專利名稱：一種融合人白細胞介素28b及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種融合人白細胞介素28B及其制備方法。
背景技術：
干擾素(interfeixm，IFN)是人類最早發(fā)現的細胞因子，早在20世紀30年代，人們已發(fā)現機體感染某一種病毒后，會對另一種抗原性毫無關系的病毒發(fā)生干擾現象。1957年，英國病毒生物學家Alick Isaacs和瑞士研究人員Jean Lindenmann,在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現象時了解到，病毒感染的細胞能產生一種因子，后者作用于其他細胞，干擾病毒的復制，故將其命名為干擾素，并一直沿用至今。人類IFN蛋白家族基于它們的基因序列、染色體定位和受體特異性分為三型，即I型、II型和III型干擾素，其中I型IFN家族包括至少25種亞型的IFN- α非等位基因，I個IFN-β基因，lflFN-co基因，以及了解尚少的I個IFN-K和I個IFN-ε基因，所有I型INF基因均位于9號染色體，沒有內含子，并且所編碼蛋白全部使用同一種受體IFN- α β R0II型IFN家族僅有IFN-Y —個成員，又稱為免疫干擾素，基因位于12號染色體。III型干擾素是干擾素的一個新家族，包括IFNX-l、IFN-X2和IFN-X3 3個成員，IFN-λ s基因位于19號染色體，基因中含有多個內含子，其基因結構與IL-10家族成員十分相似，而與IFN-α相差甚遠，因此IFNX-l、IFN-X2和IFN-λ 3又分別被命名為IL29，IL28A和IL28B。2003 年，Stoppard P 等運用反向生物學原理，利用 Genscan、SIGNAI、4HB、WU_BLAST等生物信息學軟件鑒定了一個干擾素新家族，首次報道了其編碼產物具有干擾素樣活性(Sheppard P,Kindsvogel W,Xu W, Henderson K,Schlutsmeyer S,Whitmore TE,KuestnerR, Garrigues U, Birks C, Roraback J, Ostrander C, Dong D, Shin J,Presnell S, Fox B,Haldeman B, Cooper E, Taft D, Gilbert T, Grant FJ, Tackett M, Krivan ff, McKnightG,Clegg C, Foster D, Klucher KM. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptorIL-28R. Nat Immunol. 2003 Jan ；4(1) :63-8. Epub 2002 Dec 2·)。Kotenko S V 等將它們命名為干擾素新家族——IFN- λ s (IFN- λ I、IFN- λ 2和IFN- λ 3)。人類基因組組織(HumanGeneomeOrganization, HUGO)暫時將它們命名為 IL29、IL28A 和 IL28B。III型干擾素具有多種生物學功能，其刺激細胞可產生數百種干擾素誘導基因(ISGs)。在體外IFN-As可保護人細胞系抵抗水泡口炎病毒(VSV)和心肌炎病毒引起的細胞病變；IFN-λ I可抑制HBV和HCV在肝細胞中的復制(Doyle SE, SchreckhiseH,Khuu-Duong K, Henderson K, Rosier R, Storey H, Yao L, Liu H, Barahmand—pour F,Sivakumar P,Chan C,Birks C,Foster D,Clegg CH,Wietzke-Braun P,Mihm S,KlucherKM.Interleukin-29 uses a type I interferon-like program to promote antiviralresponses inhuman hepatocytes. Hepatology. 2006 Oct ；44(4) :896-906.)。稱猴接種HIV抗原后，IFN-λ s能降低Th2型細胞因子(IL-4和IL-5和IL-13和IL-14和IL-15)的產生，這可能有利于Thl免疫途徑，增加調節(jié)性T細胞，提高CD8T細胞的細胞毒性和應答記憶(Dai J, Megjugorac NJ, Gallagher GE, Yu RY, Gallagher G. IFN-Iambdal (IL-29)inhibits GATA3expression and suppresses Th2 responses in human naive and memoryT cells. Blood. 2009Jun 4 ；113(23) :5829-38.)。近年來的研究表明，IL28B 基因多態(tài)性對于HCV感染者對IFN治療的病毒學應答具有一定的影響，與細胞因子IL28B相關的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，不僅與慢性HCV患者聚乙二醇干擾素/利巴韋林治療應答有強相關性，還與急性HCV感染后的自發(fā)性病毒清除高度相關，說明其在群體水平上，是決定HCV感染治療結果的一個重要的宿主因素(Ge D, Fellay J, Thompson AJ, Simon JS, ShiannaKV,Urban TJ, Heinzen EL, Qiu P, Bertelsen AH, Muir AJ, Sulkowski M, McHutchison JG,Goldstein DB. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-inducedviralclearance. Nature. 2009 Sep 17 ;461 (7262) :399-401.)。目前，人們對 III 型干擾素的生物學研究主要集中在IL29和IL28A。美國zymogenetics公司與BMS聯合研發(fā)的PEG-IL29細胞因子已經進入臨床研究，并展示出良好的抗HCV前景。但是IL28B作為藥物的研究目如仍是一片空白。干擾素是最早發(fā)現、研究最多、第一個克隆化、第一個用于臨床治療疾病的一類重要的家族性細胞因子。其首先被發(fā)現的生物活性是抵抗病毒感染，隨著研究的深入，干擾素的免疫調控、抗增殖作用以及抗腫瘤作用才逐漸為人們所認識。自1986年，美國FDA首先 批準基因工程干擾素a -2a和a -2b投放市場之后，基因工程β、Y干擾素也相繼于1990年、1993年獲準投放市場。近20年以來，隨著基因工程技術的發(fā)展，目前已有約60個國家批準干擾素上市，用于治療病毒性肝炎、癌癥及多發(fā)性硬化癥等約30多種疾病。但是干擾素相對分子質量較小，易被腎小球濾過，體內不穩(wěn)定，易被血清蛋白酶降解，血漿半衰期短而治療周期長，需要頻繁注射給藥。因此，為了克服以上缺點，改善重組IFNs代謝動力學及藥效學特征，近年來開發(fā)出了很多類型的長效干擾素，其設計原理主要基于以下幾個方面
(I)增大干擾素的分子量，減少腎小球濾過率；(2)減少異源蛋白的免疫原性，從而減少其體內清除率；(3)持續(xù)緩慢釋放維持藥物濃度，延長藥物作用時間。主要技術手段有化學修飾技術、基因融合技術、定點突變技術以及緩釋給藥系統(tǒng)等。人血清白蛋白(HSA)是人體血液中天然的物質輸送載體，血清中含量最高，對維持體內滲透壓和血漿體積起著至關重要的作用。其相對分子量約為65kDa，是由585個氨基酸組成的單鏈球型蛋白質，無酶學及免疫學活性，其腎清除率非常低，體內半衰期為14 20d，是體內因子和藥物轉運的天然載體，是理想的改善藥物半衰期的藥物融合蛋白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種融合蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的融合蛋白，是人血清白蛋白和λ干擾素連接而成的融合蛋白。上述融合蛋白中，所述人血清白蛋白位于所述λ干擾素的N端；上述融合蛋白中，所述λ干擾素為人白細胞介素28Β ；上述融合蛋白中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。所述編碼基因為如下I)或2)或3)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO 2所示DNA分子；2)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述重組載體中，所述重組載體是將SEQ ID NO :2所示基因插入表達載體pPinka -HC的多克隆位點得到的。上述重組菌中，所述重組菌是將SEQ ID NO :2所示編碼基因導入宿主酵母菌中得到的；所述宿主酵母菌具體為畢赤酵母 ，再具體為如下四種菌株中的至少一種ade2蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/prbl蛋白酶缺陷型畢赤酵母和ade2/prbl/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母；上述重組菌中，所述SEQ ID NO :2所示編碼基因是通過權利要求5或6所述重組載體導入的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述融合蛋白的方法。本發(fā)明所提供的制備上述融合蛋白的方法，包括如下步驟I)將上述任一所述重組酵母菌預培養(yǎng)至對數生長期；2)用甲醇對步驟I)得到的菌進行誘導培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)完畢，收集上清液，即得到所述融合蛋白。上述制備方法中，所述步驟2)中，所述甲醇占誘導培養(yǎng)體系的I. 0% -4. 0% (體積百分比)，具體為2% -4%或2% -3% ；上述任一制備方法中，所述步驟2)中，所述誘導培養(yǎng)的時間為48h_72h，具體為72h。上述任一制備方法中，所述步驟I)中，所述預培養(yǎng)包括如下步驟將權利要求7所述的重組酵母菌接種于用于培養(yǎng)畢赤酵母的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至培養(yǎng)體系的0D600為5. O 6. O ；上述任一制備方法中，所述步驟2)中，在所述用甲醇進行誘導之前，包括如下步驟將步驟I)得到的菌體重懸于用于誘導酵母菌的培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)10_14h ；上述任一制備方法中,所述用于培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，具體為BMGY培養(yǎng)基；所述用于誘導酵母菌的培養(yǎng)基為用于誘導畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，具體為BMMY培養(yǎng)基；上述任一制備方法中，所述步驟I)和所述步驟2)中，所述培養(yǎng)的溫度為30°C。目前重組蛋白類藥物的制備方法主要包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、動植物生物反應器等基因工程方法。本發(fā)明采用的PichiaPink酵母表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)點屬于真核表達系統(tǒng)，能對表達蛋白進行翻譯后的加工和修飾；強效啟動子，通過甲醇誘導嚴格調控外源基因的表達；外源基因產物表達量高，可以達到每升數克表達產物的水平；自身分泌蛋白少，分泌表達產物較易分離純化；對營養(yǎng)要求低，生長快，生產成本低，可高密度發(fā)酵，適合大規(guī)模工業(yè)化生產。本發(fā)明運用生物工程技術，通過構建編碼HSA和經密碼子優(yōu)化后人IL28B的融合基因克隆到PichiaPink酵母表達載體pPink a -HC中并獲得高效表達，系國內首創(chuàng)。實驗證明，用本發(fā)明的重組菌制備HSA-opt-hIL28B，表達量高，純化過程簡便，且表達產物具有較強的活性。因此，本發(fā)明重組菌及本發(fā)明方法在長效人IL28B的制備及免疫調節(jié)、抗病毒治療等領域中有廣闊的應用前旦
O


圖I為pPink a HC-HSA-opt_hIL28B重組質粒的酶切鑒定。圖2為HSA-opt_hIL28B在PichiaPink strain 2號菌株中高表達克隆的篩選。圖3為HSA-opt-hIL28B重組蛋白高效表達株的表達條件的優(yōu)化。本圖為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色結果。圖4為重組HSA-opt-hIL28B蛋白的純化。本圖為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色結果。圖5為重組HSA-opt_hIL28B蛋白的質譜分析。圖6為利用本發(fā)明制備并純化的HSA-opt-hIL28B重組蛋白和另一發(fā)明制備并純化的opt-hIL28B及購自先靈葆雅公司的IFN- a 2b對人肝癌細胞系H印G2細胞人黏液病毒抗性蛋白A(MxA)的激活。圖7為opt_hIL28B蛋白的質譜分析。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司，質粒大量提取試劑盒、轉染試劑購自Giantagen公司。一次性細胞培養(yǎng)板以及移液管等耗材購自Corning公司。實施例I、融合蛋白的制備一、融合基因HSA與優(yōu)化后的opt_hIL28B基因的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。該融合基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。人工合成人血清白蛋白基因(HSA)。人血清白蛋白基因(HSA)的核苷酸序列如SEQID NO 2中第1-1755位核苷酸所示；該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO 1中第1-585位氨基酸所示。人工合成經密碼子優(yōu)化后的人opt_hIL28B基因。經密碼子優(yōu)化后的人IL28B(hIL28B)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2中第1756-2343位核苷酸所示。該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: I中第586-780位氨基酸所示。密碼子優(yōu)化前的基因名稱為hIL28B，密碼子優(yōu)化后的基因名稱為opt-hIL28B。與hIL28B基因相比，opt_hIL28B基因的核苷酸序列發(fā)生變化，氨基酸序列不變。設計下列引物通過Overlapping PCR方式將人血清白蛋白基因融合到基因opt-hIL28B的5'末端(即將人血清白蛋白融合到opt-hIL28B的N末端)。融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示，記作HSA-opt-hIL28B。用于融合的HSA基因模板由SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4兩對引物以合成的HAS基因為模板擴增獲得，用于融合的opt-hIL28B基因模板由SEQ ID NO :5和SEQID NO :6兩對引物以合成的opt-hIL28B基因為模板擴增獲得；再將用于融合的HSA基因模板和用于融合的opt-hIL28B基因模板混合，用SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 6引物進行擴增，得到融合基因 HSA-opt-hIL28B。SEQ ID NO 35’ -GTATCTCTCGAGAAAAGGCCTGATGCACACAAGAGTGAG-3’SEQ ID NO 45’ -GCATCCGGGAGAGCCCCGCGTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’
SEQ ID NO 55， -GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACGCGGGGCTCTCCCGGATGC-3，SEQ ID NO 65’ -TTTAAATGGCCGGCCGGTACCTCAGACACACAGGTCCCCG-3’二、重組表達載體pPink a-HC 載體購自美國 Invitrogen 公司，目錄號Al 1153。將融合基因HSA-opt-IL28B通過Giantagen公司GIANTCL0NE —步法快速克隆試劑盒(目錄號G060501)克隆至IJ PichiaPink酵母菌專用表達載體pPink a -HC的Stu I和Kpn I酶切位點中，獲得的重組表達質粒記作pPink a HC-HSA-opt_hIL28B。將重組質粒？？丨111^!1(-肥4-0 卜1111^288進行酶切鑒定，結果如圖I。圖中，Ml =DNA分子量標準(TAKARA 公司DL 15, 000) ；M2 :DNA 分子量標準(TAKARA 公司DL 2, 000) ；1 pPink a HC-HSA-opt_hIL28B 質粒以 Nco I 和 Kpn I 雙酶切；2 pPink a HC-HSA-opt_hIL28B質粒以Spe I單酶切。結果雙酶切泳道可見約1500bp的片段被切出。表明構建的重組表達質粒正確。 將重組質粒pPink a HC-HSA-opt_hIL28B進行測序鑒定。結果顯示在載體pPinka -HC的Stu I和KpnI酶切位點間沿著從Stu I至KpnI的方向，插入的基因序列如SEQ ID NO :2所示。測序結果完全正確的質粒用Giantagen公司GIANTPREP質粒大量提取試劑盒(目錄號G060303)按說明書進行大量制備。三、重組菌(I) pPink a HC-HSA-opt_hIL28B 質粒 DNA 的線性化取IOyg pPinkaHC-HSA-opt_IL28B重組質粒，用限制性內切酶Spe I按照說明書建議的反應體系進行線性化，線性化后的DNA經純化后，溶于IOul的無菌去離子水中。(2)酵母菌感受態(tài)細胞的制備PichiaPink表達系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司，目錄號A11154。酵母菌株1#、2#、3#和4#均購自美國Invitrogen公司，目錄號A11154。這四株菌均屬于目錄號為A11154的試劑盒，不同菌株都有清晰的標記，使用者很容易區(qū)分開。PichiaPink表達系統(tǒng)中酵母菌株1#、2#、3#和4#分別為蛋白酶缺陷型，缺陷的基因分別為 ade2、ade2/pep4、ade2/prbl 和 ade2/prbl/pep4。ade2、prbl、pep4 是公知的，酵母菌株1#、2#、3#和4#均購自美國Invitrogen公司，其說明書上標明它們是通過基因敲除方式構造的缺陷株。I.分別挑取PichiaPink酵母表達系統(tǒng)中的菌株的單菌落，接種至含有IOml YPD培養(yǎng)基的125ml三角瓶中，30°C，260r/min培養(yǎng)I天；2.分別取上述步驟中復蘇后的四種菌株培養(yǎng)物100 500 μ 1，接種至含有IOOml新鮮Yro培養(yǎng)基的IL三角搖瓶中，調整接菌濃度使初始OD6tltl = O. 2，30°C，260rpm/min培養(yǎng)過夜，至OD6tltl達到1.3- 1.5 ；3.將步驟2中酵母細胞培養(yǎng)物轉移至300ml無菌離心瓶中，4°C，1500g離心5min，棄上清，菌體沉淀用200ml冰預冷的無菌水重懸；4.按步驟3離心,用50ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；5.按步驟3離心，用IOml的冰預冷的IM山梨 醇溶液將菌體沉淀重懸；6.按步驟3離心，用300ul的冰預冷的IM山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為500ul。制備好的感受態(tài)置冰上放置，并且當天使用。(3)酵母菌的電轉化PAD、YPDS 均購自美國 Invitrogen 公司，目錄號A11156。I.分別取5 μ g pPink a HC-HSA-opt_hIL28B純化后的線性化DNA與80 μ I四種菌株的感受態(tài)細胞混合均勻，轉移至O. 2cm冰預冷的電轉杯中，冰浴5min ；2.運用Bio-Rad公司的MicroPulser Electroporator,進行電轉，電轉條件為2kV, 25 Ω，200 μ F ;電擊時間為5ms左右。電擊完畢后，加入Iml冰預冷的YPDS培養(yǎng)基將菌體混合均勻，轉移至30°C，靜置培養(yǎng)2h ；3.每管取100 300 μ I菌體懸液涂布于PAD選擇培養(yǎng)板上，將平板置于30°C培養(yǎng)，直至單個菌落出現；4.從步驟3中每板分別挑取3-8個白色克隆至新鮮的PAD選擇培養(yǎng)板中，重新劃線分離純化培養(yǎng)至出現單菌落。四、蛋白的表達BMGY培養(yǎng)基組成及各成分在培養(yǎng)基中的濃度如下I %酵母粉(yeast extract),2%蛋白胨(p印tone)，I. 34% ΥΝΒ，0· 0004%生物素(biotin)，1%甘油，用 lOOmM、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液(potassium phosphate)補足體積。所述百分含量除甘油為體積百分比外，
其余均為質量百分含量。BMMY培養(yǎng)基組成及各成分在培養(yǎng)基中的濃度如下I %酵母粉(yeast extract),2% 蛋白胨(peptone), I. 34% YNB，O. 0004 % 生物素(biotin)，0. 5 % 甲醇，用 IOOmM, pH
6.O的磷酸鹽緩沖液(potassium phosphate)補足體積。所述百分含量除甲醇為體積百分比外，其余均為質量百分含量。(一 )重組HSA-opt_hIL28B在四種不同菌株中表達量的比較及高表達株的篩選I.挑取含有HSA-opt-hIL28B的單菌落接種至含有10ml BMGY培養(yǎng)基的125ml三角瓶中，30°C,260rpm/min培養(yǎng)I天；2.將培養(yǎng)物轉移至50mL錐底離心管中，1500g室溫離心5min,棄上清,沉淀重懸于Iml BMMY培養(yǎng)基中，30 °C，260rpm/min培養(yǎng)過夜；3.次日加入IOOul 40% (體積百分比)甲醇水溶液,30°C, 260rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)過夜；4.第二天1500gX IOmin離心收集上清，取20ul經SDS-PAGE分析比較HSA-opt-hIL28B 在 PichiaPink 表達系統(tǒng) strainl#、strain2#、strain3#、strain4# 四種不同菌株中表達量的變化。分別挑取轉入HSA-opt-hIL28B的酵母菌株1#、2#、3#和4#各32個克隆進行誘導表達，收集上清液，用Bicinchoninic acid(BCA)法檢測各蛋白的表達量。結果，strainl#、strain2#、strain3#、strain4# 四種不同菌株中 HSA-opt_IL28B 蛋白的平均表達量分別為 O. 158ug/ul、0. 176ug/ul、0. 073ug/ul、0. 057ug/ul，顯示，HSA-opt_IL28B在strain2#中的表達量高于其他三種菌株。對照I :轉入空載體pPink a -HC的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中均沒有檢測到目的蛋白的表達。5. HSA-opt-hIL28B在PichiaPink表達系統(tǒng)strain2#菌株中高表達克隆的篩選。在確定HSA-opt-hIL28B在strain2#中的表達量高于其他三種菌株的基礎上，進一步大規(guī)模挑取轉有HSA-opt-hIL28B的strain2#單菌落進行誘導表達，通過SDS-PAGE分析比較(圖2)，電泳為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色，篩選出9株HSA-opt-hIL28B的高表達株，其中表達量最高的為6號菌株，選擇該菌株進行表達條件的優(yōu)化，并對該菌株進行保種。( 二)重組HSA-opt_hIL28B高效表達株的表達條件優(yōu)化。
I.將篩選出的HSA-opt-hIL28B高效表達6號菌株接種至含有IOml BMGY培養(yǎng)基的125ml三角瓶中，30°C，260rpm/min培養(yǎng)I天；2.將步驟I中的培養(yǎng)物分別接種至4個含有50mLBMGY培養(yǎng)基的IL三角瓶中，30 °C, 260rpm/min 培養(yǎng) I 天；3.第二天1500gX5min離心，棄上清，沉淀重懸于IOmLBMMY培養(yǎng)基中，30°C，260rpm/min培養(yǎng)過夜；4.次日分別加入100%甲醇至終濃度(即甲醇占培養(yǎng)體系的體積百分比)為
I.0%、2· 0%、3· 0%、4· 0%，30°C，260rpm/min 誘導，分別在誘導時間為 24h、48h、72h 時收取上清進行蛋白表達量檢測和SDS-PAGE檢測。結果如圖3所示，在相同誘導時間下，3%與4%終濃度的甲醇誘導的目的蛋白表達量相對較高在相同終濃度的甲醇誘導下，誘導時間為72h時目的蛋白表達量相對較高。電泳為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色。具體表達量如下表I、各種條件下的蛋白表達量(ug/ul)
24h ~48h~~72h~
~I. 0%OOO. 086
2.0%OOO. 106
3.0%OOO. 187
4.0%OO. 019 O. 177(三)重組HSA-opt_hIL28B蛋白的大量表達I.將篩選出的HSA-opt-hIL28B高效表達6號菌株接種至含有IOml BMGY培養(yǎng)基的125ml三角瓶中，300C，260rpm/min培養(yǎng)I天；此步驟的培養(yǎng)目的是對6號菌株進行復蘇、提高活性以便下一步的預培養(yǎng)。2.將上述步驟中的培養(yǎng)物接種至含有250mLBMGY培養(yǎng)基的IL三角瓶中，30°C，260rpm/min過夜培養(yǎng)至0D600 = 5. O 6. O左右；此步驟的培養(yǎng)目的是將復蘇后的6號菌株培養(yǎng)至對數生長期，以便下一步的誘導表達。3. 1500gX5min 離心，棄上清，沉淀重懸于 50mL BMMY 培養(yǎng)基中，30°C，260rpm/min培養(yǎng)過夜。此步驟是對培養(yǎng)至對數生長期的6號菌株進行誘導表達。4.次日加入甲醇至終濃度(即甲醇占培養(yǎng)體系的體積百分比)為3.0%，3(TC，260rpm/min誘導72h后，收菌離心取上清(即為蛋白粗提液)備用，同時取部分上清進行蛋白表達量檢測和SDS-PAGE檢測。結果，蛋白的表達量為O. 223ug/ul。(四)重組HSA-opt_hIL28B蛋白的純化
20mM PB的溶劑為水，溶質及各溶質在20mM PB中的濃度如下=K2HPO4 · 3H2020mM,KH2PO4 20mM ；20mM PB 的 PH 為 7· O。I.柱平衡將陽離子交換柱SP-Agarose填料(購自美國GE公司)裝填至層析柱中，用5倍柱體積滅菌純化水平衡純化，以除去殘留的20%乙醇。再用buffer A(20mM PB，PH = 7. O)平衡 SP 柱；2.上樣以2ml/分鐘的流速進樣品，待樣品完全進柱后，用5倍體積的平衡buffer A(20mM PB, PH = 7. O)去除未結合蛋白；3.洗脫洗滌5倍柱體積的溶液后，至280納米吸光度回落基線。再分別換用洗脫緩沖液洗脫5倍柱體積的溶液并收集洗脫液；洗脫緩沖液由KCl和20mM PB組成，KCl在洗脫緩沖液中的濃度分別為O. 5M、1. OMU. 5M。將不同鹽濃度洗脫收集液進行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色鑒定，結果如圖4所示，目的蛋白主要集中在I. OM洗脫液中，SDS-PAGE鑒定后，重組蛋白凍干保存。電泳為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色。五、重組蛋白的驗證一質譜分析為鑒定制備的重組HSA-opt_hIL28B蛋白的屬性，將圖4中目標蛋白條帶切取下來，送西農生(北京)生物技術有限公司進行基體輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-T0F-MS),結果如圖5所示,將所得的肽指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)運用MASCOT軟件搜索比對最新的NCBI蛋白數據庫以鑒定目的蛋白，發(fā)現肽段序列與HSA或hIL28B匹配，表明制備的重組蛋白的氨基酸序列正確。實施例2、融合蛋白的功能驗證——HSA-opt-IL28B融合蛋白調節(jié)的細胞內信號通路分析HepG2細胞購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。人黏液病毒抗性蛋白A(Myxovirus resistance protein Α,ΜχΑ)是干擾素誘導蛋白之一，該蛋白具有抗多種病毒的活性，正常情況下基因不表達，但是在多種病毒感染時可經過病毒感染誘導的I型(α β )和III型(λ s)干擾素通路被快速誘導表達。MxA在病毒感染和IFN治療中是I型和III型干擾素活性的標志物,故可通過測定MxA蛋白或其mRNA來反映I型和III型干擾素的生物活性。本發(fā)明以!fepG2細胞接種于6孔板長滿單層后，分別加入l、10ng/ml純化后的重組HSA-opt-hIL28B蛋白，同時以人IL28B蛋白、以lng/ml的IFN-a 2b (購于先靈葆雅公司)、以及PBS處理的!fepG2細胞組作為對照，37°C孵育，24h后收細胞，每孔加入100 μ LI X SDS loading buffer 重懸，煮沸 IOmin, 12000rpm室溫離心 5min,取 IOul 上清經westernBlotting檢測MxA的表達水平。MxA抗體購自美國R&D公司。檢測方法為免疫印跡。具體結果如圖6所示，HSA-opt-hIL28B蛋白和hIL28B蛋白的處理均可刺激H印G2細胞誘導MxA的表達，且其表達水平隨HSA-opt-hIL28B蛋白和hIL28B蛋白處理濃度的上升而增高，說明重組HSA-opt-hIL28B蛋白和重組hIL28B蛋白一樣具有刺激干擾素誘導蛋白表達的生物學活性。人IL28B蛋白的制備方法與HSA-0pt_hIL28B的制備方法基本相同，不同的是重組菌中轉入的外源基因為核苷酸序列如SEQ ID NO 2中第1756-2343位核苷酸所示基因。人IL28B蛋白的驗證——質譜分析將制備的目標蛋白送西農生(北京)生物技術有限公司進行基體輔助激光解吸電 離飛行時間質譜分析(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of FlightMassSpectrometry, MALDI-TOF-MS)，結果如圖7所不，將所得的月太指紋圖譜(PeptideMassFingerprinting,PMF)運用MASCOT軟件搜索比對最新的NCBI蛋白數據庫以鑒定目的蛋白，發(fā)現肽段序列與hIL28B匹配，表明制備的蛋白的氨基酸序列正確。
權利要求
1.一種融合蛋白，是人血清白蛋白和λ干擾素連接而成的融合蛋白。
2.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述人血清白蛋白位于所述λ干擾素的N端； 和/或，所述λ干擾素為人白細胞介素28Β; 和/或，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
3.權利要求I或2所述融合蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下I)或2)或3)所示 1)其核苷酸序列是SEQID NO 2所示DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
5.含有權利要求3或4所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達盒。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將SEQID ΝΟ:2所示基因插入表達載體pPinka -HC的多克隆位點得到的。
7.根據權利要求5所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將SEQID NO:2所示編碼基因導入宿主酵母菌中得到的；所述宿主酵母菌具體為畢赤酵母，再具體為如下四種菌株中的至少一種ade2蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/prbl蛋白酶缺陷型畢赤酵母和ade2/prbl/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母； 和/或，所述SEQ ID NO :2所示編碼基因是通過權利要求5或6所述重組載體導入的。
8.一種制備權利要求I所述融合蛋白的方法，包括如下步驟 1)將權利要求7所述的重組酵母菌預培養(yǎng)至對數生長期； 2)用甲醇對步驟I)得到的菌進行誘導培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)完畢，收集上清液，即得到所述融合蛋白。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述甲醇占誘導培養(yǎng)體系的1.0%-4.0% (體積百分比)，具體為2%-4%或2%-3% ； 所述步驟2)中，所述誘導培養(yǎng)的時間為48h-72h，具體為72h。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，所述預培養(yǎng)包括如下步驟將權利要求7所述的重組酵母菌接種于用于培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至培養(yǎng)體系的0D600為5. O 6. O ; 所述步驟2)中，在所述用甲醇進行誘導之前，包括如下步驟將步驟I)得到的菌體重懸于用于誘導酵母菌的培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)10-14h ； 所述用于培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，具體為BMGY培養(yǎng)基；所述用于誘導酵母菌的培養(yǎng)基為用于誘導畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，具體為BMMY培養(yǎng)基； 所述步驟I)和所述步驟2)中，所述培養(yǎng)的溫度為30°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合人白細胞介素28B及其制備方法。本發(fā)明公開的融合蛋白是人血清白蛋白和λ干擾素連接而成的融合蛋白。實驗證明，用本發(fā)明的重組菌制備HSA-opt-hIL28B，表達量高。且表達產物具有較強的活性。因此，本發(fā)明重組菌及本發(fā)明方法在長效人IL28B的制備領域中有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N5/10GK102757502SQ201110106888
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權日2011年4月27日
發(fā)明者司有輝, 楊威, 楊洋, 程敏 申請人:中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所