專利名稱：一種制備il28b的方法及專用重組菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備IU8B的方法及專用重組菌。
背景技術(shù)：
感染性疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織2002年報告， 在對人類危害最嚴(yán)重的疾病病種中，有約80%是傳染病和寄生蟲病。而在臨床微生物感染癥中，由病毒引起的約占75%。病毒性疾病由于具有傳染性強(qiáng)、傳播迅速、流行廣泛、死亡率高、缺乏特異性藥物等特點，給人類健康與經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展帶來巨大的危害。在眾多抗病毒制劑中，幾十年前發(fā)現(xiàn)的干擾素(IFN)及基于干擾素的各種治療方案目前仍然是治療多種病毒感染的最基本的治療策略。人類白細(xì)胞介素 29 (HumanInterleukin 29，hIL-29)家族成員包括三個重要分子，它們分別是IL_29， IL-28A和IL-28B，又分別稱為干擾素λ 1，λ2和λ 3，屬于一大類新發(fā)現(xiàn)的III型干擾素。2003年，由Skppard等的工作首次報道了人IU8A、IL28B及IU9基因及其編碼產(chǎn)物，具有干擾素樣活性(Si印pard P, Kindsvogel W, Xu W, Henderson K, Schlutsmeyer S, WhitmoreTE, Kuestner R, Garrigues U,Birks C, Roraback J, Ostrander C, Dong D, Shin J, Presnell S, Fox B, Haldeman B, Cooper E, Taft D, Gilbert T, Grant FJ, Tackett M, Krivan W,McKnightG,Clegg C,Foster D,Klucher KM. IL-28,IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R. Nat Immunol. 2003 Jan ；4(1) :63-8. Epub 2002 Dec 2·)。自 2003年被發(fā)現(xiàn)以來，III型干擾素在很大程度上一直被認(rèn)為是I型干擾素的一個“窮親戚”， 許多功能似乎和I型干擾素重疊而且直至現(xiàn)在也少有其作為一個獨立的、具有重要臨床作用的細(xì)胞因子的證據(jù)。一直以來，人們對III型干擾素的生物學(xué)研究主要集中在IU9和 IL28A。依據(jù)受體相似性，IFN-λ s屬于II型細(xì)胞因子家族。II型細(xì)胞因子家族包含三個類型的干擾素(I、II、III型)以及白細(xì)胞介素IO(IL-IO)相關(guān)的細(xì)胞因子。I型干擾素包括IFN-α和IFN-β，II型干擾素即為IFN-γ。III型干擾素包括IU9，IL28A和 IL28B.其中，IL28B與IL28A氨基酸序列高度同源(96%),而與IL29的同源性較低(81%) (Sheppard P,Kindsvogel W,Xu W,Henderson K,Schlutsmeyer S,Whitmore TE,Kuestner R,Garrigues U,Birks C, Roraback J, Ostrander C,Dong D, Shin J,Presnell S,Fox B, Haldeman B, Cooper E, Taft D, Gilbert T, Grant FJ, Tackett M, Krivan W, McKnightG, Clegg C, Foster D, Klucher KM. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R. Nat Immunol. 2003 Jan ；4(1) :63-8. Epub 2002 Dec 2·)。目前，針對三種不同的 IFN- λ s細(xì)胞因子生物學(xué)特性的比較數(shù)據(jù)還很有限。盡管II型細(xì)胞因子在氨基酸水平上差異很大，但它們在結(jié)構(gòu)上卻是通過各自相關(guān)的異源二聚體跨膜蛋白受體，共享一個α螺旋模式和信號。但是，干擾素的生物學(xué)活性最終取決于沒有關(guān)聯(lián)的受體細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，因而可能導(dǎo)致這些干擾素之間結(jié)構(gòu)相似但生物學(xué)功能不同。這意味著除了他們的受體在不同細(xì)胞類型中分布模式不同外，不同類型的Π型細(xì)胞因子在功能上也是不同的。
III型干擾素具有多種生物學(xué)功能，其刺激細(xì)胞可產(chǎn)生數(shù)百種干擾素誘導(dǎo)基因(ISGs)。Marcello等利用丙型肝炎病毒(HCV)復(fù)制子細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)檢測了在IFN-α 和IFNX刺激條件下ISG的表達(dá)、蛋白產(chǎn)量和HCV RNA的復(fù)制。在這個系統(tǒng)中兩種細(xì)胞因子最終都抑制了 HCV的復(fù)制。但STAT的活化動力學(xué)和所誘導(dǎo)的潛在效應(yīng)基因卻不同。特別是，IFN-as誘導(dǎo)的基因達(dá)到高峰后迅速下降，而IFN-Xs所誘導(dǎo)的基因穩(wěn)步增長。因此，I型和III型干擾素之間功能上的區(qū)別和相互作用可能是由于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的這個細(xì)節(jié)引起(Marcello T, Grakoui A, Barba-Spaeth G, Machlin ES, KotenkoSV, MacDonald MR, Rice CM. Interferons alpha and lambda inhibit hepatitis C virusreplication with distinct signal transduction and gene regulation kinetics. Gastroenterology. 2006 Dec ；131 (6) : 1887-98. Epub 2006 Oct 1·)。IFN-Xs 的功能尚未完全闡明，產(chǎn)生IFN-Xs的細(xì)胞分布不同，但他們都可以利用合適的受體對 IFN-λ s做出應(yīng)答。IFN-λ s在免疫細(xì)胞上的功能與IFN-α相似，是非常復(fù)雜多樣的。獼猴接種HIV抗原后，IFN- λ s能降低Th2型細(xì)胞因子(IL-4和IL-5和IL-13和IL-14和IL-15) 的產(chǎn)生，這可能有利于Thl免疫途徑，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，提高⑶8T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和應(yīng)答記憶(DaiJ，Megjugorac NJ, Gallagher GE, Yu RY, Gallagher G. IFN-lambdal (IL-29) inhibitsGATA3 expression and suppresses Th2 responses in human naive and memory T cells. Blood. 2009 Jun 4 ；113(23) :5擬9_38.)。然而，又有學(xué)者表明，免疫細(xì)胞亞群(單核細(xì)胞，NK細(xì)胞，T細(xì)胞)對IFN-λ 1和IFN-X2的反應(yīng)遲鈍，推測原因是外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種可溶性受體引起。IFN- λ s的抗病毒作用已比較明確，在體外IFN-λ s可保護(hù)人細(xì)胞系抵抗水泡口炎病毒(VSV)和心肌炎病毒引起的細(xì)胞病變；IFN-λ 1可抑制HBV和HCV在肝細(xì)胞中的復(fù)制(Doyle SE, Schreckhise H, Khuu-Duong K, Henderson K, Rosier R, Storey H, Yao L, Liu H, Barahmand-pour F, Sivakumar P, Chan C, Birks C, FosterD, Clegg CH, Wietzke-Braun P, Mihm S, Klucher KM. Interleukin-29 uses a type 1interferon-1ike program to promote antiviral responses in human hepatocytes. Hepatology. 2006 Oct ；44 (4) :896-906.)。III型IFNs的產(chǎn)生。一般來說，IFN- λ家族和IFN- α都具有抗病毒的免疫調(diào)節(jié)的功能，但他們也有重要的差異。所有有核細(xì)胞均可產(chǎn)生IFN-α s，而IFN-λ s只能有少數(shù)細(xì)胞類型表達(dá)。漿單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞(pDC和MDDC)和巨噬細(xì)胞在應(yīng)答流感病毒感染禾口 / 或細(xì)菌禾口病毒模擬分子(艮口 Toll—like receptor agonistslipopolysaccharide and poly I :C)時產(chǎn)生 IFN-λ s (Megjugorac NJ, Gallagher GE, GallagherG. IL-4 enhances IFN-Il(IL-29)production by plasmacytoid DCs via monocyte secretion ofIL-lRa. Blood 2010 ；115 :4185e90.)。有趣的是，將巨噬細(xì)胞與IFN-α預(yù)培養(yǎng)可顯著增加IFN-λ s 的產(chǎn)生，這也是二者信號通路相互影響的證據(jù)。有證據(jù)表明，IFN-λ s的分泌可能是受細(xì)胞因子的影響，例如，PDCs細(xì)胞通過單核細(xì)胞介導(dǎo)的信號應(yīng)答于IL-4，產(chǎn)生更多的IFN-λ S。 還有證據(jù)表明IFN-λ s在皮膚生物學(xué)具有特定的作用，那里的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞很容易產(chǎn)生IFN- λ s,作用于角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。與HCV感染密切相關(guān)的細(xì)胞， 肝癌細(xì)胞系(HepG2和Huh7. 5)，體外培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞和肝活檢標(biāo)本中獲得的肝組織，均會應(yīng)答于病毒感染而產(chǎn)生 IFN-λ s (Mihm S, Frese M, Meier V, Wietzke-Braun P, Scharf JG, Bartenschlager R, Ramadori G. Interferon type I geneexpression in chronichepatitis C. Lab Invest. 2004 Sep ；84 (9) :1148-59.)。相反的，人類原代中樞神經(jīng)組織不產(chǎn)生 IFN-λ S。近年來的研究表明，IL28B基因多態(tài)性對于HCV感染者對IFN治療的病毒學(xué)應(yīng)答具有一定的影響。與細(xì)胞因子IL28B相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，在群體水平上， 是決定HCV感染治療結(jié)果的一個主要的宿主因素(Ge D，F(xiàn)ellay J，Thompson AJ, Simon JS, Shianna KV, Urban TJ, Heinzen EL, Qiu P, Bertelsen AH, Muir AJ, Sulkowski Μ, McHutchison JG, Goldstein DB. Genetic variaion in IL28B predicts hepatitis Ctreatment-induced viral clearance. Nature. 2009 Sep 17 ；461 (7262) :399_401·)。由此，人們有理由相信IL28B參與體內(nèi)的病毒學(xué)應(yīng)答，盡管目前機(jī)制方面并不十分清楚。目前，關(guān)于IU9的功能研究較多，美國zymogenetics公司與BMS聯(lián)合研發(fā)的PEG-IU9細(xì)胞因子已經(jīng)進(jìn)入臨床研究，并展示出良好的抗HCV前景。但是IL28B作為藥物的研究目前還是個空白。重組蛋白類藥物的制備方法主要包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動植物生物反應(yīng)器等基因工程方法。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有如下優(yōu)點屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的功能；強(qiáng)效啟動子，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，可以達(dá)到每升數(shù)克表達(dá)產(chǎn)物的水平；適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；可以誘導(dǎo)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)，便于產(chǎn)物純化；以甲醇作為誘導(dǎo)物，生產(chǎn)成本低，無毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種優(yōu)化的人白細(xì)胞介素^B的編碼基因。本發(fā)明所提供的優(yōu)化的人白細(xì)胞介素^B的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1 所示。含有上述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，重組表達(dá)載體，是將SEQ ID N0:1所示基因插入表達(dá)載體pPinka-HC的多克隆位點得到的。具體的，是將SEQ ID NO :1所述基因插入表達(dá)載體pPinka-HC的Mu I和KpnI 酶切位點間得到的。其中，重組酵母菌，是將SEQ ID NO 1所示編碼基因?qū)胨拗鹘湍妇械玫降?；所述宿主酵母菌具體為畢赤酵母，再具體為如下四種菌株中的至少一種ade2蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/prbl蛋白酶缺陷型畢赤酵母和ade2/ prbl/p印4蛋白酶缺陷型畢赤酵母。上述重組酵母菌中，所述編碼基因是通過上述任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入的。上述任一所述的重組酵母菌在制備人白細(xì)胞介素^B中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備人白細(xì)胞介素^B的方法。本發(fā)明所提供的制備人白細(xì)胞介素^B的方法，包括如下步驟1)將上述任一所述的重組酵母菌預(yù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期；(誘導(dǎo)前進(jìn)行培養(yǎng)的主要目的是讓菌體達(dá)到對數(shù)生長期，該期是細(xì)胞增殖最旺盛活力最好的時期，適合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá))2)用甲醇對步驟1)得到的菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)完畢，收集上清液，即得到人白細(xì)胞介素^B。所述步驟2)中，所述甲醇占誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的0.5%-10.0%或0.5%-4.0% (體積百分比)，具體為_4%、或2% -4%或2% -3%。所述步驟2)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為36h_72h，具體為4他-7池或60h_72h。所述步驟1)中，所述預(yù)培養(yǎng)包括如下步驟將上述任一所述的重組酵母菌接種于用于培養(yǎng)酵母的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至培養(yǎng)體系的0D600為5. 0 6. 0 ；所述步驟2、中，在所述用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)之前，包括如下步驟將步驟1)得到的菌體重懸于用于誘導(dǎo)酵母菌的培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)10-14h ；所述用于培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，具體為BMGY培養(yǎng)基；所述用于誘導(dǎo)酵母菌的培養(yǎng)基為用于誘導(dǎo)畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，具體為BMMY培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)的溫度為30°C。實驗證明，用本發(fā)明的重組菌制備IU8B，表達(dá)量高，純化過程簡便，且表達(dá)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的活性。因此，本發(fā)明重組菌及本發(fā)明方法在IL28B的制備及免疫調(diào)節(jié)、抗病毒治療等領(lǐng)域中有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為pPink α HC-0pt_hIL28B重組質(zhì)粒的酶切鑒定。圖2為opt-hIL28B在PichiaPink strain 2號菌株中高表達(dá)克隆的篩選。圖3為opt_hIL28B重組蛋白高效表達(dá)株的表達(dá)條件的優(yōu)化。本圖為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖4為重組hIL28B蛋白的純化。本圖為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖5為重組hIL28B蛋白的質(zhì)譜分析。圖6為利用本發(fā)明制備并純化的opt_hIL28B重組蛋白及購自美國R&D公司的重組IU8B、II^9蛋白及購自先靈葆雅公司的IFN- α 2b對人肝癌細(xì)胞系IfepG2細(xì)胞內(nèi)信號通路分子STATl (Tyr701)磷酸化的激活。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。胎牛血清及DMEM 培養(yǎng)基購自hvitrogen公司，質(zhì)粒大量提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑購自Giantagen公司。一次性細(xì)胞培養(yǎng)板以及移液管等耗材購自Corning公司。實施例1、重組菌的制備及應(yīng)用一、重組菌制備1、基因
人工合成經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人IL-28B基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。密碼子優(yōu)化前的基因名稱為hIU8B，密碼子優(yōu)化后的基因名稱為opt-hII^8B。與 hIL28B基因相比，opt-hIL28B基因的核苷酸序列發(fā)生變化，氨基酸序列不變。該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。密碼子優(yōu)化前的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。2、重組表達(dá)載體pPinka-HC 載體購自美國 Invitrogen 公司，目錄號A11153。將人工合成的opt_hIL28B基因，通過Mu I和KpnI酶切位點克隆到PichiaPink 酵母菌專用表達(dá)載體pPinka-HC的相應(yīng)酶切位點中，獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒記作 pPinka HC-opt-hIL28B。將重組質(zhì)粒pPinka HC-opt_hIL28B進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1。圖中，M1:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(TAKARA 公司DL 2, 000) ；M2 :DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(TAKARA 公司DL15, 000) ；1 pPink a HC-opt-hIL28B 質(zhì)粒以 Xho I 和 Kpn I 雙酶切；2 :pPink a HC-opt-hIL28B 質(zhì)粒以 Spe I單酶切。結(jié)果雙酶切泳道可見在500bp上方有插入片段被切出。表明構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒正確。將重組質(zhì)粒pPinkaHC-opt-hIL28B進(jìn)行測序鑒定。結(jié)果顯示在載體pPink a-HC 的乂11 I和Kpn I酶切位點間沿著從Mu I至Kpn I的方向，插入的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。測序結(jié)果完全正確的質(zhì)粒用Giantagen公司GIANTPREP質(zhì)粒大量提取試劑盒(目錄號G06030;3)按說明書進(jìn)行大量制備。3、重組菌(1) pPink a HC-opt"hIL28B 質(zhì)粒 DNA 的線性化取IOyg pPinka HC-opt-hIL28B重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Spe I按照說明書建議的反應(yīng)體系進(jìn)行線性化，線性化后的DNA經(jīng)純化后，溶于IOul的無菌去離子水中。(2)酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的制備酵母菌株1#、2#、3#和4#均購自美國hvitrogen公司，目錄號A11154。這四株菌均屬于目錄號為AlllM的試劑盒，不同菌株都有清晰的標(biāo)記，使用者很容易區(qū)分開。PichiaPink表達(dá)系統(tǒng)中酵母菌株1#、2#、3#和4#分別為蛋白酶缺陷型，缺陷的基因分別為 ade2、ade2/p印4、ade2/prbl 和 ade2/prbl/p印4。ade2、prbl、p印4 是公知的,酵母菌株1#、2#、3#和4#均購自美國^witrogen公司，其說明書上標(biāo)明它們是通過基因敲除方式構(gòu)造的缺陷株。1.分別挑取PichiaPink酵母表達(dá)系統(tǒng)中的菌株的單菌落，接種至含有IOml YPD 培養(yǎng)基的125ml三角瓶中，30°C，260r/min培養(yǎng)1天；2.分別取上述步驟中復(fù)蘇后的四種菌株培養(yǎng)物100 500 μ 1，接種至含有IOOml 新鮮YPD培養(yǎng)基的IL三角搖瓶中，調(diào)整接菌濃度使初始OD6tltl = 0.2，30°C，260rpm/min培養(yǎng)過夜，至OD6tltl達(dá)到1.3 1.5 ；3.將步驟2中酵母細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至300ml無菌離心瓶中，4°C，1500g離心5min， 棄上清，菌體沉淀用200ml冰預(yù)冷的無菌水重懸；4.按步驟3離心，用50ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；
5.按步驟3離心，用IOml的冰預(yù)冷的IM山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；6.按步驟3離心，用300ul的冰預(yù)冷的IM山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為500ul。制備好的感受態(tài)置冰上放置，并且當(dāng)天使用。(3)酵母菌的電轉(zhuǎn)化1.分別取5μ g 丨111^!1(-0 {-1111^288純化后的線性化0嫩與8(^1四種菌株的感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，轉(zhuǎn)移至0. 2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5min ；2.運用Bio-fcid公司的MicroPulser Electroporator，進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)條件為 2kV, 25 Ω，200 μ F ；電擊時間為5ms左右。電擊完畢后，加入Iml冰預(yù)冷的YPDS培養(yǎng)基將菌體混合均勻，轉(zhuǎn)移至30°C，靜置培養(yǎng)濁；3.每管取100 300 μ 1菌體懸液涂布于PAD選擇培養(yǎng)板上，將平板置于30°C培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)；4.從步驟3中每板分別挑取3-8個白色克隆至新鮮的PAD選擇培養(yǎng)板中，重新劃線分離純化培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。PAD、YPDS均購自美國 hvitrogen 公司，目錄號:A11156。PichiaPink Media Kit。同時設(shè)如下兩組對照對照1 轉(zhuǎn)入SEQ ID NO :3所示編碼基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#。制備方法與實驗組基本相同，只是轉(zhuǎn)入的基因不同，為優(yōu)化前基因。對照2 轉(zhuǎn)入空載體pPink α -HC的酵母菌株1#、2#、3#和4#。制備方法與實驗組基本相同，不同的是只轉(zhuǎn)入空載體PPink α -HC。二、蛋白的表達(dá)BMGY培養(yǎng)基組成及各成分在培養(yǎng)基中的濃度如下酵母粉(yeast extract), 2%蛋白胨(ρ印tone)，1. 34% YNB，0. 0004%生物素(biotin)，1 %甘油，用 100mM、pH 6.0 的磷酸鹽緩沖液(potassium phosphate)補(bǔ)足體積。所述百分含量除甘油為體積百分比外， 其余均為質(zhì)量百分含量。BMMY培養(yǎng)基組成及各成分在培養(yǎng)基中的濃度如下酵母粉(yeast extract), 2% 蛋白胨(peptone), 1. 34% ΥΝΒ,Ο. 0004% 生物素(biotin)，0. 5 % 甲醇，用 100mM、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液(potassium phosphate)補(bǔ)足體積。所述百分含量除甲醇為體積百分比外，其余均為質(zhì)量百分含量。(一)重組hIL28B在四種不同菌株中表達(dá)量的比較及高表達(dá)株的篩選實驗組和對照組在相同條件下進(jìn)行蛋白表達(dá)和目的蛋白含量檢測。1.挑取含有opt-hII^8B的單菌落接種至含有10ml BMGY培養(yǎng)基的125ml三角瓶中，30°C，260rpm/min 培養(yǎng) 1 天；2.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至50mL錐底離心管中，1500g室溫離心5min，棄上清，沉淀重懸于 Iml BMMY培養(yǎng)基中，30 °C，260rpm/min培養(yǎng)過夜；3.次日加入IOOul 40% (體積百分比)甲醇水溶液，30°C，260rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)過夜；4.第二天1500gX IOmin離心收集上清，取20ul經(jīng)SDS-PAGE分析比較不同菌株中表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，與hIL28B相比密碼子優(yōu)化后的opt-hIL28B在PichiaPink表達(dá)系統(tǒng)strainl#、strain2#、strain3#、strain4#四種不同菌株中的表達(dá)量均上升。
5. opt-hIL28B 在 PichiaPink 表達(dá)系統(tǒng) strainl#、strain2#、strain3#、strain4# 四種不同菌株中表達(dá)量的比較。分別挑取轉(zhuǎn)入SEQ ID NO :1所示編碼基因的酵母菌株1#、 姊、3#和4#各32個克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集上清液，用Bicinchoninic acid (BCA)法檢測上清液中各蛋白的表達(dá)量，結(jié)果取平均數(shù)，具體如下實驗組轉(zhuǎn)入SEQ ID NO :1所示編碼基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中目的蛋白表達(dá)量依次為0. 149ug/ul、0. 163ug/ul、0. 062ug/ul、0. 049ug/ul。顯示 opt-hIL28B在strain^的表達(dá)量高于其他三種菌株。對照1 轉(zhuǎn)入SEQ ID NO 3所示編碼基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中目的蛋白表達(dá)量依次為:0. 106ug/ul、0. 117ug/ul、0. 043ug/ul、0. 032ug/ul。對照2 轉(zhuǎn)入空載體pPink α -HC的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中均沒有檢測到目的蛋白的表達(dá)。6. opt_hIL28B在PichiaPink表達(dá)系統(tǒng)strain^!菌株中高表達(dá)克隆的篩選。在確定opt-hIL28B在strains中的表達(dá)量高于其他三種菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步大規(guī)模挑取轉(zhuǎn)有opt-hII^8B的strain^單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE分析比較(圖2)，篩選出 5株0pt-hIU8B的高表達(dá)株，選擇其中表達(dá)量最高的2號菌株進(jìn)一步進(jìn)行下游實驗。電泳為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍(lán)染色。(二)重組hIL28B高效表達(dá)株的表達(dá)條件優(yōu)化。1.將篩選出的opt_hIL28B高效表達(dá)2號菌株接種至含有IOml BMGY培養(yǎng)基的 125ml 三角瓶中，30°C，260rpm/min 培養(yǎng) 1 天；2.將步驟1中的培養(yǎng)物分別接種至5個含有50mLBMGY培養(yǎng)基的IL三角瓶中， 30 0C，260rpm/min 培養(yǎng) 1 天；3.第二天1500gX5min離心，棄上清，沉淀重懸于IOmLBMMY培養(yǎng)基中，30°C， 260rpm/min培養(yǎng)過夜；4.次日分別加入100%甲醇至終濃度(即甲醇占培養(yǎng)體系的體積百分比)為 0. 5%U. 0%,2. 0%,3. 0%,4. 0%,30°C,260rpm/min 誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)時間為 36h、48h、 60h、72h時收取上清進(jìn)行蛋白表達(dá)量檢測和SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖3所示，在相同誘導(dǎo)時間下，2%與3%終濃度的甲醇誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量相對較高在相同終濃度的甲醇誘導(dǎo)下，誘導(dǎo)時間為60h與7 時目的蛋白表達(dá)量相對較高。電泳為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍(lán)染色。具體表達(dá)量如下表1、各種條件下的蛋白表達(dá)量(ug/ul)
36h48h60h72h0. 5%0. 0780. 0860. 0900. 0831. 0%0. 0890. 1130. 1380. 1352. 0%0. 0950. 1460. 1520. 1413. 0%0. 1330. 1670. 1780. 163
9
權(quán)利要求
1.一種人白細(xì)胞介素^B的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)品.ο
3.一種重組表達(dá)載體，是將SEQ ID N0:1所示基因插入表達(dá)載體pPinka-HC的多克隆位點得到的。
4.一種重組酵母菌，是將SEQ ID NO :1所示編碼基因?qū)胨拗鹘湍妇械玫降?；所述宿主酵母菌具體為畢赤酵母，再具體為如下四種菌株中的至少一種ade2蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/prbl蛋白酶缺陷型畢赤酵母和ade2/ prbl/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組酵母菌，其特征在于所述編碼基因是通過權(quán)利要求2 或3所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入的。
6.權(quán)利要求4或5所述的重組酵母菌在制備人白細(xì)胞介素^B中的應(yīng)用。
7.一種制備人白細(xì)胞介素^B的方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求4或5所述的重組酵母菌預(yù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期；2)用甲醇對步驟1)得到的菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)完畢，收集上清液，即得到人白細(xì)胞介素^B。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述甲醇占誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的0.5% -10. 0%或0.5% -4.0% (體積百分比)，具體為-4%、或2%-4%或 2% -3%。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為 36h-72h，具體為 48h-7ai 或 60h_7ai。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述預(yù)培養(yǎng)包括如下步驟將權(quán)利要求1-4中任一所述的重組酵母菌接種于用于培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至培養(yǎng)體系的0D600為5. 0 6. 0 ；所述步驟幻中，在所述用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)之前，包括如下步驟將步驟1)得到的菌體重懸于用于誘導(dǎo)酵母菌的培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)10-14h ；所述用于培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，具體為BMGY培養(yǎng)基； 所述用于誘導(dǎo)酵母菌的培養(yǎng)基為用于誘導(dǎo)畢赤酵母菌的培養(yǎng)基，具體為BMMY培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)的溫度為30°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備IL28B的方法及專用重組菌。本發(fā)明的重組酵母菌，是將SEQ ID NO1所示基因?qū)胨拗鹘湍妇械玫降?。實驗證明，用本發(fā)明的重組菌制備IL28B，表達(dá)量高。且表達(dá)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的活性。因此，本發(fā)明重組菌及本發(fā)明方法在IL28B的制備領(lǐng)域中有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N7/01GK102250917SQ201110106859
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者司有輝, 楊威, 楊洋, 程敏 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所