專利名稱：檢測肝豆?fàn)詈俗冃詀tp7b基因突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種檢測肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson’ s病(WD)，是遺傳性銅代謝紊亂的常染色體隱性遺傳性疾病，主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟。WD基因已被克隆且定位于13ql4. 3-21. 1，有21個外顯子和20個內(nèi)含子，cDNA全長4398bp，其表達產(chǎn)物ATP7B蛋白為含1465個氨基酸的多肽，故本病基因又稱為ATP7B基因。ATP7B基因突變形式較多，據(jù)(http://www.hgmd. org/)截止2009年12月已發(fā)現(xiàn)400種不同的突變，主要突變形式為錯義突變，無義突變，缺失和插入等。ATP7B基因突變十分復(fù)雜，但以少數(shù)幾個熱點突變?yōu)橹?，伴有廣泛存在的罕見突變 為特征，具有明顯的種族和區(qū)域差異性，并且WD患者大多為復(fù)合雜合子突變，少數(shù)為純合突變該病在世界各地廣泛存在，流行病學(xué)調(diào)查顯示地中海人群中每5000人中就有I人患病，每90人中就有I人是致病基因的攜帶者。多數(shù)研究已證實Hisl069Gln為歐洲人的一個典型突變熱點，而亞洲人的突變熱點為Arg778Leu，中國人群中Arg778Leu發(fā)病率為70%，因此基因檢測位點的選擇要有種族特異性和針對性，避免無的放失。與患者擁有相同基因型的家族成員，盡管沒有臨床癥狀也應(yīng)該盡早治療，而臨床癥狀或生化檢查都模棱兩可的家族成員，有可能是雜合子攜帯者需加以關(guān)注?；蜩b定的方法不僅顯著提高了不典型病例的診斷率，使肝豆?fàn)詈俗冃园l(fā)病年齡的確認(rèn)被分別提前至3歲和延后至70歲，同時利用基因鑒定進行產(chǎn)前診斷也成為有效降低發(fā)病率的重要手段。對患者的同胞進行基因檢測將有可能將診斷提前至無癥狀的臨床前期，并同時避免不必要的驅(qū)銅治療。因而尋找更經(jīng)濟、快捷的基因鑒定法使該項檢查能夠在所有高危人群中得到應(yīng)用?！癏RM”(High_Resolution Melt analysis)高分辨率溶解曲線。2002 年，美國 Utah大學(xué)和Idaho科技公司共同合作開發(fā)了 HRM技術(shù)，是近年來新興的ー種核酸序列分析技木，具有極高的特異性和靈敏度。HRM與SYBRGreen染料溶解曲線功能相似，只是收集信號更多。HRM的主要原理是根據(jù)DNA序列的長度，GC含量以及堿基互補性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度達到對單個堿基差異的區(qū)分。HRM方法優(yōu)點是檢測遺傳變異是高度特異且精確，低成本(無需序列特異性探針)，操作簡便，快速，高通量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在干，提供一種檢測肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因突變的試劑盒，可用于檢測ATP7B基因突變位點，特異性好，靈敏度高。檢測肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因突變的試劑盒，其特征在于，包括(i) PCR擴增反應(yīng)試劑；(ii)用于擴增樣本DNA中ATP7B基因的PCR引物
exon 8: Forward: 5 ’ AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3’Reverse:5，AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3’exon 12:Forward:5’ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’ Reverse: 5，AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3，。進一步地，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟⑴采集待測血液樣本，提取DNA ； (ii)以該DNA為模板，用所述用于擴增樣本DNA中ATP7B基因的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物，進行HRM實驗；(iii ) HRM分析確定是否存在第778個堿基G — T突變位點或第952個堿基G — A
突變位點。步驟(ii)的PCR反應(yīng)按以下條件進行擴增94°C 2min ;98°C 10s,57 °C 30s,68°C 25s, 20 個循環(huán)；最后 68°C 5min。由于中國人的WD突變主要在ATP7B基因外顯子8，12上，所以從外顯子8，12上設(shè)計引物為exon 8:Forward:5’ AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3’ 296bpReverse:5，AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3，主要檢測Arg778Leu 錯義突變(CGG — CTG)；exon 12:Forward:5’ ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’ 229bpReverse:5，AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3’主要檢測Arg952Lys 錯義突變(AGA — AAA)。檢測的具體步驟如下I、全血DNA提取向樣品中抽取300uL血液加入900uL紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。IOOOOrpm離心I分鐘(若離心機最高轉(zhuǎn)速不允許,可3000rpm離心5min)，吸去上清，留下白細(xì)胞。之后按照TIANGEN生化有限公司的血液基因組提取試劑盒(貨號DP318-02)說明書進行DNA抽提。2高分辨率熔解曲線法檢測W)基因突變高分辨率熔解曲線分析所需野生型標(biāo)準(zhǔn)品的制備以Genebank中發(fā)布ATP7B的Exon 8及Exon 12序列為標(biāo)準(zhǔn)，委托上海英濰捷基公司合成上述兩個外顯子的野生型質(zhì)粒，并以此作為高分辨率熔解曲線分析中的標(biāo)準(zhǔn)品。高分辨率熔解曲線分析HRM分析用引物見表I。PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系共20ul，成分為 2*K0D PCR Buffer IOul, dNTP (200uM) 4ul，正向引物(10umol/L) lul，反向引物(10umol/L)lul,模板 lul,KOD FX (lU/ul)lul, 10*LC Green 2ul,RNase-freewaterl. 6ul。野生型標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的模板均稀釋成同一濃度5ng/ul。檢測的儀器為Illumina公司的ECO熒光定量儀，HRM分析與PCR反應(yīng)同步進行。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2min，98°C 10s，57°C 30s, 68°C 25s，共 40 個循環(huán)，最后 68°C延伸 5min。HRM 分析，從 55°C開始以
0.I0C /s的斜率采集熔解曲線，到55°C結(jié)束，用Eco Real-Time PCR System軟件對采集后的曲線進行分析。每次HRM分析實驗均需同時測試野生型標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品。表IHRM分析弓丨物序列檢測外顯子引物序列擴增產(chǎn)物長度
Exon 8 Forward 5，-AAA(XCTTCACGTTCCTTGTCA-3’ 296 bpReverse 55-AAGGCAGCTCTTTTCTGAAA-3,
Exon 12 Forward 5'-ACTTGTGGTGTTTTATTTCTTCA-3' 229bp Reverse 5’-AACCACC.ATATAGCCCAAGA-3，采用HRM技術(shù)，對ATP7B基因突變進行檢測。通過特異性的引物和飽和熒光LC-GREEN，檢測出與Wilson’s病相關(guān)的突變基因位點。可以用于臨床作為Wilson’s病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的輔助性指標(biāo)以及Wilson’ s病人的早期篩選方法，也可以通過基因檢測技術(shù)提前干預(yù)，父母在孕前就可了解到子女出現(xiàn)遺傳性肝豆?fàn)詈俗冃缘膸茁剩⒃谠兄袑μ哼M行檢測，看其是否存在遺傳性肝豆?fàn)詈俗冃浴Ｕ嬲龅健霸绨l(fā)現(xiàn)”、“早預(yù)防”、“早干預(yù)”。


圖I是ATP7Bexon8 Arg778Leu突變型與正?；虻娜芙馇€圖。圖2是ATP7Bexonl2 Arg925Lys突變型與正?；虻娜芙馇€圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。實施例I檢測遺傳性肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B exon8和exonl2突變試劑盒，包括(i)HRM PCR擴增反應(yīng)試劑；包括dNTP、10*PCR緩沖液、Mg2+、雙蒸水、Tag酶等。(ii)用于擴增樣本DNA中ATP7B基因的PCR引物exon 8: Forward: 5，AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3，Reverse:5，AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3，；exon 12:Forward:5’ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’Reverse: 5 ’ AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3 ’。所述試劑盒的使用方法包括如下步驟(i)采集待測血液樣本，提取DNA ；(ii)以該DNA為模板，用所述用于擴增樣本DNA中ATP7B基因的HRM PCR引物進行PCR擴增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；進行HRM實驗。通過幾百例臨床受檢樣本用所設(shè)計的ATP7B引物對ATP7B exon8和exonl2基因進行擴増，發(fā)現(xiàn)該引物具有較高的擴增穩(wěn)定性、特異性。實施例2I)樣本抽提I. I抽取300uL血液加入900uL紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。IOOOOrpm離心I分鐘(若離心機最高轉(zhuǎn)速不允許,可3000rpm離心5min),吸去上清，留下白細(xì)胞沉淀，加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。I. 2加入20 ill蛋白酶K溶液，混勻。I. 3加入200 U I緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡短
離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。I. 4加人200 ill無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。I. 5將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13，400 X g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。I. 6向吸附柱CB3中加入500 ill緩沖液⑶(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。I. 7向吸附柱CB3中加入700 ill漂洗液PW (使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。I. 8 向吸附柱 CB3 中加入 500 ill 漂洗液 PW，12，000rpm (13，400 Xg)離心 30 秒，倒掉廢液。I. 9將吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。I. 10將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 u I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(13，400 X g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。2)實驗過程2. I按樣品數(shù)n (樣品數(shù)=待測樣本數(shù)+陰性對照I個+陽性對照I個)取預(yù)混PCR反應(yīng)液每管20ul分裝于反應(yīng)管中。2. 2將上述處理好的待測樣本和陰性、陽性對照各取2ul分別加入反應(yīng)管中，混勻，低速離心數(shù)秒，進行PCR擴增，具體反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.檢測肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因突變的試劑盒，其特征在于，包括 (i)PCR擴增反應(yīng)試劑； (ii)用于擴增樣本DNA中ATP7B基因的PCR引物 exon 8 Forward: 5’ AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3’Reverse: 5’ AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3’exon 12 Forward: 5’ ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’Reverse: 5’ AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3’。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟 (i)采集待測血液樣本，提取DNA ； (ii)以該DNA為模板，用所述用于擴增樣本DNA中ATP7B基因的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物，進行HRM實驗； (iii ) HRM分析確定是否存在第778個堿基G — T突變位點或第952個堿基G — A突變位點。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟(ii)的PCR反應(yīng)按以下條件進行擴增94°C 2min ；98°C 10s、57°C 30s,68°C 25s, 20 個循環(huán)；最后 68°C 5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因突變的試劑盒，其特征在于，包括(i) PCR擴增反應(yīng)試劑；(ii)用于擴增樣本DNA中ATP7B基因的PCR引物exon8 Forward:5’AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA3’，Reverse:5’AAGGCAGCTCTTTTCTGAAA3’；exon12 Forward:5’ACTTGTGGTGTTTTATTTCTTCA3’， Reverse:5’AACCACCATATAGCCCAAGA3’?？捎糜跈z測ATP7B基因突變位點，特異性好，靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK102719536SQ20121017942
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者孫翠蓮, 徐建成, 方國偉, 王淑一, 陳亦磊 申請人:杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司