專利名稱：一種泰樂菌素基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和生物發(fā)酵エ業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種泰樂菌素基因工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
泰樂菌素是由弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、龜裂鏈霉菌(Streptomycesromosus)和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)次級(jí)代謝產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其中弗氏鏈霉菌是泰樂菌素的主要產(chǎn)生菌。泰樂菌素主要由泰樂菌素A、脫碳霉糖泰樂菌素(desmycosin)B、大菌素(macrocin)C和雷洛菌素(relomycin)D 4種組分構(gòu)成,其 中泰樂菌素A為主要成分，且生物活性最高。泰樂菌素A的主體結(jié)構(gòu)為含有16個(gè)原子所形成的環(huán)狀內(nèi)酯即泰樂內(nèi)酯(Tylactone)，然后依次連上三個(gè)脫氧糖苷配基，三個(gè)脫氧糖苷配基的連接順序?yàn)樘济拱被?Mycaminose)7S'-脫氧 _D_ 阿洛糖(Mycinose),碳霉糖(Mycarose)見圖 I。泰樂菌素是國家三類新獸藥，具有廣譜抗菌性，除對(duì)支原體有特效外，對(duì)葡萄球菌、鏈球菌、棒狀桿菌、分支桿菌、巴氏桿菌、螺旋體等也有較強(qiáng)作用，同時(shí)它對(duì)球蟲病也有一定作用。是畜禽專用抗生素，不會(huì)給人類帶來交叉耐藥性問題。在當(dāng)前和今后一段相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)，作為禽畜專用抗生素泰樂菌素將不僅是禽畜養(yǎng)殖業(yè)用于治療禽畜支原體病的理想藥物，而且仍將是廣受歡迎的飼料添加剤。盡管目前國內(nèi)已經(jīng)有泰樂菌素的規(guī)模生產(chǎn)，但是菌種產(chǎn)素能力偏低，菌種發(fā)酵水平為11000 12000u/ml，泰樂菌素A組份含量為80% 85%。菌種選育仍處在傳統(tǒng)的選育水平，泰樂菌素產(chǎn)量有待于進(jìn)ー步的提高。而且在生產(chǎn)過程中C組份不容易向A組份轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致泰樂菌素A組份含量偏低，泰樂菌素產(chǎn)品不符合獸藥藥典標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，采用獨(dú)特方法，提供了ー種泰樂菌素基因エ程菌；本發(fā)明的另一目的是提供ー種將上述工程菌應(yīng)用于泰樂菌素生產(chǎn)的方法。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的ー種泰樂菌素基因工程菌，其構(gòu)建方法為通過PCR克隆泰樂菌素合成關(guān)鍵限速酶基因TylF及透明顫菌血紅蛋白VHb基因，利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，將大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化鏈霉菌，然后通過安普霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，用PCR進(jìn)一歩確定轉(zhuǎn)化子，最終獲得基因工程菌；所述的工程菌的具體構(gòu)建步驟為(I)設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增TylF基因和血紅蛋白基因VHb ;(2)分別將克隆得到的目的基因插入PFC119組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*下游多克隆位點(diǎn)；(3)將篩選獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，用以結(jié)合轉(zhuǎn)移；(4)將還有重組子的大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進(jìn)行熱激培養(yǎng)，然后用合適濃度的安普霉素和萘啶酮酸篩選轉(zhuǎn)化子；(5)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，獲得基因工程菌。ー種泰樂菌素基因工程菌的應(yīng)用方法，其步驟為(I)在室溫下刮取弗氏鏈霉菌Strepyomyce fradiae基因工程菌的斜面孢子；(2)將斜面孢子接種到裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，29°C，230rpm搖床中培養(yǎng)48小吋，制備成種子液； (3)在上述種子液中以重量10%的接種量將泰樂菌素基因工程菌接種到30L自動(dòng)發(fā)酵罐中，29°C培養(yǎng)，培養(yǎng)周期144h ；(4)通過分光光度計(jì)和HPLC來檢測泰樂菌素效價(jià)及泰樂菌素A組份百分含量；所述培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為種子培養(yǎng)基組成為豆餅粉0.5%，酵母膏0.5%，玉米漿0.3%，CaCO3O. 3 %，豆油
0.56%，其余為水，PH為7. 8 8. O ；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆餅粉O. 5 %，魚粉O. 97 %，玉米蛋白粉O. 97 %，玉米粉
1.77%，氯化鉀O. 1%，氯化鈉O. 1%，鹽酸甜菜堿0.05%，0· 33% CoCl2 O. 1%,0. 44% NiSO4O. I %, CaCO3 O. 2%，豆油 5%，其余為水。本發(fā)明的泰樂菌素基因工程菌為弗氏鏈霉菌(Strepyomyce fradiae) TL-209,保藏于申請(qǐng)人菌研所菌種保藏室。現(xiàn)有的泰樂菌素高產(chǎn)菌株選育采用的是傳統(tǒng)的誘變育種，選育周期長，費(fèi)時(shí)費(fèi)力效果不理想很難選育出高產(chǎn)菌株。目前エ業(yè)生產(chǎn)所用菌種的發(fā)酵水平一般為11000 1200011/1111，泰樂菌素4組分含量為80(% 85(%。本發(fā)明運(yùn)用基因工程技術(shù)手段，通過克隆TylF和VHb基因構(gòu)建重組表達(dá)載體，定向的進(jìn)行DNA改造，獲得弗氏鏈霉菌基因工程菌，能夠顯著提高泰樂菌素產(chǎn)量使其達(dá)到17000 18000u/ml，有效的提高泰樂菌素A組分的含量使其達(dá)到94 95%，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明提供了能夠提高泰樂菌素產(chǎn)量和組分A轉(zhuǎn)化率的基因工程菌構(gòu)建發(fā)法；本發(fā)明構(gòu)建的泰樂菌素基因工程菌可以直接用于泰樂菌素的エ業(yè)化生產(chǎn)，與當(dāng)前エ業(yè)生產(chǎn)中所用的泰樂菌素菌種相比能夠顯著提高泰樂菌素產(chǎn)量使其達(dá)到17000 18000u/ml，有效的提高泰樂菌素A組分的含量，使其達(dá)到94 95%，并有利于降低分離純化難度，提高收率，從而顯著降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。


圖I :泰樂菌素結(jié)構(gòu)圖；圖2 :泰樂菌素合成基因族不意圖；圖3 :泰樂菌素合成途徑示意圖；圖4 :表達(dá)重組載體構(gòu)建流程。
具體實(shí)施方式
基因工程菌TL-209的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物分別PCR克隆TylF基因和VHb基因PTl :5，-GTGGCACCTTCCCCGGACCACGCC-3’PT2 :5， -TCAGCCGCTGTGCCGCCAATAGG-3’PV3 :5’ -CGGGATCCATATGCTGGACCAGCAAACCAT-3’PV4 :5，-CGGGATCCTTTATTCAACCGCTTGAT-3，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，然后與表達(dá)載體PFC119進(jìn)行雙酶切，回收后將TylF-VHb和pFC119用T4DNA連接酶在16°C連接2小時(shí)構(gòu)建重組表達(dá)載體pFC120 (如圖2)。然后倒入大腸桿菌ET12567感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)I小時(shí)后涂布到氨芐抗性 平板上，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，然后通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法將重組表達(dá)載體PFC120導(dǎo)入弗氏鏈霉菌。具體步驟如下(I)挑取 ET12567/pUZ8002 單克隆于 50ug/ml 氯霉素，50ug/ml 卡那霉素，50ug/ml
安普霉素培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。(2)取Iml過夜培養(yǎng)的菌液接種到50ml含50ug/ml氯霉素,50ug/ml卡那霉素，50ug/ml安普霉素培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD值達(dá)到O. 5 O. 8。(3)用等體積的不含抗生素的LB培養(yǎng)基清洗菌體2次。重懸于適量的LB培養(yǎng)基中。(4)取約128個(gè)鏈霉菌的孢子于500ul的2XYT培養(yǎng)基中熱激10分鐘，然后37°C活化2小時(shí)。(5)取500ul大腸桿菌ET12567/pUZ8002于500ul熱激過的鏈霉菌孢子懸液中，快
速混合，離心去掉部分上清液,重懸細(xì)胞。(6)將混合細(xì)胞懸液涂布于平板上，16h-20h后用Iml無菌水含適量安普霉素和萘啶酮酸(用來抑制大腸桿菌的生長)來覆蓋，置29°C培養(yǎng)數(shù)天后即可看到接合子。(7)結(jié)合子的篩選，挑取結(jié)合轉(zhuǎn)化子于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)數(shù)天，提取基因組DNA，利用載體上的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。最后將篩選到TylF-VHb過表達(dá)的基因工程菌命名為TL-209。泰樂菌素在發(fā)酵法制備泰樂菌素上的應(yīng)用方法在超凈工作臺(tái)上刮取弗氏鏈霉菌(Strepyomyce fradiae)TL-209的斜面孢子,接種于裝有IOOml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，29°C，230rpm搖床上培養(yǎng)48小吋。然后以10%的接種量將工程菌接種于30L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度29°C ;溶解氧控制在40 50% ;罐壓控制在O. 04 O. 06mPa ;發(fā)酵周期為144h。利用分光光度計(jì)測定泰樂菌素化學(xué)效價(jià)18000u/ml，比出發(fā)菌株提高了 50%。泰樂菌素A組分為94%，相對(duì)于出發(fā)菌株，組分A很容易達(dá)到優(yōu)級(jí)品，解決了出發(fā)菌株組分轉(zhuǎn)化困難的問題。
權(quán)利要求
1.ー種泰樂菌素基因工程菌，其構(gòu)建方法為通過PCR克隆泰樂菌素合成關(guān)鍵限速酶基因TylF及透明顫菌血紅蛋白VHb基因，利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，將大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化鏈霉菌，然后通過安普霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，用PCR進(jìn)ー步確定轉(zhuǎn)化子，最終獲得基因工程菌。
2.如權(quán)利要求I所述的工程菌，其特征在于其具體構(gòu)建步驟為 (1)設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增TylF基因和血紅蛋白基因VHb； (2)分別將克隆得到的目的基因插入PFC119組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*下游多克隆位點(diǎn)； (3)將篩選獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，用以結(jié)合轉(zhuǎn)移； (4)將還有重組子的大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進(jìn)行熱激培養(yǎng)，然后用合適濃度的安普霉素和萘啶酮酸篩選轉(zhuǎn)化子； (5)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，獲得基因工程菌。
3.ー種泰樂菌素基因工程菌的應(yīng)用方法，其步驟為 (1)在室溫下刮取弗氏鏈霉菌Strepyomycefradiae基因工程菌的斜面孢子； (2)將斜面孢子接種到裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，29°C，230rpm搖床中培養(yǎng)48小時(shí),制備成種子液； (3)在上述種子液中以重量10%的接種量將泰樂菌素基因工程菌接種到30L自動(dòng)發(fā)酵罐中，29°C培養(yǎng)，培養(yǎng)周期144h ； (4)通過分光光度計(jì)和HPLC來檢測泰樂菌素效價(jià)及泰樂菌素A組份百分含量。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為 種子培養(yǎng)基組成為豆餅粉O. 5%，酵母膏O. 5%，玉米漿O. 3%，CaCO3 O. 3%，豆油O. 56%，其余為水，PH為7. 8 8. O ； 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆餅粉0.5%，魚粉0.97%，玉米蛋白粉O. 97%，玉米粉I. 77%，氯化鉀 O. 1%，氯化鈉 O. 1%，鹽酸甜菜堿 0.05%，0· 33% CoCl2 O. 1%,0. 44% NiSO4 O. 1%,CaCO3 O. 2%，豆油5%，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種泰樂菌素基因工程菌，其構(gòu)建方法為通過PCR克隆泰樂菌素合成關(guān)鍵限速酶基因TylF及透明顫菌血紅蛋白VHb基因，利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，將大腸桿菌ET12567/pUZ8002與弗氏鏈霉菌孢子進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化鏈霉菌，然后通過安普霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，用PCR進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化子，最終獲得基因工程菌。本發(fā)明構(gòu)建的泰樂菌素基因工程菌可以直接用于泰樂菌素工業(yè)化生產(chǎn)，與當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)中所用的泰樂菌素菌種相比能夠顯著提高泰樂菌素產(chǎn)量使其達(dá)到17000～18000u/ml，有效的提高泰樂菌素A組分的含量使其達(dá)到94～95％。
文檔編號(hào)C12P19/62GK102690775SQ201210179669
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者任勇, 劉建成, 徐淑芬, 王 義, 王文超 申請(qǐng)人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司