專利名稱：結(jié)核分枝桿菌特異性標(biāo)志物Rv1284的重組蛋白、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥體外診斷試劑領(lǐng)域，特別涉及一種結(jié)核分枝桿菌特異性標(biāo)志物Rvl284重組蛋白、其制備方法及其在結(jié)核免疫診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
開發(fā)簡便、快速和準(zhǔn)確可靠的診斷結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染，對于結(jié)核病的控制具有重要意義。目前MTB感染的診斷方法有很多，但臨床最為常用的方法仍然依靠傳統(tǒng)的痰涂片細(xì)菌學(xué)檢查，但檢出率低；MTB培養(yǎng)可做為結(jié)核病確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其培養(yǎng)時間太長，一般4-6周，難以滿足臨床需要；Bactec技術(shù)雖縮短了培養(yǎng)時間，但費用較高，短時間內(nèi)難以推廣普及；X線和CT檢查僅提供影像學(xué)可能性診斷；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)及其它基因診斷方法作為臨床診斷尚存在操作復(fù)雜，對技術(shù)和人員專業(yè)素質(zhì)要求較高，且仍不能用于菌陰結(jié)核病的快速診斷。而MTB感染的血清免疫學(xué)診斷以其固有的操作簡便、快速、可用肉眼判斷結(jié)果、穩(wěn)定性好、便于推廣、無需特殊精密儀器等優(yōu)勢，是迄今最可能滿足經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)和結(jié)核病高發(fā)區(qū)所亟需的結(jié)核病診斷技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌Rv1284重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通過使用pET32a質(zhì)粒，在Rvl284該天然蛋白序列前面加了一段Trx Taq和S Taq融合標(biāo)簽及His Tag純化標(biāo)簽。所述Trx Taq和S Taq融合標(biāo)簽及His Tag純化標(biāo)簽的氨基酸序列由SEQ IDNO: I中從氨基末端第I至第165位氨基酸殘基序列組成。SEQ ID NO: I中從氨基末端第166至第313位氨基酸殘基序列組成天然Rvl284蛋白氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼上述的Rvl284重組蛋白的核苷酸序列，其具有選自下列C)、d)或e)的核苷酸序列c) SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQ ID NO: 2但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 2所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；e)在嚴(yán)格雜交條件下與上述c)或d)中的序列雜交，并且編碼具有所述Rvl284重組蛋白活性的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的在于提供所述的結(jié)核分枝桿菌Rvl284重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(I)制備結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA ；(2)擴(kuò)增 Rvl284 基因;(3) Rv1284基因插入表達(dá)質(zhì)粒；(4)將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；
(5)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白Rvl284 ；(6)分離純化誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，得到Rvl284重組蛋白，其中，在制備結(jié)核分枝桿菌Rvl284基因中采用的引物為Rvl284-F和Rvl284-R，所述引物Rvl284-F的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述引物Rvl284_R的核苷酸序列如SEQ ID No:4 所示。本發(fā)明的再一目的在于提供所述結(jié)核分枝桿菌Rvl284重組蛋白或所述Rv1284重組蛋白的基因引物在制備檢測或診斷結(jié)核病的試劑中的應(yīng)用。所述Rv3120重組蛋白的基因引物為Rvl284-F和Rvl284-R，Rvl284_F的核苷酸序列為如SEQ IDNo: 3 (TAGGATCCAGCGGTTTCAAGGGC)所示，Rvl284_R 的核苷酸序列為如 SEQ ID No:4(ATTCTCGAGGGGCGTGACCTCGTTG)所示。 本發(fā)明的再一目的在于提供結(jié)核分枝桿菌Rvl284重組蛋白、其特異性抗體或所述Rvl284重組蛋白的基因引物在制備結(jié)核病檢測試劑盒中的應(yīng)用。所述Rv3120重組蛋白的基因引物為Rvl284-F和Rvl284-R，Rvl284_F的核苷酸序列為如SEQ IDNo: 3 (TAGGATCCAGCGGTTTCAAGGGC)所示，Rvl284_R 的核苷酸序列為如 SEQ ID No:4(ATTCTCGAGGGGCGTGACCTCGTTG)所示。本發(fā)明的再一目的在于提供一種結(jié)核病檢測試劑盒，其組分中的檢測抗原是所述結(jié)核分枝桿菌Rvl284重組蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供一種新型結(jié)核診斷試劑，其含有所述結(jié)核分枝桿菌Rv 1284重組蛋白。本發(fā)明的再一個目的是提供上述試劑的制備方法。本發(fā)明的一個方面，提供了一種包含所述結(jié)核分枝桿菌Rvl284基因的重組質(zhì)粒，即將Rvl284基因序列插入商用表達(dá)質(zhì)粒序列中。Rvl284基因NCBI登陸號為BX842576. I ；蛋白號為CAA97750. I。本發(fā)明的“Rvl284基因序列”也包括對BX842576. I中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與BX842576. I核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼相同的氨基酸序列。該術(shù)語還包括在中度嚴(yán)密條件下，更佳地在高度嚴(yán)密條件下與BX842576. I的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與BX842576. I的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。本發(fā)明的重組質(zhì)粒，通常將Rvl284基因插入表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點處得到。本發(fā)明的重組質(zhì)粒在制備過程中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，然后將編碼本發(fā)明的核苷酸序列可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成蛋白表達(dá)載體。本發(fā)明中可采用的載體有pET32a等。本發(fā)明的一個實施例中，所用的質(zhì)粒為pET32a。本發(fā)明的另一方面，提供了一種結(jié)核分枝桿菌相關(guān)重組蛋白，該蛋白是將插入Rvl284基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞而得到的。用作檢測試劑的Rvl284重組蛋白與NCBI上的CAA97750. I蛋白序列相比，加入了載體相關(guān)序列和純化標(biāo)簽。例如，使用pET32a質(zhì)粒時,蛋白序列如面加了 pET32a上的相關(guān)序列和一段His Tag純化標(biāo)簽。所用的宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)與表達(dá)質(zhì)粒相匹配?？墒褂迷思?xì)胞或者真核細(xì)胞等，例如常用的大腸桿菌(E. coli)。用于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以是BL21 (DE3)或BL21 plysS (DE3)菌株等。本發(fā)明的一個實施例中所用的就是BL21 plysS (DE3)菌株。本發(fā)明的另一方面，提供了上述結(jié)核分枝桿菌相關(guān)蛋白的制備方法，包括以下步驟(I)結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA的制備；(2) Rv1284 基因的擴(kuò)增；(3) Rv1284基因插入表達(dá)質(zhì)粒；(4)將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；(5)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白Rvl284 ；
(6)分離純化誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，得到Rvl284重組蛋白。上述制備方法中，各種實驗參數(shù)均按常規(guī)操作選擇，可視具體實驗條件而定。本發(fā)明的Rvl284基因序列可以用PCR擴(kuò)增法獲得?？筛鶕?jù)本發(fā)明所公開的相關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的基因組DNA為模板，擴(kuò)增而得到相關(guān)序列。本發(fā)明中，重組蛋白所用的表達(dá)質(zhì)?？梢允莗ET32a等。本發(fā)明的一個實施例中，重組蛋白Rvl284按如下方法得到設(shè)計引物Rvl284-F (SEQ ID No:3) :TAGGATCCAGCGGTTTCA AGGGC;Rvl284-R (SEQ ID No:4) :ATTCTCGAGGGGCGTGACCTCGTTG ；以H37Rv株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Rvl284基因，該基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后雙酶切，克隆構(gòu)建質(zhì)粒。測序表明所插入的序列與GeneBank中H37Rv結(jié)核全基因組對應(yīng)基因序列(Rvl284基因NCBI登陸號為BX842576. I ;蛋白號為CAA97750. I)完全一致。將驗證好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)。本發(fā)明中，表達(dá)Rvl284蛋白所用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌的BL21 (DE3)菌株或BL21plysS (DE3)菌株。本發(fā)明中，誘導(dǎo)表達(dá)Rv1284蛋白可采用多種方法，如使用異丙基_ P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。本發(fā)明中，分離純化重組Rvl284蛋白也可采用多種方法，如親和層析、離子交換層析等。本發(fā)明的一個實施例中，重組Rvl284蛋白可以按如下方法獲得將鑒定好的重組質(zhì)粒加入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置45min，42°C水浴鍋中熱擊90秒，冰浴3min，加入500ul的不含抗生素的預(yù)熱的LB培養(yǎng)基。37°C搖床，220rmp，培養(yǎng)45_60min。取一定量在含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫干燥后倒置于37°C溫箱中培養(yǎng)過夜。挑取克隆，放入含50ug/ml氨芐青霉素的抗性的LB液體培養(yǎng)基中，220rmp，37°C培養(yǎng)OD至0.6左右，加入IPTG，37°C 3h，收集IPTG誘導(dǎo)后的菌體，重懸后超聲破碎。目的蛋白含于上清中，IOOOOg離心30min，收集上清。用IMAC親和色譜柱(柱體積1ml)進(jìn)行親和純化(2ml去離子水沖洗，5ml washing Buffer I (KCl :300mM; KH2PO4 :50mM ;咪唑5mM, pH 8. 0)平衡，6ml含目的蛋白上清上樣，6ml washing BufferI沖洗,6ml含IOmM咪唑的washing Buffer2 (KCl :300mM;KH2PO4 :50mM ;咪唑10mM，pH 8.0)沖洗，IOml Elution Buffer 洗脫(KCl :300mM ；KH2PO4 50mM ;咪唑250mM，pH 8. 0)，收集過柱純化的目的蛋白，用 20mM Tris-HCl,pH 8. 0的溶液透析，IOkDa超濾管對透析后的目的蛋白液進(jìn)行濃縮，用BCA法測定純化后目的蛋白的濃度。本發(fā)明的另一方面，提供了重組蛋白Rvl284在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。Rvl284是同源四聚體，P -碳酸酐酶家族的一個成員。本發(fā)明的重組蛋白用于結(jié)核病檢測試劑盒的制備，可以用重組Rvl284進(jìn)行免疫反應(yīng)，也可以用Rvl284基因引物對患者痰液進(jìn)行PCR，從而達(dá)到檢測目的。本發(fā)明的試劑盒主要基于抗原抗體反應(yīng)原理，例如，采用凝集反應(yīng)，沉淀反應(yīng)，免疫突光技術(shù)，E花環(huán)反應(yīng)，ELISA反應(yīng)等。如反應(yīng)結(jié)果呈陽性,則認(rèn)為該檢測者患有結(jié)核病。
其ELISA實施方法參考實施例3。現(xiàn)有技術(shù)中仍然缺乏快速有效地診斷方法。目前廣泛應(yīng)用的結(jié)核病診斷技術(shù)仍依賴于皮試檢測試劑結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(pro)。然而pro操作相對耗時，且需皮下注射，診斷價值有限。本發(fā)明基于免疫組學(xué)的研究成果，首次報道了結(jié)核菌分泌蛋白RV1284可以應(yīng)用于結(jié)核病診斷，且是一個強免疫活性的結(jié)核病標(biāo)志物，用于結(jié)核病診斷，具有較高的敏感性高，且更為簡便、快速和安全可靠。此外，與天然結(jié)核分枝桿菌RV1284蛋白相比，該重組蛋白更易采用親和層析的方法進(jìn)行純化，純度可達(dá)90%以上，不僅大大降低了其生產(chǎn)成本，而且也具有更高的穩(wěn)定性，該重組蛋白在不凍干且不加蛋白保護(hù)劑的情況下-20°C可保存2個月，_80°C至少保存6個月。


圖I是重組蛋白Rvl284親和純化的SDS-PAGE圖。I是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2是IPTG誘導(dǎo)前；3是IPTG誘導(dǎo)后；4是破碎上清；5是樣品流穿峰；6是washing Buffer I峰；7是washing Buffer II峰；8是純化后的目的蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本方面的內(nèi)容。實施例II、重組質(zhì)粒pET32a_Rvl284的構(gòu)建(I)靶基因引物設(shè)計Rvl284-F (SEQ ID No:3) :TAGGATCCAGCGGTTTCAAGGGC;Rvl284-R (SEQ ID No:4) :ATTCTCGAGGGGCGTGACCTCGTTG ；酶切位點分別為BamH I, Xho I。(2)靶基因的PCR擴(kuò)增、克隆及序列測定
以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，Rvl284_F和Rvl284_R為引物，應(yīng)用Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)，通過PCR直接擴(kuò)增Rvl284蛋白基因。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min ；(94°C,30s ；60°C,30s ；72°C,40s)30 個循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，后用DNA回收試劑盒(Invitrogen)回收。用BamH I、Xho I酶切，克隆構(gòu)建入pET32a質(zhì)粒BamH I、Xho I酶切位點中。測序表明所插入的序列和GeneBank中H37Rv結(jié)核全基因組相應(yīng)基因序列(Rvl284基因NCBI登陸號為:BX842576. I ;蛋白號為CAA97750. I)完全一致。2、重組蛋白Rvl284的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將IOOul BL21 (DE3) physS感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)放入冰上3_5分鐘后融化，將0. 5ul測序正確的重組pET32a-Rvl284質(zhì)粒放入感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置45min，42°C水浴鍋中，熱擊90s，冰上靜置3min，加入500ul的不含抗生素的預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37°C搖床，220rmp，培養(yǎng)45_60min。取一定量在含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫干燥后倒置于37°C溫箱中培養(yǎng)過夜。挑取克隆,放入含50ug/ml氨節(jié)青霉素的抗性的LB液體培養(yǎng)基中，220rmp，37°C培養(yǎng)OD至0. 6左右，加入終濃度為ImM IPTG，37°C 3h，收集IPTG誘 導(dǎo)后的菌體，按IOmlWashing Buffer I每克濕菌的比例重懸后超聲破碎。結(jié)果目的蛋白含于上清中。IOOOOg離心30min，收集上清。用IMAC親和色譜柱(Bio-Rad)進(jìn)行親和純化(2ml 去離子水沖洗，5ml washing Buffer I (KCl 300mM; KH2PO4 50mM ;咪唑5mM, pH 8. 0)平衡，6ml含目的蛋白上清上樣，6ml washing Buffer I沖洗,6ml含IOmM咪唑的washingBuffer 2 (KCl :300mM;KH2P04 :50mM ;咪唑10mM，pH 8.0)沖洗，IOml Elution Buffer 洗脫(KCl 300mM ;KH2P04 :50mM ;咪唑250mM，pH 8. 0)，收集過柱純化的目的蛋白(圖1)，用20mMTris-HCl,pH 8. 0的溶液透析，IOkDa超濾管對透析后的目的蛋白液進(jìn)行濃縮，SDS-PAGE電泳檢測，該重組蛋白純度達(dá)90%，BCA法測定純化后目的蛋白的濃度。本實施例的重組蛋白親和純化后，純度可達(dá)90%以上，不僅大大降低了其生產(chǎn)成本，而且也具有更高的穩(wěn)定性，該重組蛋白在不凍干且不加蛋白保護(hù)劑的情況下_20°C可保存2個月，_80°C至少保存6個月。
實施例2以結(jié)核分枝桿菌ESAT-6抗原和16kDa抗原作為對照，評估重組Rvl284抗原作為檢測試劑對健康對照血清和結(jié)核病人血清中IgG的反應(yīng)效果。利用ELISA方法檢測不同血清標(biāo)本中抗Rvl284的IgG反應(yīng)。具體步驟是96孔板用抗原Rvl284 (2. g/ml)、ESAT-6 (本課題組根據(jù)下文中描述的常規(guī)技術(shù)重組表達(dá))(5. Ou g/ml)或16kDa抗原(本課題組根據(jù)下文中描述的常規(guī)技術(shù)重組表達(dá))(20y g/ml)包被過夜，棄去包被液，PBST洗滌5次，甩干。每孔加入300iil含1%BSA的PBST，37°C溫育2h。甩干，每孔加入IOOiU用含1%BSA的PBST稀釋的待檢血清(1:50)，37°C溫育0. 5h。棄去血清，PBST洗滌5次，甩干。每孔加入100 ill用含1%BSA的PBST 1:20000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(Jackson，USA)，37°C溫育0. 5h。棄去液體，PBST洗滌5次，甩干。每孔加入100111新鮮配置的底物液(4出=1:1)，371避光溫育101^11。每孔加入50 ill 2M硫酸終止反應(yīng)，450nm檢測OD值。以健康對照者血清標(biāo)本的平均OD值加2倍標(biāo)準(zhǔn)方差作為Cutoff的判斷標(biāo)準(zhǔn)。若血清標(biāo)本的OD值大于或等于此標(biāo)準(zhǔn)，即判斷為陽性，反之為陰性。備注
結(jié)合分枝桿菌特異性抗原ESAT6和16kDa (HspX)蛋白是現(xiàn)有常用的診斷抗原，重組抗原ESAT6和16kDa(HspX)蛋白的常規(guī)制備方法為以結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，用蛋白的特異性引物按常規(guī)基因工程方法構(gòu)建pET21a-esat6或pET21a_hspX重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)physS表達(dá)菌株，ImM IPTG 37°C誘導(dǎo)3h即可獲得大量的重組蛋白，鎳柱親和純化其純度達(dá)90%以上，將重組蛋白用20mM Tris-HCl, pH 8. 0透析后超濾濃縮，BCA法檢測蛋白濃度，按Img/管分裝，凍干保存。結(jié)果表明，重組Rvl284蛋白抗原與ESAT_6、16kDa抗原相比，在診斷結(jié)核病方面具有相似的敏感性和特異性。其在結(jié)核病人血清中IgG的陽性率為26. 8%( 19/71)，與健康對照相比，其檢測特異性特異性為90.0% (45/50)(表I)。在檢測結(jié)核病人的敏感性方面，重組蛋白Rvl284比ESAT-6和16kDa抗原高。本發(fā)明的重組Rvl284蛋白可以單獨作為診斷試劑，也可以與現(xiàn)有已知的診斷抗原聯(lián)合，從而提高檢測結(jié)核病人的敏感性。表I重組蛋白Rvl284和ESAT-6、16kDa抗原分別對健康對照血清和結(jié)核病人血清IgG反應(yīng)結(jié)果病例數(shù)12權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌RV1284重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通過使用pET32a質(zhì)粒,在Rvl284該天然蛋白序列前面加了一段Trx · Taq和S · Taq融合標(biāo)簽及His · Tag純化標(biāo)簽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Rvl284重組蛋白，其特征在于,所述Trx· Taq和S · Taq融合標(biāo)簽及His · Tag純化標(biāo)簽的氨基酸序列由SEQ ID NO: I中從氨基末端第I至第165位氨基酸殘基序列組成。
3.一種編碼權(quán)利要求I或2所述的Rvl284重組蛋白的核苷酸序列，其特征在于具有選自下列C)、d)或e)的核苷酸序列 c)SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； d)不同于SEQID NO: 2但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 2所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列； e)在嚴(yán)格雜交條件下與上述c)或d)中的序列雜交，并且編碼具有所述Rvl284重組蛋白活性的核苷酸序列。
4.一種包含權(quán)利要求3所述結(jié)核分枝桿菌Rvl284基因的重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核分枝桿菌Rvl284重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)制備結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA； (2)擴(kuò)增Rvl284基因； (3)Rv1284基因插入表達(dá)質(zhì)粒； (4)將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞； (5)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白Rvl284； (6)分離純化誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，得到Rvl284重組蛋白， 其中，在制備結(jié)核分枝桿菌Rv1284基因中采用的引物為Rv1284-F和Rv1284-R，所述引物Rvl284-F的核苷酸序列如SEQ IDNo: 3所示，所述引物Rvl284_R的核苷酸序列如SEQID No:4 所示。
6.權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核分枝桿菌Rvl284重組蛋白或者其基因引物在制備檢測或診斷結(jié)核病的試劑中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Rvl284重組蛋白的基因引物為Rvl284-F和Rvl284-R，所述Rvl284_F的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述引物Rvl284-R的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
8.如權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核分枝桿菌Rvl284蛋白、其特異性抗體或其基因引物在制備結(jié)核病檢測試劑盒中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Rvl284重組蛋白的基因引物為Rvl284-F和Rvl284-R，所述Rvl284-F的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述引物Rvl284-R的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
10.一種結(jié)核病檢測試劑盒，其特征在于，其組分中的檢測抗原是權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核分枝桿菌Rvl284重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種結(jié)核分枝桿菌特異性標(biāo)志物Rv1284的重組蛋白，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供所述結(jié)核分枝桿菌Rv1284重組蛋白的編碼核苷酸序列、所述重組蛋白的制備方法及其用途。本發(fā)明基于免疫組學(xué)的研究成果，首次報道了結(jié)核菌分泌蛋白Rv1284可以應(yīng)用于結(jié)核病診斷，且是一個強免疫活性的結(jié)核病標(biāo)志物，用于結(jié)核病免疫學(xué)診斷，具有較高的敏感性高，且更為簡便、快速和安全可靠。
文檔編號C12N15/62GK102718871SQ20121017967
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者孫戰(zhàn)強, 張湘燕, 張舒林, 王洪海, 趙俊偉, 郭曉奎 申請人:上海交通大學(xué)