專利名稱：Blad cd18野生型和突變型雙基因型(a/g型)雜合子質(zhì)粒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及質(zhì)粒的構(gòu)建方法，特別涉及一種BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
奶牛白細(xì)胞黏附缺陷癥(bovineleukocyte adhesion deficiency,BLAD)是一種發(fā)生于發(fā)生于荷斯坦(Holstein)奶牛的常染色體的隱性致死性的遺傳性免疫缺陷疾病，其致病機理和人的白細(xì)胞黏附缺陷病(leukocyte adhesion deficiency, LAD)相同，是由白細(xì)胞表面的整合素i32(CD18)所編碼區(qū)域的基因序列中第383位的堿基A突變?yōu)镚所引起的，與之對應(yīng)的天門冬氨酸變?yōu)楦拾彼?，?dǎo)致白細(xì)胞表面的整合素β 2表達(dá)量明顯減少或缺乏，不能與整合素a亞單位(CDll)以非共價鍵相連構(gòu)成異源二聚體而形成整合素分子，進(jìn)而在發(fā)生炎癥時外周血液中的中性粒細(xì)胞無法通過表面的整合素糖蛋白分子與血管內(nèi)皮黏附分子相互作用而黏附到血管內(nèi)皮上，進(jìn)而無法穿過血管壁在基質(zhì)中向炎性部位趨化，也就無法最終到達(dá)病原侵入部位，對病原體直接做出反應(yīng)。但由于病原不斷的刺激，機體的白細(xì)胞不斷增多，久之造成了機體的免疫力低下。BLAD多發(fā)生于1-14月齡的荷斯坦牛，雙親均可為攜帶者。臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的反復(fù)性感染、膿液形成減弱、傷口愈合緩慢和白細(xì)胞增多，同時表現(xiàn)為犢牛初生體重低和發(fā)育 遲緩等癥狀。出生小牛為致病純合體時，臨床上表現(xiàn)發(fā)病，為反復(fù)性感染發(fā)炎、生長發(fā)育受阻、嗜中性粒細(xì)胞增多等癥狀，通常很快死亡，所以BLAD常見于不到I歲的荷斯坦牛。BLAD的主要癥狀是食欲不好，鼻鏡腫脹、有脫斑。廣泛的淋巴結(jié)增生，頜下淋巴結(jié)腫大，為正常的3-5倍，口腔黏膜、齒齦黏膜壞死性潰瘍，齒齦萎縮，病程長者前白齒脫落。上、下頜骨增厚，發(fā)生骨質(zhì)吸收和溶解。輕度腹瀉，胃炎、小腸腸炎，回腸發(fā)生潰瘍性腸炎。慢性咳嗽，有的表現(xiàn)為偽膜性鼻炎、壞死性喉炎、卡他性支氣管肺炎，還可觀察多發(fā)性肺壞死灶。加耳標(biāo)簽所造成的損傷可引起耳膿腫變形，滲出物為黃色清水樣。病牛還表現(xiàn)不愛運動，生長緩慢，嚴(yán)重者體重僅為正常體重的40%，胸腹側(cè)水腫較明顯?；寂Ｐ枰l繁或長期的抗生素治療。發(fā)病較輕者，采用這種方法可存活一定時間，但不能得到根本上的治療。近30年來，我國從美國、加拿大及澳大利亞等進(jìn)口大量的活牛，其中大部分為荷斯坦牛，由于BLAD有害基因多以雜合的狀態(tài)存在，攜帶者并不發(fā)病，加之對此病沒有足夠的認(rèn)識和重視，不可避免地引入大量潛在的BLAD攜帶者，而攜帶者表現(xiàn)正常，很難發(fā)現(xiàn)，一旦被發(fā)現(xiàn)時，其已經(jīng)在畜群中進(jìn)行了長時期的傳播。BLAD患牛出生后生長發(fā)育極差，其中絕大多數(shù)在I年內(nèi)死亡，只有極少數(shù)可存活2年左右，而幸存到2年左右的奶牛沒有繁殖和哺育能力，從長期來看，引入有害基因?qū)⒔o中國養(yǎng)牛業(yè)和乳制品行業(yè)的發(fā)展帶來重大的經(jīng)濟損失。BLAD遺傳缺陷的發(fā)現(xiàn)引起了各國奶牛育種協(xié)會和育種工作者的重視，美國、日本、丹麥、荷蘭等國已相應(yīng)建立了種公牛遺傳缺陷基因的分子檢測方法和育種計劃，將BLAD造成的損失降低。我國擁有700萬頭以上的荷斯坦奶牛，由于缺乏簡便有效的BLAD隱性有害基因的檢測方法，無法開展常規(guī)檢測和大規(guī)模的普查統(tǒng)計，因此對我國牛群中BLAD的發(fā)病和攜帶情況尚不十分清楚，也就更談不上從牛群中凈化BLAD。我國急需建立快速、敏感、穩(wěn)定可靠的BLAD檢測方法，開展積極的BLAD致病基因篩查，從而阻斷BLAD致病基因的下傳。CN 102002527A公開了一種用于檢測牛CD18基因D128G突變的引物和特異性的Taqman MGB探針，利用這些引物和探針，采用實時熒光定量PCR技術(shù)，能夠快速靈敏地檢測待測牛CD18基因D128G突變位點基因型，從而準(zhǔn)確篩查BLAD遺傳缺陷攜帶者。CN 100419088C公開了一種篩選⑶18基因正常的優(yōu)良種牛的方法及其專用引物。其引物是由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列組成的引物對。該方法是以待測牛的基因組DNA為模板，在由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列所組成的引物對的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴增，檢測擴增片段自5’端第32位堿基為A、G還是N，擴增片段自5’端第32位堿 基為A的種牛為⑶18基因正常的優(yōu)良種牛；所述N為A和G的雜合體。CN 10189951IA公開了一種應(yīng)用AS-PCR檢測牛白細(xì)胞黏附缺陷的方法，其通過制備一種用于牛黏附缺陷檢測方法的特異性PCR引物，所述引物包括CD18基因擴增引物突變型擴增引物長度為500bp ;引物I :5’ AAGATGACGAGGAGCAGAA 3’，引物2 :5’ GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3’ ；野生型擴增產(chǎn)物長度為818bp ;引物3 :5 ’ CAAGGGCTACCCCATCGA 3 ’，引物 4 :5 ’ CAGGACTGCGTGGCTAAA 3 ’。該引物可直接應(yīng)用于在體外開展牛黏附缺陷的致病基因的篩選。上述方法均為檢測BLAD⑶18基因缺陷提供了選擇，但各種方法之間缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，為大規(guī)模的普查統(tǒng)計帶來了難度，不利于開展大型的BLAD致病基因篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供一種BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，以便以該質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，在此基礎(chǔ)上，能夠建立起方便、高效且特異的檢測BLAD的方法，進(jìn)而為測定奶牛群中BLAD發(fā)生頻率和BLAD檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，使大規(guī)模BLAD致病基因的篩查成為可能，以此不僅可以掌握BLAD基因攜帶和發(fā)病情況，還可以排除隱性有害基因的攜帶者，避免和降低種公牛傳播擴散有害基因的風(fēng)險，最終為有效預(yù)防和治療BLAD做出貢獻(xiàn)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一、構(gòu)建BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)野生型(A/A型)質(zhì)粒采用如下步驟(I)以正常牛基因組DNA為模板，以上游引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’，下游引物 R :5’ -AGGGGAA GATGGAGTAGCTG-3’ 建立起 50 μ L 的 PCR 反應(yīng)體系，擴增BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)目的片段。在O. 2mL的PCR管中加入2 μ L (50ng)的?；蚪M DNA、5y L 的 10XE*Taq buffer、4y L 的 dNTP (各 I. 5mM)、2y L 濃度為 10 μ M 的上游引物F、2 μ L濃度為10 μ M的下游引物R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，40個循環(huán)。(2)步驟(I)的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker條帶比較，得到大小為1070bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。(3)用OMEGA公司的Gel extraction kit對步驟(I)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，步驟如下①將步驟(I)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳；②在紫外透照臺上將目的片段快速切下，放入已經(jīng)稱重的兩個I. 5mL離心管中，然后稱重，得出膠塊的重量；③根據(jù)膠重按每毫克加一微升的量加入Binding Buffer,放55_60°C金屬浴中加熱直至膠完全溶解，期間每隔2-3min振蕩混合，使之充分融化；④吸取200 μ L Buffer GPS平衡緩沖液至裝有Hibind DNA結(jié)合柱的2mL收集管，室溫放置3-5min,室溫下12000xg離心2min,棄掉收集管中濾液,將柱子重新裝回收集管；⑤將溶膠轉(zhuǎn)入結(jié)合柱中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；
⑥棄掉濾液，向結(jié)合柱加入300 μ L Binding Buffer, IOOOOxg離心Imin ；⑦棄掉濾液，向結(jié)合柱中加入700 μ L SPff Wash Buffer(含無水乙醇)，IOOOOxg離心 Imin ；⑧棄掉濾液，重復(fù)⑦一次；⑨棄掉濾液，13000xg離心2min,將液體甩干；⑩將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移至一新的I. 5ml離心管中，加入30 μ L ddH20或Elution Buffer于結(jié)合柱中，室溫靜置2min，13000xg離心lmin，棄掉結(jié)合柱，管中為回收的DNA片段，置于-20°C保存。(4)將步驟(3)回收的DNA片段連接T載體從而獲得BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)野生型(A/A型)質(zhì)粒模板。連接反應(yīng)體系為10 μ L，由3μ L回收的PCR產(chǎn)物、5μ L的2XRapidLigation Buffer、I μ L 的 PGEM-T Easy vector 和 I μ L 的 T4DNA Ligase 組成。置于 4°C恒溫水浴箱連接過夜。(5)按照如下步驟轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物①將感受態(tài)細(xì)胞從_80°C冰箱中取出之后置于冰上融化；②取10 μ L連接產(chǎn)物加入融化后的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；③冰浴30min ；④42°C水浴熱激90s，再在冰上冷激3min ；⑤加入400 μ L無抗性的經(jīng)37 °C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37 °C 150rpm震蕩培養(yǎng)90min ；⑥3000rmp離心2min，棄掉部分上清，留下約100 U L液體，然后重懸，加入7 μ LIPTG和40 μ L X-gal，用涂布棒涂布于有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16小時，然后進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定。(6)按照如下步驟篩選與鑒定重組的BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)野生型(A/A型)質(zhì)粒①挑取白斑于6mL含有氨節(jié)青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基,37°C 200rmp振蕩培養(yǎng)12-16個小時；②以培養(yǎng)好的菌液為模板分別進(jìn)行PCR鑒定；③將PCR測定為陽性的菌液進(jìn)行保菌，取500 μ L菌液加500 μ L滅菌甘油于I. 5mL尚心管中，混勾并標(biāo)記后放入_80 C冰箱中保存待用；④將PCR鑒定陽性的菌液進(jìn)行測序，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。
(7)按照如下步驟提取重組的BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)野生型(A/A型)質(zhì)粒將菌液用OMEGA公司的Plasmid mini kit I進(jìn)行陽性質(zhì)粒的提取,步驟如下①取保存菌液200 μ L于3mL有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C 200rmp振蕩培養(yǎng)12-16個小時；②取2mL菌液于I. 5mL離心管中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；③棄掉上層培養(yǎng)液，向細(xì)菌沉淀中加入250 μ L Solution I (含RNase A)，進(jìn)行徹底地渦旋混勻；④加入250 μ L Solution II,上下顛倒4-6次,輕輕混勻，室溫下溫育2min ；⑤加350yL Solution III，輕輕混勻至出現(xiàn)白色絮狀物，然后室溫下13000xg離 心 IOmin ；⑥小心轉(zhuǎn)移上清液到一個2mL的裝有DNA結(jié)合柱的收集管中(DNA結(jié)合柱的平衡方法同切膠回收),注意不要吸進(jìn)沉淀,室溫下IOOOOxg離心Imin ；⑦棄濾液，加500yL Buffer HB, IOOOOxg 離心 lmin,除去蛋白；⑧棄濾液，加700 μ L DNA Wash Buffer (含無水乙醇)，IOOOOxg 離心 Imin ；⑨棄濾液，重復(fù)⑧一次；⑩棄濾液，13000xg離心2min,將液體甩干；將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移至一新的I. 5mL離心管中，加入30 μ L ddH20或Elution Buffer于結(jié)合柱中，室溫靜置2min, 13000xg離心lmin,棄掉結(jié)合柱，管中為提取的BLAD CD18基因標(biāo)準(zhǔn)野生型(A/A型)質(zhì)粒DNA，置于_20°C保存；取2 μ L質(zhì)粒DNA，微型紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度為145ng/ μ L，其0D260/0D280比值為
I.844，符合要求。二、構(gòu)建BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)突變型(A/G型)質(zhì)粒采用如下步驟(I)以上述步驟一、(3)回收的BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)野生型(Α/Α型)DNA片段為模板，上游引物 CD18Flink :5’ -GCCAAGGGCTACCCCATCGGCCTGTACTACCTGATGGAC-3’ 和下游引物CD18R :5’ -AGGGGAAGATGGAGTAGCTG-3’建立起50 μ L的PCR反應(yīng)體系，擴增突變型短片段。在0. 2mL的PCR管中加入2μ L (50ng)的步驟一、(3)回收的DNA片段、5 μ L的10XE*Taqbuffer、4y L 的 dNTP (各 2. 5mM)、2y L 濃度為 10 μ M 的上游引物 CD18Flink、2 μ L 濃度為10 μ M的下游引物⑶18R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94V變性30s、60 V退火30s、72°C延伸60s，40個循環(huán)。(2 )反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker條帶比較,得到大小為162bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。(3)切膠回收步驟(I)的PCR產(chǎn)物，方法與所述步驟一、(3)相同。(4)以所述步驟一、(3)回收的DNA片段為模板，引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3 ’為上游引物，步驟(2 )獲得的突變型短片段為下游引物，建立起50 μ L的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行二次擴增以獲得完整的BLAD CD18突變基因型(G/G)目的片段。在0. 2mL的PCR管中加入 2μ L(50ng)的步驟一、(3)回收的 DNA 片段、5 μ L 的 10XE*Taq buffer、4y L的dNTP (各2. 5mM)、2y L濃度為10 μ M的上游引物eC18F、2y L濃度為10 μ M的下游引物突變型短片段、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，30個循環(huán)。
(5 )反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker條帶比較,得到大小為1070bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。(6)按照與所述步驟一、(3)相同的方法回收步驟(4)的PCR產(chǎn)物。(7)將步驟(6)回收的DNA片段連接T載體從而獲得BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)突變型(A/G型)質(zhì)粒模板，方法與所述步驟一、(4)相同。(8)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，方法與所述步驟一、(5)相同。(9)篩選與鑒定重組的BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)突變型(A/G型)質(zhì)粒，方法與所述步驟一、(6)相同。(10)提取重組的BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)突變型(A/G型)質(zhì)粒，方法與所述步驟一、
(7)相同。取2μ L質(zhì)粒DNA，微型紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度為156ι^/μ ，其0D260/0D280比值為I. 82，符合要求。三、BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒及其構(gòu)建一種BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，其是通過EcoRI酶切產(chǎn)生黏性末端后反向連接BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和野生基因型片段(Α/Α)的連接產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)片段的比例為1:1。1:1的比例可以避免因為野生基因型和突變基因型濃度測量誤差而導(dǎo)致的基因比例的不確定性，從而能夠精確地模擬雜合子基因組，嚴(yán)格實現(xiàn)野生型和突變型比例相等。所述BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括如下步驟(I)PCR擴增BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)片段并回收，方法如前述步驟一、(I)
一、(3)所述；(2)PCR擴增BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段并回收，方法如前述步驟二、( I)
二、(6)所述；(3)用EcoRI對步驟(I)和步驟(2)的回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切和連接，獲得野生型和突變型串聯(lián)的目的片段。其內(nèi)切酶消化體系為10 μ L，由IyL IOXHotstartTaq Buffer、IuL EcoRIUuL DNA步驟(I)的回收產(chǎn)物、I μ L步驟(2)的回收產(chǎn)物和6 μ L滅菌去離子水組成；反應(yīng)條件為37°C消化lh，90°C變性15min。(4)將步驟(3)獲得的野生型和突變型串聯(lián)的目的片段與T載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為10 μ L，由3 μ L的野生型和突變型串聯(lián)的目的片段、5 μ L的2XRapid LigationBuffer、I μ L 的 PGEM-T Easy vector 和 I μ L 的 T4DNA Ligase 組成。 (5)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，方法與所述步驟一、(5)相同。(6)篩選與鑒定重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，方法與所述步驟一、(6)相同。(7)提取重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，方法與所述步驟一、(7)相同。取2μ L質(zhì)粒DNA，微型紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度為150ng/μ L，其0D260/0D280比值為I. 80，符合要求，完成標(biāo)準(zhǔn)雜合子質(zhì)粒(A/G型)的構(gòu)建，質(zhì)粒全長 1860bp。
上述步驟所表述的三種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建流程如圖I所示。將獲得的三種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(A/A型，G/G型和A/G型)進(jìn)行普通測序，結(jié)果如圖2所不，從圖中可以看出A為野生型(A/A型)，在CD 18基因的383位喊基為A，測序峰圖中為單峰為突變型(G/G)，CD18基因的383位堿基為G，測序峰圖中為單峰；C為雙基因型雜合子(A/G)，在基因的383位堿基A突變?yōu)镚，測序峰圖中突變位點為套峰。本發(fā)明中所用到的實驗材料如下(I)載體及樣品PGEM-T Easy載體由Promega公司生產(chǎn)，DH5 α購自北京天根生物技術(shù)有限公司，EcoRI限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司。奶牛血液樣品由中國檢科院提供。
(2)試劑及試劑盒
HotstartTaq酶試劑盒寶生物工程(大連)有限公司
Τ4 DNA ligase.: 丨丨(丨 Promega 公"I Plasmid mini kit I.: [丨、:丨 Omega 公 i (J
GeI extraction kit美國 Omega 公司
Marker DL 2000 maker寶生物工程(大連)有限公司
6xloading Buffer寶生物工程(大連)有限公司
dNTP(各IOmM)美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司
dNTP(各2.5mM)寶生物工程(大連)有限公司
X-Gal美國AMRESCO公司
IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)美國AMRESCO公司 M 'i>Ampicillin)sigma
SYBR GREEN I北京普博欣生物科技有限公司(3)主要試劑的配制(I) LB液體培養(yǎng)基胰化蛋白胨(Tryptone)IOg酵母提取物(YeastExtract) 5gNaClIOg以上試劑溶于900mL去離子水，用5mol/L氫氧化鈉調(diào)ρΗ7· 0，定容到IOOOmL,121°C高壓 20min，4°C保存。⑵Amp (100mg/mL):稱取Ig氨節(jié)青霉素,溶于IOmL雙蒸水中，O. 22 μ m濾器過濾，分裝，于-20°C儲存。⑶Amp抗性液體培養(yǎng)基在滅菌的LB液體培養(yǎng)基中加入Amp至終濃度為50 μ g/mL，4°C 保存。⑷Amp抗性固體培養(yǎng)基稱取I. 5g瓊脂粉，溶于IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，121°C高壓20min,冷卻至50°C左右,加入Amp至終濃度為50 μ g/mL,燒制平板,無菌檢驗后4°C|C存?zhèn)溆谩?5) IPTG(20%，m/V，0. 8mol/L):在8mL蒸餾水中溶解2g IPTG，用蒸餾水定容至IOml, O. 22 μ m濾器過濾，分裝成Iml小份于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?6) X-Gal (20mg/mL):稱取 IgX-Gal 置于 50mL 容量瓶中，加入 40mL DMF (二甲基甲酰胺)，充分混勻溶解后定容至50mL，用O. 22 μ m濾器過濾，分裝成ImL每小份，并用鋁箔紙包裹，然后置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?(7)電泳緩沖液(50 X TAE貯存液)稱取Tris 242g，冰乙酸57. ImL,加入IOOmLO. 5mol/L EDTA溶液(pH8. O)，定容至1L，用前以蒸餾水稀釋為IX工作液。(8) SYBR Green I染料(電泳級)工作液取TAE電泳工作緩沖液與SYBRGreen I染料以1:3的比例配置。(4)儀器
2720型PCR儀美國ABI公司
微型紫外分光光度計(ND-1000)美國NanoDrop公司 超級恒溫循環(huán)器(YT-5B)北京亞泰科技開發(fā)中心
電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHG-9082) 上海- 恒科學(xué)儀器有限公司 電熱恒溫鼓風(fēng)千燥箱(DHG-9070A)上海一恒科學(xué)儀器有限公司 恒溫振蕩器(THZ-C)太倉市實驗設(shè)備廠
Iil iVc'f· (AL-104)瑞:I: METTLER TOLEDO 公 ^ d
sigma離心機(2-16P)美國sigma公司
直流電泳儀(DYY-7C)北京六一儀器廠
金屬恒溫儀(CHB-100)杭州博日科技有限公司
紫外凝膠成像系統(tǒng)(DYY-1000B)上海天能科技有限公司 高壓蒸氣滅菌器MLS-3750三洋電機國際貿(mào)易有限公司
渦旋儀Vortex其林貝爾
-8(TC冰箱(700Series)美國 Thermo 公司
超純水儀milli-Q美國Milipore與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過EcoRI酶切產(chǎn)生黏性末端后反向連接BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和野生基因型片段(A/A)，首次構(gòu)建出BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，并且其中突變基因型和野生基因型的比例為1:1，避免了因為突變基因型和野生基因型濃度測量誤差而導(dǎo)致的基因比例的不確定性，嚴(yán)格地實現(xiàn)了野生型和突變型的比例相等，因此能夠精確地模擬雜合子基因組。以本發(fā)明的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒為基礎(chǔ)，能夠建立起方便、高效且特異的BLAD檢測方法，為BLAD檢測試劑盒及疫苗的研發(fā)提供方向，使大規(guī)模BLAD致病基因的篩查成為可能，以此不僅可以掌握BLAD基因攜帶和發(fā)病情況，還可以排除隱性有害基因的攜帶者，避免和降低種公牛傳播擴散有害基因的風(fēng)險，最終為防止和阻斷BLAD致病基因的下傳以及有效預(yù)防和治療BLAD做出貢獻(xiàn)。


圖I是本發(fā)明所述二種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。圖2是本發(fā)明所述三種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的測序結(jié)果圖。下面結(jié)合附圖并通過具體實施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但下述的實例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護范圍，本發(fā)明的權(quán)利范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
具體實施例方式為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實施例如下實施例I :BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，具體的步驟如下(I) PCR擴增BLAD⑶18野生基因型(A/A)片段并回收I)以正常?；蚪MDNA為模板，以上游引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’，下游引物 R :5’ -AGGGGAA GATGGAGTAGCTG-3’ 建立起 50 μ L 的 PCR 反應(yīng)體系，擴增BLAD⑶18野生基因型(Α/Α)目的片段。在O. 2mL的PCR管中加入2 μ L (50ng)的牛基因組 DNA、5y L 的 10XE*Taq buffer、4y L 的 dNTP (各 I. 5mM)、2y L 濃度為 10 μ M 的上游引物F、2 μ L濃度為10 μ M的下游引物R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，40個循環(huán)。2)步驟I)的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker條帶比較，得到大小為1070bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。3)用OMEGA公司的Gel extraction kit對步驟(I)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收,步驟如下①將步驟(I)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳；
②在紫外透照臺上將目的片段快速切下，放入已經(jīng)稱重的兩個I. 5mL離心管中，然后稱重，得出膠塊的重量；③根據(jù)膠重按每毫克加一微升的量加入Binding Buffer,放55_6(TC金屬浴中加熱直至膠完全溶解，期間每隔2-3min振蕩混合，使之充分融化；④吸取200 μ L Buffer GPS平衡緩沖液至裝有Hibind DNA結(jié)合柱的2mL收集管，室溫放置3-5min,室溫下12000xg離心2min,棄掉收集管中濾液,將柱子重新裝回收集管；⑤將溶膠轉(zhuǎn)入結(jié)合柱中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；⑥棄掉濾液，向結(jié)合柱加入300 μ L Binding Buffer, IOOOOxg離心lmin ;⑦棄掉濾液，向結(jié)合柱中加入700 μ L SPff Wash Buffer(含無水乙醇)，IOOOOxg離心 Imin ；⑧棄掉濾液，重復(fù)⑦一次；⑨棄掉濾液，13000xg離心2min,將液體甩干；⑩將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移至一新的I. 5ml離心管中，加入30 μ L ddH20或Elution Buffer于結(jié)合柱中，室溫靜置2min，13000xg離心lmin，棄掉結(jié)合柱，管中為回收的DNA片段，置于-20°C保存。(2) PCR擴增BLAD CD18突變基因型(G/G)片段并回收I)以上述步驟(I)回收的BLAD⑶18基因標(biāo)準(zhǔn)野生型(A/A型)DNA片段為模板，上游引物 CD18Flink :5’ -GCCAAGGGCTACCCCATCGGCCTGTACTACCTGATGGAC-3’ 和下游引物CD18R :5’ -AGGGGAAGATGGAGTAGCTG-3’建立起50 μ L的PCR反應(yīng)體系，擴增突變型短片段。在0. 2mL的PCR管中加入2μ L (50ng)的步驟(I)回收的DNA片段、5 μ L的10XE*Taqbuffer、4y L 的 dNTP (各 2. 5mM)、2y L 濃度為 10 μ M 的上游引物 CD18Flink、2 μ L 濃度為10 μ M的下游引物⑶18R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s、60°C退火 30s、72°C延伸 60s，40 個循環(huán)。2)反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker條帶比較，得到大小為162bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。3)切膠回收步驟I)的PCR產(chǎn)物，方法與所述步驟(I) 3)相同。4)以所述步驟(I)回收的DNA片段為模板，引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’為上游引物，步驟2)獲得的突變型短片段為下游引物，建立起50μ L的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行二次擴增以獲得完整的BLAD⑶18突變基因型(G/G)目的片段。在0. 2mL的PCR管中加入2yL (50ng)的步驟一、(3)回收的DNA片段、5yL的10XE*Taq buffer、4yL的dNTP (各2. 5mM)、2y L濃度為10 μ M的上游引物eC18F、2y L濃度為10 μ M的下游引物突變型短片段、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，30個循環(huán)。5)反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker條帶比較,得到大小為1070bp的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致。6)按照與所述步驟(1)3)相同的方法回收步驟4)的PCR產(chǎn)物。(3)用EcoRI對步驟(I)和步驟(2)的回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切和連接，獲得野生型和突變型串聯(lián)的目的片段。其內(nèi)切酶消化體系為10 μ L，由IyL IOXHotstartTaq Buffer、IuL EcoRIUuL DNA步驟(I)的回收產(chǎn)物、I μ L步驟(2)的回收產(chǎn)物和6 μ L滅菌去離子水組成；反應(yīng)條件為37°C消化lh，90°C變性15min。(4)將步驟(3)獲得的野生型和突變型串聯(lián)的目的片段與T載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為10 μ L，由3 μ L的野生型和突變型串聯(lián)的目的片段、5 μ L的2XRapid LigationBuffer、I μ L 的 PGEM-T Easy vector 和 I μ L 的 T4DNA Ligase 組成。(5)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，具體的步驟如下①將感受態(tài)細(xì)胞從_80°C冰箱中取出之后置于冰上融化；②取10 μ L連接產(chǎn)物加入融化后的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；③冰浴30min;④42°C水浴熱激90s，再在冰上冷激3min ；
·
⑤加入400 μ L無抗性的經(jīng)37 °C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37 °C 150rpm震蕩培養(yǎng)·90min ；⑥3000rmp離心2min，棄掉部分上清，留下約100 μ L液體，然后重懸，加入7 μ LIPTG和40 μ L X-gal，用涂布棒涂布于有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16小時，然后進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定。(6)篩選與鑒定重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，具體的步驟如下①挑取白斑于6mL含有氨節(jié)青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基,37°C 200rmp振蕩培養(yǎng)12-16個小時；②以培養(yǎng)好的菌液為模板分別進(jìn)行PCR鑒定；③將PCR測定為陽性的菌液進(jìn)行保菌，取500 μ L菌液加500 μ L滅菌甘油于I. 5mL尚心管中，混勾并標(biāo)記后放入_80 C冰箱中保存待用；④將PCR鑒定陽性的菌液進(jìn)行測序，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。(7)用OMEGA公司的Plasmid mini kit I從菌液中提取重組的BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，具體的步驟如下①取保存菌液200 μ L于3mL有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C 200rmp振蕩培養(yǎng)12-16個小時；②取2mL菌液于I. 5mL離心管中，室溫下IOOOOxg離心Imin ；③棄掉上層培養(yǎng)液，向細(xì)菌沉淀中加入250 μ L Solution I (含RNase A)，進(jìn)行徹底地渦旋混勻；④加入250 μ L Solution II,上下顛倒4-6次,輕輕混勻，室溫下溫育2min ；⑤加350yL Solution III，輕輕混勻至出現(xiàn)白色絮狀物，然后室溫下13000xg離心 IOmin ；⑥小心轉(zhuǎn)移上清液到一個2mL的裝有DNA結(jié)合柱的收集管中(DNA結(jié)合柱的平衡方法同切膠回收),注意不要吸進(jìn)沉淀,室溫下IOOOOxg離心Imin ；⑦棄濾液，加500yL Buffer HB, IOOOOxg 離心 lmin,除去蛋白；⑧棄濾液，加700μ DNA Wash Buffer (含無水乙醇)，IOOOOxg 離心 lmin ;⑨棄濾液，重復(fù)⑧一次；⑩棄濾液，13000xg離心2min,將液體甩干；將結(jié)合柱轉(zhuǎn)移至一新的I. 5mL離心管中，加入30 μ L ddH20或Elution Buffer于結(jié)合柱中，室溫靜置2min, 13000xg離心lmin,棄掉結(jié)合柱，管中為提取的BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒DNA,置于-20°C保存；取2 μ L質(zhì)粒DNA，微型紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度為150ng/ μ L，其0D260/0D280比值為I. 80，符合要求，完成標(biāo)準(zhǔn)雜合子質(zhì)粒(A/G型)的構(gòu)建，質(zhì)粒全長1860bp。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的原料配比及制備步驟，但本發(fā)明并不局限于上述配比及制備步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述制備步驟才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，其特征在于，其是通過EcoRI酶切產(chǎn)生黏性末端后反向連接BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和野生基因型片段(A/A)的連接產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的BLADCD 18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，其特征在于，所述BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段和BLAD⑶18野生基因型(A/A)片段的比例為1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)PCR擴增BLAD⑶18野生基因型(A/A)片段并回收； (2)PCR擴增BLAD⑶18突變基因型(G/G)片段并回收； (3)用EcoRI對步驟(I)和步驟(2)的回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切和連接，獲得野生型和突變型串聯(lián)的目的片段； (4)將步驟(3)獲得的野生型和突變型串聯(lián)的目的片段與T載體進(jìn)行連接； (5)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物； (6)篩選與鑒定重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒； (7)提取重組的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒，獲得全長為1860bp的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中擴增上游引物序列F為5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTITT-3’，擴增下游引物序列 R 為 5’ -AGGGGAAGATGGAGTAGCTG-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中PCR反應(yīng)體系為50μ L，由2μ L (50ng)的牛基因組DNA、5y L 的 10XE*Taq buffer、4 μ L 的 dNTP (各 2. 5mM)、2 μ L 濃度為 10 μ M 的上游引物F、2 μ L濃度為10 μ M的下游引物R、0. 5 μ L Taq E和35 μ L的滅菌去離子水組成；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s ；40個循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5之一所述的BLAD⑶18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)先以步驟(I)的回收產(chǎn)物為模板，采用 CD18F :5’-GCCAAGGGCTACCCCATCGGCCTGTACTACCTGATGGAC-3’ 和 CD18R :5’ -AGGGGAAGATGGAGTAGCTG-3’引物進(jìn)行擴增，得突變型短片段；再以步驟(I)的回收產(chǎn)物為模板，以引物F :5’ -ATTGATATCTGGTGCCTAGTCTCGCTTTT-3’作為上游引物、突變型短片段作為下游引物，進(jìn)行二次擴增獲得完整的BLAD⑶18突變基因型(G/G)的DNA片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6之一所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)先以步驟(I)的回收產(chǎn)物為模板，采用CD18F和⑶18R引物進(jìn)行擴增，獲得突變型短片段，其PCR反應(yīng)體系為50yL，由2yL (50ng)的步驟(I)回收的 DNA 片段、5μ L 的 10XE*Taq buffer、4 μ L 的 dNTP (各 2. 5mM)、2 μ L 濃度為10 μ M的上游引物CD18Flink、2 μ L濃度為10 μ M的下游引物CD18R、0. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水組成，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，40個循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7之一所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)再以步驟(I)的回收產(chǎn)物為模板，以eCD18F作為上游引物、突變型短片段作為下游引物，進(jìn)行二次擴增獲得完整的BLAD CD18突變基因型(G/G)的DNA片段，其PCR反應(yīng)體系為50 μ L，由2 μ L (50ng)的步驟(I)回收的DNA片段、5yL 的 10XE*Taq buff er、4 μ L 的 dNTP(各 2. 5mM)、2yL 濃度為 10 μ M 的上游引物 eC18F、2μ L濃度為10 μ M的下游引物突變型短片段、O. 5 μ L的Taq E和35 μ L的滅菌去離子水組成，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸60s，30個循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8任一項所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)的EcoRI內(nèi)切酶消化體系為10yL，由IyLIOXHotstart Taq BufferU μ L EcoRI、I μ L 步驟(I)的回收產(chǎn)物、I μ L 步驟(2)的回收產(chǎn)物和6μ L滅菌去離子水組成；反應(yīng)條件為37°C消化lh，90°C變性15min。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9任一項所述的BLADCD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)的連接，連接反應(yīng)體系為10μ L，由3μ L的野生型和突變型串聯(lián)的目的片段、5μ L的2XRapidLigation Buffer、I μ L的PGEM-T Easyvector 和 I μ L 的 T4 DNA Ligase 組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及BLAD CD18野生型和突變型雙基因型(A/G型)雜合子質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，其是通過EcoRI酶切產(chǎn)生黏性末端后反向連接BLAD CD18突變基因型(G/G)片段和野生基因型片段(A/A)的連接產(chǎn)物，所述BLAD CD18突變基因型(G/G)片段和BLAD CD18野生基因型(A/A)片段的比例為1:1。構(gòu)建方法主要是根據(jù)GenBank中BLAD CD18序列設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴增后純化產(chǎn)物。本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，為建立起方便、高效且特異的檢測BLAD的方法以及為測定奶牛群中BLAD發(fā)生頻率和BLAD檢測試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，使大規(guī)模BLAD致病基因的篩查成為可能，以此不僅可以掌握BLAD基因攜帶和發(fā)病情況，還可以排除隱性有害基因的攜帶者，避免和降低種公牛傳播擴散有害基因的風(fēng)險，最終為有效預(yù)防和治療BLAD做出貢獻(xiàn)。
文檔編號C12N15/66GK102888421SQ20121017909
公開日2013年1月23日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者賈廣樂, 周莉, 廖娟紅, 林祥梅 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院