥和水稻產(chǎn)量增加(所謂的綠色革命)作出貢獻(xiàn)的主要因素是植物高度的降低(Sakamoto和Matsuoka，Current Opinion inBiotechnology 2004，15144-147)。使用大量氮肥后，當(dāng)時(shí)的常規(guī)品種生長過高從而產(chǎn)生倒伏，導(dǎo)致顯著的產(chǎn)量損失。相反地，綠色革命的半矮縮品種，由于其較矮的株高，具有抗倒伏性，從而導(dǎo)致作物產(chǎn)量的加倍。
現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)可通過向植物中導(dǎo)入細(xì)胞周期蛋白A核酸，優(yōu)選地編碼細(xì)胞周期蛋白A蛋白的核酸來增加植物產(chǎn)量，該細(xì)胞周期蛋白A核酸有效地連接種子偏愛的啟動(dòng)子。在種子偏愛的啟動(dòng)子控制之下的細(xì)胞周期蛋白A核酸的表達(dá)導(dǎo)致比在植物中組成型表達(dá)的細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)時(shí)獲得的產(chǎn)量更高的產(chǎn)量。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將細(xì)胞周期蛋白A核酸，優(yōu)選地編碼細(xì)胞周期蛋白A蛋白的核酸導(dǎo)入植物，該細(xì)胞周期A核酸有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
本發(fā)明方法的實(shí)施導(dǎo)致增加的植物產(chǎn)量。此處定義的術(shù)語“增加的產(chǎn)量”包括和對(duì)照植物的生物量相比，植物一個(gè)或多個(gè)部分的生物量(重量)有增加。該術(shù)語也包括種子產(chǎn)量的增加，包括各和對(duì)照植物相比，種子生物量(種子重量)上的增加和/或種子(飽滿的)數(shù)量上的增加和/或種子大小上的增加和/或種子體積上的增加。種子大小和/或體積上的增加也可影響種子的組成。種子產(chǎn)量的增加可由花的數(shù)目和/或大小的增加造成。產(chǎn)量上的增加也可提高收獲指數(shù)，其表示為總生物量對(duì)可收獲部分例如種子的產(chǎn)量的比例。產(chǎn)量的增加也可提高千粒重(thousand Kernel weight，TKW)，其可通過計(jì)數(shù)得到的飽滿種子數(shù)目和其總重量推算出來。
以玉米為例子，產(chǎn)量的增加可以下列的一個(gè)或多個(gè)方面來表現(xiàn)每公頃或英畝的植物數(shù)量的增加、每顆植物的穗數(shù)目的增加、行(rows)數(shù)、每行粒數(shù)、粒重、千粒重、穗長/直徑的增加等。以水稻為例，產(chǎn)量的增加可通過下列的一個(gè)或多個(gè)方面的增加來表現(xiàn)每公傾或英畝的植物數(shù)量、每顆植物的圓錐花序(panicle)數(shù)目、每圓錐花序上的小穗數(shù)量、每圓錐花序的花數(shù)量的增加、種子飽滿率的增加、千粒重的增加等。
在雜交植物中可進(jìn)一步增加產(chǎn)量或可進(jìn)一步評(píng)估產(chǎn)量。作物例如玉米通常以雜種進(jìn)行銷售。田間作物育種的目的是將存在于單個(gè)品種或雜種中的各種想要的性狀組合起來。通過利用植物的授粉方法(自花授粉，如在水稻的情況下，或異花授粉，如在玉米的情況下)的不同技術(shù)進(jìn)行育種。谷物的育種通常包括自花授粉和異花授粉步驟。以玉米為例，新品種的產(chǎn)生通常需要近交親本系的開發(fā)、選擇和生產(chǎn)，所述近交親本系隨后用于生產(chǎn)具有某些想要的特性的雜交玉米。因此，玉米雜種的開發(fā)要求純合近交系的開發(fā)、這些系的雜交和對(duì)這些雜交(雜種)的評(píng)估。然后可通過雜交(基因?qū)?或通過轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行的分子導(dǎo)入來導(dǎo)入想要的性狀。為確定產(chǎn)物的田間表現(xiàn)，可對(duì)純合的近交植物的純合群體或?qū)蓚€(gè)純合近交系之間的雜種進(jìn)行新作物的評(píng)估。上述技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的。
更特別地，增加的產(chǎn)量以下列的一個(gè)或多個(gè)方面來表現(xiàn)各自和對(duì)照植物相比，種子重量增加、飽滿種子數(shù)目增加、種子數(shù)目增加、種子大小增加、收獲指數(shù)增加、千粒重增加和經(jīng)修飾的種子組成。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，其中增加的植物產(chǎn)量選自下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)各自和對(duì)照植物相比，種子重量增加、飽滿種子數(shù)目增加、種子數(shù)目增加、種子大小增加、收獲指數(shù)增加、千粒重增加和經(jīng)修飾的種子組成，該方法包括將細(xì)胞周期蛋白A核酸，優(yōu)選地編碼細(xì)胞周期蛋白A蛋白的核酸導(dǎo)入植物，該細(xì)胞周期蛋白A核酸有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
因?yàn)楸景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)量，因此和對(duì)照植物在其生命周期的相應(yīng)階段的生長速率相比，這些植物可能表現(xiàn)生長速率增加(在其生命周期的至少部分時(shí)期)。增加的生長速率對(duì)于植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)可以是特異的，或可以是基本上在整個(gè)植株上都如此。在種子特別是谷物種子的情況下，種子的成熟可能與完整地存在于植物上的種子的水分含量有關(guān)。因此，和對(duì)照植物相比，提供種子成熟指征的含水量也是種子生長速率的一個(gè)指征。對(duì)于任意給定的植物品種，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道表示種子可以收獲的含水量?？墒褂靡阎募夹g(shù)測量含水量。
此外，生長速率的增加可在植物生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段上或基本上在整個(gè)植物生命周期中發(fā)生。在植物生命周期的早期階段生長速率增加可反映增加的活力。
生長速率的增加可改變植物的收獲周期，使得植物可能可以比生長速率未增加的植物更遲播種和/或更早收獲。此處定義的術(shù)語“收獲周期”是指植物的播種和收獲之間的時(shí)間。如果生長速率充分增加，可允許再次播種相同植物品種的種子(例如播種和收獲水稻植物后接著再次播種和收獲水稻植物都在一個(gè)常規(guī)的生長周期內(nèi))。類似地，如果生長速率充分增加，可能可以再次播種不同植物品種的種子(例如播種和收獲水稻植物后，播種和任選地收獲大豆、土豆或任何其他合適的植物)。在一些植物的情況下，對(duì)相同根狀莖的收獲可在一年中的額外時(shí)間發(fā)生。改變植物收獲周期的可能性可導(dǎo)致每英畝年生物量產(chǎn)量的增加(由于可生長和收獲任何特定植物的次數(shù)(比如一年內(nèi))增加)。生長速率的增加也可使轉(zhuǎn)基因植物在比其野生型對(duì)應(yīng)物生長的地理范圍更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行栽培，因?yàn)樵耘嘀参锏牡赜蛳拗仆ǔＳ稍诜N植時(shí)間(早季節(jié))或收獲時(shí)間(晚季節(jié))上的不利環(huán)境條件確定。如果收獲周期縮短，那么可避免這些不利的條件。
生長速率也可通過從描繪生長實(shí)驗(yàn)的生長曲線推導(dǎo)出各種參數(shù)來確定，這些參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大尺寸的50％所用的時(shí)間)和T-90(植物達(dá)到其最大尺寸的90％所用的時(shí)間)，等等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明方法的實(shí)施產(chǎn)生生長速率改變的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增加植物生長速率的方法，該方法包括將細(xì)胞周期蛋白A核酸、優(yōu)選地編碼細(xì)胞周期蛋白A蛋白的核酸導(dǎo)入植物，該細(xì)胞周期蛋白A核酸有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
產(chǎn)量和/或生長速率的增加也包括，和對(duì)照植物相比，在非壓力條件下和在逆境條件下植物有更好的表現(xiàn)。植物通常以更慢地生長來對(duì)暴露于逆境作出反應(yīng)。在嚴(yán)重的逆境條件下，植物可完全停止生長。另一方面，中度的逆境此處定義為這樣的任何逆境，其中在該逆境條件下植物不完全停止生長。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐的進(jìn)步(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)，通常在栽培作物植物中不會(huì)遇到嚴(yán)重的逆境。因此，由中度逆境誘導(dǎo)的生長降低常常是不想要的農(nóng)業(yè)特性。中度逆境是植物可能遇到的典型逆境。這些逆境可以是植物面臨的日常生物和/或非生物逆境。典型的非生物或環(huán)境逆境包括由非典型的熱或冷/嚴(yán)寒溫度造成的溫度逆境、鹽逆境、水逆境(干旱或過多的水)。非生物逆境也可由化學(xué)物質(zhì)引起。生物逆境通常是由病原體例如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲導(dǎo)致的逆境。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，要導(dǎo)入植物的細(xì)胞周期蛋白A是A2型細(xì)胞周期蛋白，優(yōu)選地是細(xì)胞周期蛋白A22。
此處定義的“細(xì)胞周期蛋白A核酸”是指編碼這樣的蛋白的核酸，其在天然形式下包含基元1，該基元1表示為W L V/I E V S/A D/ED/E Y K/R/T L(基元1)，其中反斜線(/)表示‘或’，即其中‘V/I’表示V或I。氨基酸序列中基元1的存在使所述序列可被鑒定為細(xì)胞周期蛋白A而不是任何其他類型的細(xì)胞周期蛋白。
此處定義的術(shù)語“細(xì)胞周期蛋白A2核酸”是編碼這樣的蛋白的任何核酸，其在天然的形式下包含上面鑒定的基元1，并另外地包含基元2，所述基元2表示為E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/GF R/L L/R/K/N F L P S(基元2)，其中所鑒定的殘基(--T-----F--F---)(和上面下劃線標(biāo)出的)中的至少兩個(gè)殘基的存在可使序列被鑒定為A2型細(xì)胞周期蛋白而不是任何其他的細(xì)胞周期蛋白A。上面的破折號(hào)(-)表示氨基酸殘基，其中一個(gè)破折號(hào)等同于在基元2中對(duì)應(yīng)位置上的一個(gè)氨基酸殘基。
此處定義的術(shù)語“細(xì)胞周期蛋白A2；2核酸”是編碼這樣的蛋白的任何細(xì)胞周期蛋白A核酸，其中所述蛋白按不斷增加的優(yōu)選順序編碼與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性或相似性的任何細(xì)胞周期蛋白A核酸。
此處定義的“細(xì)胞周期蛋白A氨基酸”或“細(xì)胞周期蛋白A蛋白”是指這樣的氨基酸，其在天然形式中包含基元1，所述基元1表示為W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L(基元1)，其中反斜線(/)表示‘或’，即其中‘V/I’表示V或I。氨基酸序列中基元1的存在使該序列被鑒定為細(xì)胞周期蛋白A而不是鑒定為任何其他類型的周期蛋白。
此處定義的術(shù)語“細(xì)胞周期蛋白A2氨基酸”或“細(xì)胞周期蛋白A2蛋白”是任何這樣的氨基酸，其在天然形式中包含如上所鑒定的基元1和另外地包含基元2，所述基元2表示為E L T L V/I/T/M D/E/MY T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S(基元2)，其中經(jīng)鑒定的殘基(--T-----F--F---)(和上面下劃線標(biāo)出的)中的至少兩個(gè)殘基的存在使序列被鑒定為A2型周期蛋白而不是任何其他的細(xì)胞周期蛋白A。上面的破折號(hào)(-)表示氨基酸殘基，其中一個(gè)破折號(hào)等同于在基元2中對(duì)應(yīng)位置上的一個(gè)氨基酸殘基。
此處定義的術(shù)語“細(xì)胞周期蛋白A2；2氨基酸”或“細(xì)胞周期蛋白A2；2蛋白”是指這樣的細(xì)胞周期蛋白A，即該蛋白按逐漸增加的優(yōu)選順序與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同源性。
被導(dǎo)入植物的細(xì)胞周期蛋白A核酸可來源于任何來源，只要該核酸在植物種子組織中過量表達(dá)時(shí)導(dǎo)致增加的植物產(chǎn)量即可。被導(dǎo)入植物的核酸可分離自微生物來源，例如細(xì)菌、酵母或真菌，或分離自植物、藻類或動(dòng)物來源。通過有意的人工操作，該核酸在組成和/或基因組環(huán)境方面由其天然形式得到實(shí)質(zhì)性修飾。所述核酸序列優(yōu)選地是同源核酸序列，即從植物獲得的核酸序列，無論來自相同的植物品種還是來自不同的品種。核酸序列可分離自單子葉植物或雙子葉植物品種，優(yōu)選地分離自十字花科(Brassicaceae)家族，更優(yōu)選地分離自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。最優(yōu)選地，細(xì)胞周期蛋白A是A2型周期蛋白，例如細(xì)胞周期蛋白A2；1、A2；2、A2；3或A2；4。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞周期蛋白A2；2由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2表示。
盡管本發(fā)明由SEQ ID NO1所示的核酸和由SEQ ID NO2所示的氨基酸舉例說明，也可使用細(xì)胞周期蛋白A氨基酸變體和細(xì)胞周期蛋白A核酸變體來進(jìn)行所述方法。
用于實(shí)踐本發(fā)明方法的核酸和氨基酸序列變體包括(i)細(xì)胞周期蛋白A核酸的功能性部分；(ii)能夠和細(xì)胞周期蛋白A核酸/基因雜交的序列；(iii)細(xì)胞周期蛋白A核酸/基因的變通剪接變體；(iv)細(xì)胞周期蛋白A核酸/基因的等位基因變體；(v)由遺傳密碼簡并性產(chǎn)生的變體；和(vi)細(xì)胞周期蛋白A蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
此處所用的術(shù)語“核酸”包括互補(bǔ)鏈和對(duì)應(yīng)的RNA、DNA、cDNA和基因組DNA。核酸可以是雙鏈的或單鏈的。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的是全長細(xì)胞周期蛋白A DNA序列不是進(jìn)行本發(fā)明方法的先決條件，也可使用細(xì)胞周期蛋白A的核酸的功能性部分。功能性部分是指來源于原始(更大的)DNA分子或從中制備的DNA片段，所述功能性DNA部分當(dāng)導(dǎo)入植物并在植物中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生具有產(chǎn)量增加的植物。該部分可包含許多具有或不具有額外控制元件的基因，或可以只包含間隔序列。使用常規(guī)技術(shù)可容易地確定適合用于本發(fā)明方法的部分。例如，可對(duì)SEQ ID NO1的核酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)缺失和/或截短而不影響其在本發(fā)明的方法中執(zhí)行功能的能力。使用常規(guī)技術(shù)，例如通過測定細(xì)胞周期蛋白A的活性和/或按照實(shí)施例部分描述的方法通過簡單地用待測定其功能性的部分替代真實(shí)實(shí)例中所用的序列，可容易地確定適合用于本發(fā)明方法的部分。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的部分能夠編碼包含基元1和優(yōu)選地另外包含基元2的蛋白。更優(yōu)選地，所述部分是由SEQ ID NO1所示的細(xì)胞周期蛋白A核酸的部分。
因此，根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將細(xì)胞周期蛋白A核酸(優(yōu)選地SEQ ID NO1所示的核酸)的功能性部分導(dǎo)入植物，該功能性部分有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
能夠和細(xì)胞周期蛋白A核酸(例如由SEQ ID NO1所示的核酸)雜交的序列也可用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。此處定義的術(shù)語“雜交”是指這樣的過程，其中基本上同源互補(bǔ)的核苷酸序列相互退火。雜交過程可完全在溶液中(即兩條互補(bǔ)核酸都在溶液中)進(jìn)行。依賴于該過程的分子生物學(xué)方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；和所有基于此的方法)、減法雜交(subtractive hybridisation)、隨機(jī)引物延伸、S1核酸酶作圖(nuclease S1 mapping)、引物延伸、逆轉(zhuǎn)錄、cDNA合成、RNAs的差異顯示(differential display of RNAs)和DNA序列的確定。也可用固定在基質(zhì)例如磁珠、瓊脂糖珠或任何其他樹脂上的互補(bǔ)核酸之一進(jìn)行雜交過程。依賴于該過程的分子生物學(xué)方法包括poly(A+)mRNA的分離。另外，可通過用固定在固體支持物例如硝酸纖維素或尼龍膜上或通過例如光刻法固定在例如硅玻璃支持物(后者稱為核酸陣列或微陣列或稱為核酸芯片)上的互補(bǔ)核酸之一來進(jìn)行雜交過程。依賴于該過程的分子生物學(xué)方法包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交(colony hybridization)、噬菌斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了使雜交能夠發(fā)生，通常對(duì)核酸分子進(jìn)行熱或化學(xué)變性以使雙鏈解鏈形成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)緊度受條件例如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成影響。用于雜交的高嚴(yán)緊條件包括高溫和/或低鹽濃度(鹽包括NaCl和檸檬酸三鈉)和/或雜交緩沖液中甲酰胺的存在和/或降低雜交緩沖液中的化合物例如SDS(去垢劑)的濃度和/或從雜交緩沖液中除去化合物例如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促進(jìn)分子聚集)。常規(guī)的雜交條件描述于例如Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York中，但本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到可根據(jù)核酸序列的已知或預(yù)期同源性和/或長度來設(shè)計(jì)許多不同的雜交條件。低嚴(yán)緊雜交條件對(duì)分離與前面定義的本發(fā)明DNA序列異源的核酸是特別優(yōu)選的。低嚴(yán)緊條件的例子是在37-45℃下在4-6x SSC/0.1-0.5％w/v SDS中進(jìn)行2-3小時(shí)。依賴于參與雜交的核酸的來源和濃度，可使用另外的嚴(yán)緊條件，例如中等嚴(yán)緊條件。中等嚴(yán)緊條件的例子包括在1-4x SSC/0.25％w/v SDS中在≥45℃下進(jìn)行2-3小時(shí)。高度嚴(yán)緊條件的例子包括在0.1-1xSSC/0.1％w/v SDS中在60℃進(jìn)行1-3小時(shí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在雜交和洗滌期間可改變的以及可維持或改變嚴(yán)緊條件的各種參數(shù)。引起異源性的因素包括等位性、遺傳密碼的簡并性和偏愛密碼子用法上的差異。
能夠和細(xì)胞周期蛋白A核酸例如SEQ ID NO1所示的核酸雜交的優(yōu)選序列是能夠編碼包含基元1和優(yōu)選地另外包含基元2的蛋白的雜交序列。使用常規(guī)技術(shù)，例如通過測定細(xì)胞周期蛋白A的活性和/或按照實(shí)施例部分描述的方法通過簡單地用待測試其功能性的雜交序列替代真實(shí)實(shí)例中所用的序列，可容易地確定適合用于本發(fā)明方法的雜交序列。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施方案，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將能夠和在上文中定義的細(xì)胞周期蛋白A核酸，優(yōu)選地與SEQ ID NO1所示的細(xì)胞周期蛋白A核酸雜交的核酸導(dǎo)入植物，該雜交序列有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
也可使用細(xì)胞周期蛋白A核酸(例如SEQ ID NO1所示的核酸)的變通剪接變體實(shí)踐本發(fā)明的方法。此處使用的術(shù)語“變通剪接變體”包括這樣的核酸序列變體，其中已切除、替換或加入了選定的內(nèi)含子和/或外顯子。這些變體可以是這樣的變體，其中蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性未受影響，這可通過選擇性地保留由該核酸編碼的蛋白的功能性片段來實(shí)現(xiàn)。這樣的剪接變體可能在自然界中存在，或者可以人工制備。用于制備這些剪接變體的方法在本領(lǐng)域是已知的。優(yōu)選的剪接變體編碼包含基元1和優(yōu)選地另外包含基元2的蛋白。使用常規(guī)技術(shù)，例如通過測定細(xì)胞周期蛋白A的活性和/或按照實(shí)施例部分描述的方法通過簡單地用待測試其功能性的剪接變體替代真實(shí)實(shí)例中所用的序列，可容易地確定適合用于本發(fā)明方法的細(xì)胞周期蛋白A核酸的剪接變體。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施方案，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將細(xì)胞周期蛋白A核酸的剪接變體，優(yōu)選地SEQ ID NO1所示核酸序列的剪接變體導(dǎo)入植物，該剪接變體有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
有利地，也可使用細(xì)胞周期蛋白A核酸的等位基因變體，優(yōu)選地SEQ ID NO1所示細(xì)胞周期蛋白A核酸的等位基因變體，來實(shí)踐本發(fā)明的方法。等位基因變體存在于自然界中，本發(fā)明的方法包括這些天然等位基因的用途。等位基因變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNPs)以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDELs)。INDELs的大小通常小于100bp。SNPs和INDELs構(gòu)成了大多數(shù)生物天然存在的多態(tài)品系(strain)中的最大序列變體集合。優(yōu)選的等位基因變體編碼含有基元1和優(yōu)選地另外含有基元2的蛋白。使用常規(guī)技術(shù)，例如通過測定細(xì)胞周期蛋白A的活性和/或按照實(shí)施例部分描述的方法通過簡單地用待測試其功能性的等位基因變體替代真實(shí)實(shí)例中所用的序列，可容易地確定適用于本發(fā)明方法的細(xì)胞周期蛋白A核酸的等位基因變體。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將細(xì)胞周期蛋白A核酸的等位基因變體，優(yōu)選地SEQ ID NO1所示細(xì)胞周期蛋白A核酸的等位基因變體導(dǎo)入植物，該等位基因變體有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
細(xì)胞周期蛋白A氨基酸變體的例子包括SEQ ID NO2所示細(xì)胞周期蛋白A的同源物、衍生物和活性片段。
細(xì)胞周期蛋白A蛋白的“同源物”包括，相對(duì)于未經(jīng)修飾的所針對(duì)蛋白，具有氨基酸替代、缺失和/或插入并且具有與該未經(jīng)修飾的蛋白相似的生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶，所述未經(jīng)修飾的蛋白是其來源蛋白。為產(chǎn)生這些同源物，可用具有相似特性(例如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或斷裂α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的其他氨基酸替代該蛋白的氨基酸。保守替代表在本領(lǐng)域是熟知的(參見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freemanand Company)。優(yōu)選地，同源物按逐漸增加的優(yōu)選順序與SEQ ID NO2所示細(xì)胞周期蛋白A具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性(功能性同一性)。具有至少40％序列同一性的同源物包括細(xì)胞周期蛋白As，而不包括任何其他的細(xì)胞周期蛋白種類。
同源物的兩種特殊形式，直系同源物(ortholog)和旁系同源物(paralog)，是用于描述基因的祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語“旁系同源”涉及物種基因組內(nèi)產(chǎn)生旁系同源基因的基因重復(fù)。術(shù)語“直系同源”涉及因祖先關(guān)系的原因而存在于不同生物體中的同源基因。
例如，通過進(jìn)行所謂的交互式基本局部比對(duì)工具搜索(reciprocal blast search)可容易地發(fā)現(xiàn)單子葉植物物種中的直系同源物?？赏ㄟ^第一次基本局部比對(duì)來進(jìn)行該方案，其包括將所關(guān)注序列(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫例如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上找到的公共可獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基本局部比對(duì)。如果搜索水稻中的直系同源物，則將關(guān)注序列對(duì)例如在NCBI上可獲得的來自日本晴水稻(Oryza sativa Nipponbare)的28，469個(gè)全長cDNA克隆進(jìn)行基本局部比對(duì)。當(dāng)從核苷酸著手進(jìn)行比較時(shí)可使用BLASTn，或者，當(dāng)從蛋白開始時(shí)可使用TBLASTX，其中使用標(biāo)準(zhǔn)的默認(rèn)值(期望值10，比對(duì)值50)?？蛇^濾基本局部比對(duì)結(jié)果。然后反過來將經(jīng)過濾的結(jié)果或未經(jīng)過濾的結(jié)果的全長序列再對(duì)關(guān)注序列(SEQ ID NO1或2)進(jìn)行基本局部比對(duì)(第二次基本局部比對(duì))。然后比較第一和第二次基本局部比對(duì)的結(jié)果。在大家族的情況下，使用ClustalW，然后使用相鄰連接樹(neighbour joining tree)幫助顯示聚類。細(xì)胞周期蛋白A直系同源物的例子包括在下列錄入號(hào)下登載的序列在蛋白質(zhì)錄入號(hào)AK106653(A3型細(xì)胞周期蛋白)下登載的水稻直系同源物、在蛋白質(zhì)錄入號(hào)BAA86628(A1型細(xì)胞周期蛋白)下登載的水稻直系同源物和在錄入號(hào)AAC50013下登載的玉米直系同源物。
此處所用的術(shù)語“同源物”也包括可用于本發(fā)明方法中的蛋白的旁系同源物和直系同源物。
蛋白的“替代性變體”是指這樣的蛋白，其中氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基已被去除并且在其位點(diǎn)上插入了不同的殘基。氨基酸替代通常是單一殘基替代，但可以是成簇的氨基酸替代，這依賴于多肽上所置的功能性限制；插入通常是大約1至10個(gè)氨基酸殘基，而缺失通常在大約1至20個(gè)殘基的范圍內(nèi)變動(dòng)。優(yōu)選地，氨基酸替代包括保守性氨基酸替代。
蛋白的“插入變體”是指這樣的蛋白，其中在蛋白質(zhì)的預(yù)先確定的位點(diǎn)上引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入可包括氨基末端和/或羧基末端融合以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的序列內(nèi)插入。通常，氨基酸序列內(nèi)的插入比氨基或羧基末端融合短，大約為1-10個(gè)殘基。氨基或羧基末端融合蛋白或肽的例子包括用于酵母雙雜交系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體衣殼蛋白、(組氨酸)6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag100表位、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
蛋白的“缺失變體”的特征在于從該蛋白上去除一或多個(gè)氨基酸。使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，例如固相肽合成法等，或通過重組DNA操作，可容易地制備蛋白的氨基酸變體。用于操作DNA序列以產(chǎn)生蛋白的替代、插入或缺失變體的方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，用于在DNA中預(yù)先確定的位點(diǎn)上產(chǎn)生替代突變的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，其包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定點(diǎn)誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其他定點(diǎn)誘變方案。
用于細(xì)胞周期蛋白A同源物的搜索和鑒定的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。用于比較的序列比對(duì)方法在本領(lǐng)域是熟知的，這些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443-453，1970)的算法以找出兩個(gè)完整序列的比對(duì)，該比對(duì)使匹配的數(shù)目最大化并使缺口的數(shù)目最小化。BLAST算法用于計(jì)算兩個(gè)序列之間的百分比序列同一性和進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(National Centre for BiotechnologyInformation)公開獲得。
術(shù)語“衍生物”是指和細(xì)胞周期蛋白A(例如SEQ ID NO2所示的蛋白)氨基酸序列相比，包含天然和非天然發(fā)生的氨基酸殘基的替代、缺失或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶。細(xì)胞周期蛋白A蛋白的“衍生物”包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶，其與該多肽的天然發(fā)生形式的氨基酸序列相比，可包含天然發(fā)生的改變的、糖基化的、乙?；幕蚍翘烊话l(fā)生的氨基酸殘基。衍生物和其來源氨基酸序列相比，也可包含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸替代，例如報(bào)告分子或其他配體，其與該氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，例如結(jié)合其上以促進(jìn)其檢測的報(bào)告分子還可包含和天然發(fā)生蛋白的氨基酸序列相比包含非天然發(fā)生的氨基酸殘基。
細(xì)胞周期蛋白A蛋白的“活性片段”包含至少基元1和優(yōu)選地另外包含基元2，并保持和天然發(fā)生蛋白相似的生物學(xué)和/或功能性活性。
用包含目的序列(即細(xì)胞周期蛋白A核酸)的載體轉(zhuǎn)化植物，所述序列有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施方案，提供了這樣的構(gòu)建體，其包含(i)細(xì)胞周期蛋白A核酸；(ii)種子偏愛的啟動(dòng)子；和可選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
細(xì)胞周期蛋白A核酸可以是任何前述的細(xì)胞周期蛋白A序列，包括細(xì)胞周期蛋白A變體序列。在下文中定義了合適的種子偏愛的啟動(dòng)子。
術(shù)語“調(diào)控元件”、“控制序列”和“啟動(dòng)子”在此都可互換使用，并且在廣義上是指能夠影響和其連接的序列表達(dá)的調(diào)控核酸序列。此處使用的術(shù)語“有效連接的”是指啟動(dòng)子序列和目的基因之間的功能性連接，使得啟動(dòng)子序列能夠起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。
前述術(shù)語包括來源于經(jīng)典的真核細(xì)胞基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)和額外的調(diào)控元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)，其可響應(yīng)于發(fā)育和/或外部刺激或者以組織特異性的方式來改變基因表達(dá)。所述術(shù)語還包括經(jīng)典的原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在該情況下，其可包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語“調(diào)控元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其在細(xì)胞、組織或器官中提供、激活或增強(qiáng)核酸分子的表達(dá)。
有利地，可使用任何種子偏愛的啟動(dòng)子進(jìn)行本發(fā)明的方法。在本發(fā)明的上下文中，種子偏愛的啟動(dòng)子是主要在種子組織中具有活性但不一定只在種子組織中具有活性的啟動(dòng)子。種子組織包括種子的任何部分，包括種殼、糊粉層、胚乳(對(duì)單子葉植物和胚乳雙子葉植物(endospermic dicots)來說)、胚(對(duì)于單子葉植物來說包括盾蓋、外胚葉、胚芽、胚根；對(duì)于雙子葉植物來說包括子葉、下胚軸和胚根)。用于實(shí)踐本發(fā)明方法的優(yōu)選的啟動(dòng)子是在胚乳中具有活性的啟動(dòng)子，例如來自水稻的α球蛋白啟動(dòng)子、燕麥球蛋白啟動(dòng)子、水稻或小麥谷蛋白啟動(dòng)子、blz2、水稻轉(zhuǎn)錄因子RISBZ1。特別優(yōu)選的是在胚乳中具有活性的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子優(yōu)選地在萌發(fā)期間和萌芽之后具有活性，例如來自水稻的谷醇溶蛋白(prolamin)啟動(dòng)子。
下述表1中列出了適于實(shí)施本發(fā)明方法的啟動(dòng)子實(shí)例。
表1種子偏愛的啟動(dòng)子
任選地，也可在導(dǎo)入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列。術(shù)語“終止子”包括這樣的控制序列，其是轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，其為初始轉(zhuǎn)錄物的3’加工和聚腺苷?；约稗D(zhuǎn)錄的終止提供信號(hào)。其他的調(diào)控元件可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可適合用于進(jìn)行本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些序列或可容易地獲得這些序列。
本發(fā)明的基因構(gòu)建體可進(jìn)一步包括復(fù)制序列起點(diǎn)，其是在特定細(xì)胞類型中保持和/或復(fù)制所需的序列。一個(gè)例子是當(dāng)基因構(gòu)建體需要在細(xì)菌細(xì)胞中作為游離體遺傳成分(例如質(zhì)?；蛘沉７肿?保持時(shí)的情況。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括，但不限于f1-ori和colE1。
基因構(gòu)建體可選地包含選擇標(biāo)記基因。如此處所用的，術(shù)語“選擇標(biāo)記基因”包括為它在其中表達(dá)的細(xì)胞提供表型以幫助鑒定和/或選擇被本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的任何基因。合適的標(biāo)記可選自提供抗生素或殺蟲劑抗性或?qū)胄碌拇x性狀或允許視覺選擇的標(biāo)記。因而含有重組DNA的細(xì)胞能夠在殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗生素或殺蟲劑濃度存在的情況下存活。選擇標(biāo)記基因的例子包括提供對(duì)殺蟲劑Basta的抗性的bar基因；提供對(duì)抗生素卡那霉素的抗性的npt基因；提供潮霉素抗性的hpt基因。視覺標(biāo)記，例如綠色熒光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或熒光素酶，也可用作選擇標(biāo)記。
通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)可構(gòu)建用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體?？蓪⒒驑?gòu)建體插入載體，所述載體可商購獲得，適合用于轉(zhuǎn)化入植物和適合用于在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)目的基因。
可將細(xì)胞周期蛋白A蛋白自身和/或細(xì)胞周期蛋白核酸自身直接導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物本身(包括導(dǎo)入組織、器官或植物的任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的特性，優(yōu)選地通過轉(zhuǎn)化將核酸導(dǎo)入植物。
此處提到的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞，而與用于轉(zhuǎn)移的方法無關(guān)。能夠進(jìn)行后續(xù)無性繁殖的植物組織，無論是器官發(fā)生的還是胚發(fā)生的，都可用本發(fā)明的基因構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化并由此生成整株植物。所選擇的特定組織可依賴于可獲得的用于和最適合于待轉(zhuǎn)化的特定品種的無性繁殖系統(tǒng)而變。示例性組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、已有的分生組織(例如，頂端分生組織、腋芽、和根分生組織)、和誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可被瞬時(shí)或穩(wěn)定地導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并可保持非整合形式，例如作為質(zhì)粒保持?；蛘撸湟部杀徽先胨拗骰蚪M。然后可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將所得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞用于再生轉(zhuǎn)化植物。
現(xiàn)在植物物種的轉(zhuǎn)化是非常常規(guī)的技術(shù)。有利地，可將幾種轉(zhuǎn)化方法中的任一種用于把目的基因?qū)牒线m的祖先細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝入的化學(xué)物質(zhì)、將DNA直接注射入植物、顆粒槍轟擊法、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化法和顯微注射法。方法可選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等人，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.等人，1985Bio/Technol 3，1099-1102)；向植物材料顯微注射(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；包被DNA或RNA的顆粒轟擊法(Klein T.M.等人，1987，Nature 327，70)；使用(非整合)病毒的感染法等。在水稻轉(zhuǎn)化的情況下，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法是按照Hiei等有關(guān)人.1994的方案。對(duì)于玉米轉(zhuǎn)化，包括玉米組織的基于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化的方法之前已在EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676中進(jìn)行了描述。優(yōu)選的高效轉(zhuǎn)化玉米的方法是描述于Ishilda等人(High efficiency transformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens.NatBiotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)和描述于Frame等人(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maizeembryos using a standard binary Vector system.Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)中的方案。
通常在轉(zhuǎn)化后，就一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的存在與否選擇植物細(xì)胞或細(xì)胞群(所述標(biāo)記是由和目的基因一起共轉(zhuǎn)化的植物可表達(dá)基因編碼的)，然后將該被轉(zhuǎn)化材料再生成完整的植株。
在DNA轉(zhuǎn)移和再生后，可使用例如Southern分析法就目的基因的存在與否、拷貝數(shù)和/或基因組的組織對(duì)推定的轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行評(píng)估。可選擇地或另外地，可使用Northern和/或Western分析法監(jiān)控新導(dǎo)入的DNA的表達(dá)水平，這兩個(gè)技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是熟知的。
可通過各種方法，例如通過無性繁殖或經(jīng)典的育種技術(shù)，來繁殖產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物。例如，可將第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物自交以產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，然后通過經(jīng)典的育種技術(shù)將T2植物進(jìn)行進(jìn)一步繁殖。
所生成的轉(zhuǎn)化生物可采用多種形式。例如，其可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；無性繁殖的轉(zhuǎn)化體(例如，所有細(xì)胞被轉(zhuǎn)化而含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化組織的嫁接物(例如，在植物中，被轉(zhuǎn)化的砧木(rootstock)嫁接未轉(zhuǎn)化的接穗)。
很明顯本發(fā)明擴(kuò)展至由此處描述的任一方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，并擴(kuò)展至其所有植物部分和繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展至包括通過前述方法中任一種方法產(chǎn)生的初級(jí)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織或整株植物的后代，唯一的要求是后代表現(xiàn)出和通過本發(fā)明的方法在親本中產(chǎn)生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明也包括含有分離的細(xì)胞周期蛋白A核酸分子，優(yōu)選地編碼細(xì)胞周期蛋白A蛋白的核酸分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明也擴(kuò)展至植物的可收獲部分，例如、但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖培養(yǎng)物、莖、根莖、根、塊莖和球莖。
此處所用的術(shù)語“植物”包括完整的植物、植物的祖先和后代以及植物的部分，包括種子、枝條、莖、根(包括塊莖)和植物細(xì)胞、組織和器官。因此術(shù)語“植物”也包括懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、種子、根、枝條、配子體、孢子體、花粉和小孢子。
在本發(fā)明中特別有用的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族特別是單子葉植物和雙子葉植物的所有植物，包括選自下述的飼料或豆科飼料、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木金合歡(Acaciaspp.)、槭(Acers pp.)、獼猴桃(Actinidia spp.)、七葉樹(Aesculusspp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis astralis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、Andropogon spp.、落花生(Arachis spp)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鷹嘴紫云英(Astragaluscicer)、多小葉紅蘇木(Baikiaea plurijuga)、樺木(Betula spp.)、蕓苔(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkeaafricana、紫鉚樹(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱櫻花(Calliandra spp)、茶樹(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒(Capsicum spp.)、決明(Cassiaspp.)、Centroemapubescens、木瓜(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaa arabica)、繡球小冠花(Colophospermum mopane)、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂(Crataegus spp.)、香瓜(Cucumis spp.)、柏木(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Cryptomeria japonica、香茅(Cymbopogonspp.)、Cynthea dealbata、榲桲(Cydonia oblonga)Dalbergiamonetaria、Davallia divaricata、山螞蝗(Desmodium spp.)、Dicksonia squarosa、Diheteropogon amplectens、Diocles spp、鐮扁豆(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloapyramidalis、Ehrartia spp.、(Eleusine coracana)、Eragrestisspp.、刺桐類(Erythrina spp.)、桉樹(Eucalyptus spp.)、Eucleaschimperi、Eulalia villosa、蕎麥(Fagopyrum spp.)、南美稔(Feijoasellowiana)、草莓屬(Fragaria spp.)、千斤拔(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃芪(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、黃茅(Heteropogoncontortus)、大麥(Hordeum vulgare)、紅苞芽(Hyparrhenia rufa)、小連翹(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigoincarnata、鳶尾(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、Lespedizaspp.、Lettuca spp.、銀合歡(Leucaena leucocephala)、Loudetiasimplex、Lotonus bainesii、百脈根(Lotus spp.)、Macrotylomaaxillare、蘋果(Malus pp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、煙草(Nicotianum spp.)、驢食草(Onobrychisspp.)、Ornithopus spp.、稻(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬(Pennisetum spp.)、Persea gratissima、碧冬茄(Petuniaspp.)、菜豆(Phaseolus spp.)、Phoenix canariensis、新西蘭劍麻(Phormium cookianum)、石楠(Photinia spp.)、Picea glauca、松樹(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpustotara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬(Populus pp.)、瓜葉牧豆樹(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyruscommunis)、櫟(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、Rhopalostylis sapida、Rhus natalensis、Ribes grossularia、茶藨子(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇(Rosaspp.)、懸鉤子(Rubus spp.)、柳(Salix spp.)、Schyzachyriumsanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高粱(Sorghumbicolor)、菠菜(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、三葉草屬(Trifolium spp.)、小麥屬(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔(Vaccinium spp.)、野豌豆(Viciaspp.)、葡萄(Vitis vinifera)、Watsonia pyramidata、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、覓菜(amaranth)、朝鮮薊(artichoke)、蘆筍(asparagus)、西蘭花(broccoli)、芽甘藍(lán)(Brussels sprouts)、圓白菜(cabbage)、蕓苔(canola)、胡蘿卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、甘藍(lán)(collard greens)、亞麻(flax)、羽衣甘藍(lán)(kale)、小扁豆(lentil)、油籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋蔥(onion)、馬鈴薯(potato)、水稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、蕃茄、squashtea、樹和藻類等。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，植物是作物植物，包括蕃茄、馬鈴薯、煙草、黑麥、大豆、向日葵、油菜、紫花苜蓿、油菜籽或棉花。更優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是單子葉植物，例如甘蔗。最優(yōu)選的，所述植物是谷物，例如燕麥、黑麥、水稻、玉米、小麥、粟、高粱或大麥。
本發(fā)明也包括可通過本發(fā)明的方法獲得的植物。因此本發(fā)明提供了可通過本發(fā)明的方法獲得的植物，所述植物和對(duì)照植物相比具有增加的產(chǎn)量，其中所述植物在植物種子組織中也具有細(xì)胞周期蛋白A的優(yōu)先表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施方案，提供了生產(chǎn)和對(duì)照植物相比具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括將有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子的細(xì)胞周期蛋白A核酸導(dǎo)入植物。細(xì)胞周期蛋白A可以是SEQ ID NO1所示的核酸或可以是在上文中定義的細(xì)胞周期蛋白A核酸變體中的任一種，或可以是落在上文所述細(xì)胞周期蛋白A核酸的定義范圍內(nèi)的任何核酸。
圖表描述現(xiàn)在參考下列圖表對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，其中


圖1.通過幾個(gè)全長細(xì)胞周期蛋白A蛋白序列(除了1部分水稻序列外)的比對(duì)產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)生樹。使用聚類程序(Clustal program)利用默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行比對(duì)并將比對(duì)顯示為系統(tǒng)發(fā)育圖。如圖所示，序列聚類在顯示的4個(gè)主要群體中。
圖2.用于在水稻(Oryza sativa)中在PROLAMIN啟動(dòng)子控制下表達(dá)擬南芥細(xì)胞周期蛋白A2；2基因的二元載體。該載體含有來自Ti質(zhì)粒、由左邊界(LB重復(fù)，LB Ti C58)和右邊界(RB重復(fù)，RB TiC58)界定的T-DNA。
圖3.是顯示在細(xì)胞周期蛋白A中發(fā)現(xiàn)的跨種保守性基元的表?；?可用于區(qū)分細(xì)胞周期蛋白A和其他類型的細(xì)胞周期蛋白，基元1和基元2一起可用于區(qū)分A2細(xì)胞周期蛋白和任何其他A型周期蛋白。作為對(duì)照，顯示了在細(xì)胞周期蛋白B；1中發(fā)現(xiàn)的基元。
圖4.是用于本發(fā)明方法的序列表。
序列描述SEQ ID NO1表示用于本發(fā)明方法的細(xì)胞周期蛋白A2；2核酸。除了兩個(gè)替代外，其與以錄入號(hào)NM_121168保藏的序列的編碼序列相同，其中第一個(gè)替代在位點(diǎn)851上，為C替代成G，第二個(gè)替代在位點(diǎn)1295上，為C替代T。據(jù)認(rèn)為這些變化不會(huì)產(chǎn)生任何后果。
SEQ ID NO2表示由SEQ ID NO1的核酸編碼的細(xì)胞周期蛋白A2；2的氨基酸序列。其與以錄入號(hào)NP_568248登載的序列相同，除了其含有兩個(gè)氨基酸替代外，其中第一個(gè)替代在位點(diǎn)284上，為脯氨酸替代精氨酸，第二替代在位點(diǎn)432上，為絲氨酸替代苯丙氨酸。據(jù)認(rèn)為這些變化不產(chǎn)生任何后果。
SEQ ID NO3是來自水稻的谷醇溶蛋白啟動(dòng)子的代表。
SEQ ID NO4和SEQ ID NO5表示用于基因克隆的引物的序列。
實(shí)施例現(xiàn)在用下列實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例只是用于說明目的。
DNA操作除非另外提到，根據(jù)在(Sambrook(2001)Molecular Cloningalaboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等人.(1984)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols的第1和2卷中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行重組DNA技術(shù)。在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy編著的Plant Molecular Biology Labfase(1993)中描述了用于植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法。
實(shí)施例1基因克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板通過PCR擴(kuò)增擬南芥細(xì)胞周期蛋白A2；2(內(nèi)參照CDS95)。在對(duì)從幼苗提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄后，將cDNAs克隆入pCMV Sport 6.0。文庫的平均插入片段大小為1.5kb，克隆的原始數(shù)目為1.59×107cfu。原始滴度經(jīng)確定為9.6×105cfu/ml，第一輪擴(kuò)增后為6×1011cfu/ml。在提取質(zhì)粒后，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。包含用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)的引物prm582(正向引物，起始密碼子以粗體標(biāo)示，AttB1位點(diǎn)以斜體標(biāo)示5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatgtattgctcttcttcgatgc 3’)和prm583(反向引物，互補(bǔ)物，終止密碼子以粗體標(biāo)示，AttB2位點(diǎn)以斜體標(biāo)示5’5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcttggtgtcatcttgagaatag 3’)用于PCR擴(kuò)增。使用Hifi Taq DNA聚合酶在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。也使用標(biāo)準(zhǔn)的方法擴(kuò)增和純化1311bp的PCR片段。然后進(jìn)行Gateway方法(BP反應(yīng))的第一步驟，在此期間PCR片段與pDONR201質(zhì)粒在體內(nèi)重組，產(chǎn)生按照Gateway術(shù)語學(xué)被稱為“入門克隆(entry clone)”的p754。質(zhì)粒pDONR201購自Invitrogen，作為Gateway技術(shù)的部分。
實(shí)施例2載體構(gòu)建然后將含有細(xì)胞周期蛋白A2.2的入門克隆和用于水稻轉(zhuǎn)化的目的載體用于LR反應(yīng)。該載體含有在T-DNA邊界內(nèi)的功能性元件植物選擇性標(biāo)記；視覺標(biāo)記；和用于和已在入門克隆中克隆的目的序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于過量表達(dá)的谷醇溶蛋白啟動(dòng)子(PRO90)位于該Gateway盒的上游。
在LR重組步驟后，將如圖2中所示的所得表達(dá)載體(細(xì)胞周期蛋白A2；2谷醇溶蛋白-上調(diào))轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，然后再轉(zhuǎn)化入水稻植物。讓經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻植物生長，然后就實(shí)施例3中描述的參數(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測。
實(shí)施例3評(píng)估和結(jié)果A.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析F-檢驗(yàn)將二因子ANOVA(變量分析)用作統(tǒng)計(jì)學(xué)模型進(jìn)行植物表型性狀的總體評(píng)估。對(duì)針對(duì)用本發(fā)明的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植物測量的所有參數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的影響和確定基因的總體效應(yīng)，也稱作“全局基因效應(yīng)”。如果F檢驗(yàn)的值顯示數(shù)據(jù)是顯著的，那么可得出存在“基因”效應(yīng)的結(jié)論，意味著不僅僅是基因的存在或位置導(dǎo)致了表型的差異。對(duì)于F檢驗(yàn)，真實(shí)全局性基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)在5％的概率水平。
B.評(píng)估方案產(chǎn)生大約15至20株獨(dú)立的T0水稻轉(zhuǎn)化子。將初級(jí)轉(zhuǎn)化子從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫室中培養(yǎng)并收獲T1種子。保留幾個(gè)這樣的事件，其中在所述事件中，T1后代中轉(zhuǎn)基因的存在/不存在以3∶1比例發(fā)生分離。對(duì)這些事件中的每一個(gè)事件，選擇大約10個(gè)含有轉(zhuǎn)基因(雜合子和純合子)T1幼苗，和大約10個(gè)缺少轉(zhuǎn)基因(零合子(nullizygotes))的T1幼苗。
(i)營養(yǎng)生長測量值將選擇的T1植物(大約10個(gè)具有轉(zhuǎn)基因的和大約10個(gè)無轉(zhuǎn)基因的)轉(zhuǎn)移至溫室中。各植物接受獨(dú)特的磁帶條形碼標(biāo)記以明確地將表型確定數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的植物關(guān)聯(lián)。在下列環(huán)境設(shè)置下將選擇的T1植物種植在直徑10cm花盆中的土壤上光周期＝11.5小時(shí)、日照強(qiáng)度＝30,000勒克斯或更多、日間溫度＝28℃或更高、夜間溫度＝22℃、相對(duì)濕度＝60-70％。將轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的零合子以隨機(jī)的位置并行種植。從播種階段至成熟階段，將各植物數(shù)次通過數(shù)碼成像室并照象。在各時(shí)間點(diǎn)，從至少6個(gè)不同的角度對(duì)各植物進(jìn)行數(shù)碼成像(2048×1536像素，1600萬種顏色)。使用圖象分析軟件以自動(dòng)的方法從所有植物的數(shù)碼圖象推算出參數(shù)，例如地上部分面積。
(ii)種子相關(guān)參數(shù)測量值收獲、袋裝、磁帶條形碼標(biāo)記成熟主穗(primary panicle)，然后在烘箱中在37℃下干燥三天。然后將穗子脫粒，收集所有種子并計(jì)數(shù)。使用吹風(fēng)設(shè)備將飽滿的殼和空殼分離。棄去空殼并對(duì)剩下的部分進(jìn)行計(jì)數(shù)。在分析天秤上對(duì)飽滿的殼稱重。由該方法得到成套的下面描述的種子關(guān)聯(lián)參數(shù)。
(a)總的種子數(shù)目通過計(jì)數(shù)從植物收獲的殼的數(shù)目來測量總種子數(shù)目。來自在種子偏愛的啟動(dòng)子(谷醇溶蛋白)控制之下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的總種子數(shù)目的結(jié)果顯示于下面的表2中。
表2細(xì)胞周期蛋白A2；2種子偏愛的啟動(dòng)子(谷醇溶蛋白)的總種子數(shù)目
來自在組成型啟動(dòng)子控制之下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的總種子數(shù)目(數(shù)據(jù)未顯示)少于獲自由谷醇溶蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2基因的植物的總種子數(shù)目(如上所示，從F檢驗(yàn)得到顯著的p值，表明存在總體基因效應(yīng))。
(b)飽滿種子數(shù)目通過計(jì)算在分離步驟后剩下的飽滿外殼的數(shù)目來確定飽滿種子數(shù)目。下面顯示來自在種子偏愛的啟動(dòng)子(谷醇溶蛋白)控制之下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的飽滿種子數(shù)目(表3為T1植物，表4為T2植物)以及來自在組成型啟動(dòng)子控制之下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的飽滿種子數(shù)的結(jié)果(表5)。
表3T1評(píng)估-細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的飽滿種子數(shù)目
結(jié)果顯示了顯著的總體基因效應(yīng)(F檢驗(yàn)中有顯著的p值)。和對(duì)照植物相比，T1轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出飽滿種子數(shù)目有顯著的增加。
表4T2評(píng)估-細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin飽滿種子的數(shù)目
結(jié)果顯示有顯著的總體基因效應(yīng)(F檢驗(yàn)中有顯著的p值)。和對(duì)照植物相比，T2轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出飽滿種子數(shù)目有顯著的增加。
表5細(xì)胞周期蛋白A2；2pGOS2飽滿種子數(shù)目
相對(duì)于對(duì)照植物，在組成型啟動(dòng)控制之下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的飽滿種子數(shù)增加，然而在谷醇溶蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物顯示更多的飽滿種子數(shù)目(參見上面的表3和表4)。
(b)總種子產(chǎn)量通過稱量從植物中收獲的所有飽滿外殼的重量來測量每株植物的總種子產(chǎn)量。下面顯示了在谷醇溶蛋白啟動(dòng)子(pProlamin)控制之下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的總種子產(chǎn)量(對(duì)于T1評(píng)估結(jié)果參見表6，對(duì)于T2評(píng)估結(jié)果參見表7)和在pGOS2控制下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的總種子產(chǎn)量(參見表8)的結(jié)果。
表6T1評(píng)估-細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin總種子產(chǎn)量
T1評(píng)估的結(jié)果顯示有總體基因效應(yīng)，在F檢驗(yàn)中有顯著的p值。
表7T2評(píng)估-細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的總種子產(chǎn)量
T2評(píng)估的結(jié)果顯示有總體基因效應(yīng)，在F檢驗(yàn)中有顯著的p值。
表8細(xì)胞周期蛋白A2；2pGOS2的總種子產(chǎn)量
如表8所顯示的，組成型表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的總種子產(chǎn)量不如種子優(yōu)選的表達(dá)的結(jié)果好(參見上面的表6和表7)。
(d)收獲指數(shù)此處定義收獲指數(shù)為總種子產(chǎn)量和地上面積(mm2)之間的比例乘以因數(shù)106。在種子偏愛的啟動(dòng)子(谷酵溶蛋白)控制之下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的收獲系數(shù)顯示于下列的表9中。
表9細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的收獲指數(shù)
細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin表達(dá)植物的收獲指數(shù)顯示存在總體基因效應(yīng)(參見來自F檢驗(yàn)的p值)。在組成型啟動(dòng)子控制之下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2的植物的收獲指數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)不如上面表9中顯示的結(jié)果好。
(e)千粒重(TKW)從計(jì)算的飽滿種子數(shù)目和其總重量推算TKW。下面顯示表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的植物的TKW(參見表10)與表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A2；2pGOS2的植物的TKW(參見表11)的結(jié)果。
表10細(xì)胞周期蛋白A2；2；pProlamin的TKW
上表顯示了來自F檢驗(yàn)的顯著性p值，從中可明顯看出總體基因效應(yīng)。
表11周期蛋白A2；2pGOS2的千粒重
細(xì)胞周期蛋白A2；2pGOS2的千粒重的結(jié)果顯示TKW有增加，但所述增加不如上面表10中顯示的增加大。
(iii)逆境評(píng)估細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin播種種子，在10天后，將幼苗移栽至裝有1∶1濕沙和蛭石混合物的10cm直徑花盆中。將所述10cm直徑花盆插入12cm直徑花盆中，在兩個(gè)花盆之間放置一層塑料織物以阻止下土層流失。然后在移栽前用新鮮的水浸透花盆。在移栽一天后，使幼苗接受鹽條件。
每天在8am、12am、4pm和9pm用含有下列成分的鹽逆境誘導(dǎo)性營養(yǎng)物溶液澆灌花盆4次·NPK營養(yǎng)物混合物，濃度為1kg/m3的20-20-20Petersprofessional(Scotts)。
·Magnesium chelate，333.33ml/m3的Chelal Mg(BMS，Bornem，Belgium)·Iron chelate，21.67g/m3的Libfer(CIBA，Bradford，UK)·1.425kg/m3的NaCl在每周的基礎(chǔ)上監(jiān)控鹽濃度，需要時(shí)加入鹽。在鹽逆境條件下培養(yǎng)植物直至谷粒充盈開始。在此時(shí)間點(diǎn)上，將其轉(zhuǎn)移至溫室的不同區(qū)室中，在那里每天用新鮮的水澆灌其直至種子收獲。然后以和上面(a)至(e)中針對(duì)非逆境植物所述相同的方式測量和記錄下列參數(shù)。
表12細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的總種子產(chǎn)量
由針對(duì)在以鹽逆境為例的逆境條件下細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin植物進(jìn)行的F-檢驗(yàn)的P值可明顯看出，表12中的結(jié)果顯示有顯著的基因效應(yīng)。
表13細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的飽滿種子數(shù)目
表13中的結(jié)果顯示有顯著的基因效應(yīng)，這由針對(duì)在以鹽逆境為例的逆境條件下細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin植物進(jìn)行的F-檢驗(yàn)的P值可明顯看出這一點(diǎn)。
表14細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的種子總數(shù)
表14中的結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照植物，種子總數(shù)有增加。
表15細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的收獲系數(shù)
表15中的結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照植物，收獲指數(shù)有增加。
表16細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin的TKW
由針對(duì)在以鹽逆境為例的逆境條件下細(xì)胞周期蛋白A2；2pProlamin植物進(jìn)行的F-檢驗(yàn)的P值可明顯看出，表16中的結(jié)果顯示有顯著的基因效應(yīng)。
實(shí)施例4本發(fā)明在玉米中的應(yīng)用此處描述的本發(fā)明也可用于玉米。在適合用于土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化的植物轉(zhuǎn)化載體中，將細(xì)胞周期蛋白A克隆在種子偏愛的啟動(dòng)子的控制之下。在文獻(xiàn)(EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676；Ishida等人，1996；Frame等人，2002)中已描述了這些用于玉米轉(zhuǎn)化的載體和方法。
將由這些方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物在溫室中進(jìn)行培養(yǎng)以生產(chǎn)T1種子。通過定量實(shí)時(shí)PCR和Southern印跡分析法檢測轉(zhuǎn)基因的遺傳能力和拷貝數(shù)，并通過逆轉(zhuǎn)錄PCR和Northern分析法確定轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。選擇具有轉(zhuǎn)基因單拷貝插入和具有不同轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因系用于生產(chǎn)T2種子。在適合玉米的條件(16:8的光周期、26-28℃日間溫度和22-24℃夜間溫度)下以及在缺水、缺氮和過量NaCl的條件下，在溫室中萌發(fā)和培養(yǎng)后代種子。
在自交的情況下，來自相同親本系的無效分離子以及相同栽培品種的野生型植物用作對(duì)照。就不同的生物量和生長參數(shù)對(duì)通過自交或雜交產(chǎn)生的后代植物進(jìn)行評(píng)估，所述生長參數(shù)包括植物高度、稈/莖粗度、葉片數(shù)目、總地上面積、葉片綠度、成熟時(shí)間、抽絲時(shí)間、開花時(shí)間、穗數(shù)目、穗長度、行數(shù)(row number)、谷粒數(shù)目、谷粒大小、谷粒含油量、谷粒成熟度、收獲時(shí)間。選擇對(duì)于上述參數(shù)中任一種獲得最顯著提高的系進(jìn)行進(jìn)一步的田間檢測和標(biāo)志輔助育種(marker-assisted breeding)，目的是將田間驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因性狀轉(zhuǎn)移入商業(yè)化種質(zhì)中。在本領(lǐng)域內(nèi)已很好地建立了在田間檢測和玉米生長和產(chǎn)量相關(guān)的參數(shù)的方法以及用于將特定基因座(含有轉(zhuǎn)基因的基因座)從一種種質(zhì)漸滲入另一種種質(zhì)的技術(shù)。這也包括將感興趣的性狀從經(jīng)轉(zhuǎn)化的近交系轉(zhuǎn)移至具有想要的農(nóng)藝或營養(yǎng)或藥物價(jià)值的商業(yè)化雜種中。
序列表<110>CropDesign N.V.
<120>具有增加產(chǎn)量的植物及其生產(chǎn)方法<130>CD-106-PCT<150>US 60/532,287<151>2003-12-22<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1311<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<220>
<221>misc_feature<223>以錄入號(hào)NM_121168登載的序列的編碼序列變體在第851位含有G而不是C，在第1295位含有T而不是C<400>1atgtattgct cttcttcgat gcatccaaat gcaaacaaag aaaatatctc tacttcagat60gtacaggaga gttttgtacg aataacgaga tcacgagcta aaaaagccat gggaagagga120gtatcaatac ctccaacaaa accttctttt aaacagcaaa agagacgtgc agtacttaag180gatgtgagta atacctctgc agatattatt tattcagaac ttcgaaaggg aggcaacatc240aaggcaaaca gaaaatgtct aaaagagcct aaaaaagcag caaaggaagg tgctaacagt300gccatggata ttctggtaga tatgcataca gaaaaatcaa aattagcaga agatttgtcc360aagatcagga tggctgaagc ccaagatgtc tctctttcaa actttaaaga tgaagaaatt420actgagcaac aagaagatgg atcaggtgtc atggagttac ttcaagttgt agatattgat480tccaacgtcg aagatccaca gtgttgcagc ttgtatgctg ctgatatata tgacaacata540catgttgcag agcttcaaca acgacccttg gctaattata tggagcttgt gcagcgagat600atcgacccag acatgagaaa gattctgatt gactggcttg tagaagtttc tgacgactac660aagctggttc cagatacgct ttaccttaca gtgaatctta tcgaccggtt tctgtccaac720agttacattg aaaggcaaag actccagctc cttggtgtct cttgcatgct tatagcttca780aaatatgaag agctttccgc accaggggtg gaggagtttt gcttcattac ggccaacaca840tacacaagac cagaagtgct gagcatggag attcaaattc taaattttgt gcactttaga900ttatcggttc ctaccaccaa aacatttctg aggcggttca ttaaagcagc tcaagcttcg960tacaaggtgc ctttcattga actggagtat ttagcaaact atctcgccga attgacactg1020gtggaatata gtttcctaag gttcctgcca tcactaattg ctgcttcagc tgttttccta1080gcccgatgga cactcgacca aactgaccat ccttggaacc ctactctgca acactacacc1140agatatgagg tagctgagct gaagaacaca gttctcgcca tggaggactt gcagctcaac1200accagtggct gtactctcgc tgccacccgt gagaaataca accaaccaaa gtttaagagc1260gtggcaaagc tgacatctcc caaacgagtc acatcactat tctcaagatg a 1311
<210>2<211>436<212>PRT<213>擬南芥<220>
<221>MISC_FEATURE<223>以錄入號(hào)NP_568248登載的序列變體在第284位含有精氨酸而非脯氨酸，在第432位含有苯丙氨酸而非絲氨酸<400>2Met Tyr Cys Ser Ser Ser Met His Pro Asn Ala Asn Lys Glu Asn Ile1 5 10 15Ser Thr Ser Asp Val Gln Glu Ser Phe Val Arg Ile Thr Arg Ser Arg20 25 30Ala Lys Lys Ala Met Gly Arg Gly Val Ser Ile Pro Pro Thr Lys Pro35 40 45Ser Phe Lys Gln Gln Lys Arg Arg Ala Val Leu Lys Asp Val Ser Asn50 55 60Thr Ser Ala Asp Ile Ile Tyr Ser Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asn Ile65 70 75 80Lys Ala Asn Arg Lys Cys Leu Lys Glu Pro Lys Lys Ala Ala Lys Glu85 90 95Gly Ala Asn Ser Ala Met Asp Ile Leu Val Asp Met His Thr Glu Lys100 105 110Ser Lys Leu Ala Glu Asp Leu Ser Lys Ile Arg Met Ala Glu Ala Gln115 120 125Asp Val Ser Leu Ser Asn Phe Lys Asp Glu Glu Ile Thr Glu Gln Gln130 135 140Glu Asp Gly Ser Gly Val Met Glu Leu Leu Gln Val Val Asp Ile Asp145 150 155 160Ser Asn Val Glu Asp Pro Gln Cys Cys Ser Leu Tyr Ala Ala Asp Ile165 170 175Tyr Asp Asn Ile His Val Ala Glu Leu Gln Gln Arg Pro Leu Ala Asn180 185 190Tyr Met Glu Leu Val Gln Arg Asp Ile Asp Pro Asp Met Arg Lys Ile195 200 205
Leu Ile Asp Trp Leu Val Glu Val Ser Asp Asp Tyr Lys Leu Val Pro210 215 220Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Val Asn Leu Ile Asp Arg Phe Leu Ser Asn225 230 235 240Ser Tyr Ile Glu Arg Gln Arg Leu Gln Leu Leu Gly Val Ser Cys Met245 250 255Leu Ile Ala Ser Lys Tyr Glu Glu Leu Ser Ala Pro Gly Val Glu Glu260 265 270Phe Cys Phe Ile Thr Ala Asn Thr Tyr Thr Arg Pro Glu Val Leu Ser275 280 285Met Glu Ile Gln Ile Leu Asn Phe Val His Phe Arg Leu Ser Val Pro290 295 300Thr Thr Lys Thr Phe Leu Arg Arg Phe Ile Lys Ala Ala Gln Ala Ser305 310 315 320Tyr Lys Val Pro Phe Ile Glu Leu Glu Tyr Leu Ala Asn Tyr Leu Ala325 330 335Glu Leu Thr Leu Val Glu Tyr Ser Phe Leu Arg Phe Leu Pro Ser Leu340 345 350Ile Ala Ala Ser Ala Val Phe Leu Ala Arg Trp Thr Leu Asp Gln Thr355 360 365Asp His Pro Trp Asn Pro Thr Leu Gln His Tyr Thr Arg Tyr Glu Val370 375 380Ala Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu Ala Met Glu Asp Leu Gln Leu Asn385 390 395 400Thr Ser Gly Cys Thr Leu Ala Ala Thr Arg Glu Lys Tyr Asn Gln Pro405 410 415Lys Phe Lys Ser Val Ala Lys Leu Thr Ser Pro Lys Arg Val Thr Ser420 425 430Leu Phe Ser Arg435<210>3<211>654<212>DNA
<213>Oryza sativa<400>3cttctacatc ggcttaggtg tagcaacacg actttattat tattattatt attattatta60ttattttaca aaaatataaa atagatcagt ccctcaccac aagtagagca agttggtgag120ttattgtaaa gttctacaaa gctaatttaa aagttattgc attaacttat ttcatattac180aaacaagagt gtcaatggaa caatgaaaac catatgacat actataattt tgtttttatt240attgaaatta tataattcaa agagaataaa tccacatagc cgtaaagttc tacatgtggt300gcattaccaa aatatatata gcttacaaaa catgacaagc ttagtttgaa aaattgcaat360ccttatcaca ttgacacata aagtgagtga tgagtcataa tattattttc tttgctaccc420atcatgtata tatgatagcc acaaagttac tttgatgatg atatcaaaga acatttttag480gtgcacctaa cagaatatcc aaataatatg actcacttag atcataatag agcatcaagt540aaaactaaca ctctaaagca accgatggga aagcatctat aaatagacaa gcacaatgaa600aatcctcatc atccttcacc acaattcaaa tattatagtt gaagcatagt agta 654<210>4<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>序列PRM582<400>4ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtat tgctcttctt cgatgc56<210>5<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PRM583<400>5ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg cttggtgtca tcttgagaat ag5權(quán)利要求
1.用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將細(xì)胞周期蛋白A核酸，優(yōu)選地編碼細(xì)胞周期蛋白A蛋白的核酸導(dǎo)入植物，該細(xì)胞周期蛋白A核酸有效地連接了種子偏愛的啟動(dòng)子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物產(chǎn)量選自下列中的一項(xiàng)或多項(xiàng)各相對(duì)于對(duì)應(yīng)的對(duì)照植物而言，有增加的種子重量、增加的飽滿種子數(shù)目、增加的種子數(shù)目、增加的種子大小、增加的收獲指數(shù)、增加的千粒重和經(jīng)修飾的種子組成。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞周期蛋白A蛋白包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構(gòu)成的基元。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞周期蛋白A核酸是選自細(xì)胞周期蛋白A2；1、細(xì)胞周期蛋白A；2；2、細(xì)胞周期蛋白A2；3和細(xì)胞周期蛋白A2；4的細(xì)胞周期蛋白A2。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)胞周期蛋白A2包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構(gòu)成的基元和由ELTLV/I/T/M D/E/MY T/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構(gòu)成的、具有殘基(--T-----F--F---)中的至少兩個(gè)殘基的基元。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞周期蛋白A是選自下列的細(xì)胞周期蛋白A序列變體(i)細(xì)胞周期蛋白A核酸的功能性部分；(ii)能和細(xì)胞周期蛋白A核酸/基因雜交的序列；(iii)細(xì)胞周期蛋白A核酸/基因的變通剪接變體；(iv)細(xì)胞周期蛋白A核酸/基因的等位基因變體；(v)由于遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生的變體；和(vi)細(xì)胞周期蛋白A蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
7.權(quán)利要求6的方法，其中(i)至(v)的細(xì)胞周期蛋白A變體能夠編碼包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構(gòu)成的基元和由ELTLV/I/T/M D/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構(gòu)成的、具有殘基(--T-----F--F---)中至少兩個(gè)殘基的基元的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述(vi)的細(xì)胞周期蛋白A變體包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構(gòu)成的基元和由ELTLV/I/T/MD/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構(gòu)成的、具有殘基(--T-----F--F---)中至少兩個(gè)殘基的基元。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述種子偏愛的啟動(dòng)子是在胚乳中具有活性的啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述啟動(dòng)子是谷醇溶蛋白啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述增加的產(chǎn)量在最適和亞最適的生長條件下獲得。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述亞最適生長條件包括非生物逆境條件，例如鹽逆境。
13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物選自水稻、玉米、小麥、大麥、大豆、向日葵、蕓苔、甘蔗、紫花苜蓿、粟、大麥、油籽油菜(rapeseed)、高粱和棉花。
14.可通過權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法獲得的植物。
16.構(gòu)建體，其包含(i)編碼下述蛋白質(zhì)的核酸，該蛋白質(zhì)包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構(gòu)成的基元和任選地另外包含由ELTLV/I/T/MD/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構(gòu)成的、具有殘基(--T-----F--F---)中至少兩個(gè)殘基的基元；(ii)種子偏愛的啟動(dòng)子；和可選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止子序列。
16.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述種子偏愛的啟動(dòng)子是在胚乳中有活性的啟動(dòng)子。
17.權(quán)利要求16的構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是谷醇溶蛋白啟動(dòng)子。
18.在種子偏愛的啟動(dòng)子控制下表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A的植物，其中所述細(xì)胞周期蛋白A包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構(gòu)成的基元以及可選地另外包含由ELTLV/I/T/M D/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構(gòu)成的、具有殘基(--T-----F--F---)中至少兩個(gè)殘基的基元，該植物和相應(yīng)的野生型植物以及和組成型表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A的轉(zhuǎn)基因植物相比，具有增加的產(chǎn)量。
19.權(quán)利要求18的植物，其中所述種子偏愛的啟動(dòng)子是在胚乳中有活性的啟動(dòng)子。
20.權(quán)利要求19的植物，其中所述啟動(dòng)子是谷醇溶蛋白啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過將細(xì)胞周期蛋白A的核酸，優(yōu)選地編碼細(xì)胞周期蛋白A蛋白的核酸導(dǎo)入植物來增加植物產(chǎn)量的方法，該細(xì)胞周期蛋白A的核酸有效地連接至種子偏愛的啟動(dòng)子上。通過使用該方法，在最適和亞最適生長條件下可增加植物的產(chǎn)量。由該方法生成了相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物和相對(duì)于組成型地表達(dá)細(xì)胞周期蛋白A的轉(zhuǎn)基因植物而言，具有增加的產(chǎn)量的植株。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1906304SQ200480040587
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月22日
發(fā)明者V·弗朗卡德, V·米羅諾夫 申請(qǐng)人:作物培植股份有限公司