專利名稱：一個(gè)高喹啉降解基因及其應(yīng)用的制作方法
一個(gè)高喹啉降解基因及其應(yīng)用
背景技術(shù)：
喹啉是含氮雜環(huán)化合物的典型代表，用途極其廣泛，是多種醫(yī)藥、農(nóng)產(chǎn)品、染料等生產(chǎn)中的重要原料和溶劑。但是喹啉及其衍生物可致癌、致畸、致突變，且難于生物降解，是環(huán)境中的嚴(yán)重污染物。環(huán)境中的喹啉主要來自煤氣、化石燃料加工、煤焦油殘余物和木材保存設(shè)施。此外，喹啉及其衍生物還是焦化廢水、石油廢水、制藥廢水等多種工業(yè)廢水中的難降解有機(jī)污染物成分。有學(xué)者分別對(duì)2種焦化廢水的有機(jī)物組成進(jìn)行了分析，指出喹啉類化合物的含量居有機(jī)污染物的第二。由于喹啉含有1個(gè)電負(fù)性很強(qiáng)的氮原子使得其水溶性增強(qiáng)，因此這類化合物更易在環(huán)境中擴(kuò)散和持久存在。已有調(diào)查發(fā)現(xiàn)在木餾油污染場(chǎng)所附近的地下水和土壤中喹啉及其羥基喹啉的濃度高達(dá)數(shù)個(gè)mg/L。除此之外，喹啉及其衍生物還存在于城市空氣、煙草煙霧、海水和魚的組織中，因此尋找有效去除喹啉的方法具有十分重要的意義。污染物的去除方法很多，大致分為物理法、化學(xué)法和生物法。物理法和化學(xué)法雖然去除效率高，但是成本高，容易產(chǎn)生二次污染。生物治理具有成本低、二次污染輕、環(huán)境相容性好等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為污染治理技術(shù)中的首選方案之一。決定生化處理工藝成功、有效、適用的因素，除了工藝條件和操作管理外，用于污染物降解、轉(zhuǎn)化等過程的功能基因的重要作用也是顯而易見的。喹啉降解途徑主要分為有氧代謝和厭氧代謝，其降解途徑多種多樣，但是對(duì)于喹啉降解特性及降解途的研究還停留在理論階段。由于喹啉本身屬于難降解有機(jī)雜環(huán)化合物，自然界中很難找到對(duì)其可以有效降解的微生物，因此，克隆能夠穩(wěn)定有效降解喹啉的基因是工作量更為巨大且困難的事情。目前對(duì)喹啉降解基因知之甚少，無法提供序列上的參考和方法上的借鑒，無法預(yù)測(cè)喹啉降解基因，只能通過工作量驚人的篩選和驗(yàn)證，實(shí)際很難完成。本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的大量而艱苦實(shí)驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，意外地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有高喹啉降解能力的新基因，該高喹啉降解能力還可以用于多種微生物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)喹啉具有高降解性的新基因，該基因編碼下述(a)或 (b)所代表的蛋白質(zhì)
(a)、由SEQID No :2代表的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，
(b)、與SEQID No :2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列組成且賦予高喹啉降解活性的蛋白質(zhì)。編碼上述(a)所述的蛋白質(zhì)的基因是編碼由SEQ ID No :2代表的氨基酸序列組成的賦予高喹啉降解活性的蛋白質(zhì)的基因(命名為purDl)。purDl是從惡臭假單胞菌 (.Pseudomonas ^wiiVa) KT-ql-116中克隆得到的。KT-ql-116為本發(fā)明人從北京市肖家河污水處理廠活性污泥中經(jīng)初篩和復(fù)篩等大量的實(shí)驗(yàn)得到的對(duì)喹啉具有高降解活性的惡臭假單胞菌，該菌株已于2008年12月9號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通衛(wèi)生中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 2790。目前報(bào)道的喹啉降解最大濃度為500mg/L，本發(fā)明的purDl及其編碼蛋白賦予微生物的降解活性不僅能夠降解500mg/L的喹啉，最大降解濃度能夠達(dá)到850 mg/L。本發(fā)明對(duì)喹啉類污染物的治理具有非常重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明使用的“高喹啉降解”術(shù)語(yǔ)是指對(duì)喹啉的降解濃度高于500mg/L，優(yōu)選降解濃度為500mg/L 850 mg/L，更優(yōu)選濃度為700 mg/L 850 mg/L。編碼上述(b)所述的蛋白質(zhì)的基因是編碼這些蛋白質(zhì)的基因，這些蛋白質(zhì)與SEQ ID No 2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸(比如1-5或 1-12個(gè))的氨基酸序列組成，且賦予高喹啉降解活性。在知曉具體序列的前提下，通過常規(guī)技術(shù)，如PCR方法、重組法或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易獲得編碼本發(fā)明(a)或(b)氨基酸序列的核苷酸序列。另外，可通過如定點(diǎn)誘變技術(shù)等合成與突變體具有相同功能的本發(fā)明的突變體基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種獲得具高喹啉降解活性的微生物的方法將本發(fā)明的基因或含有本發(fā)明基因的重組體導(dǎo)入微生物，使其具有高喹啉降解活性。本發(fā)明所述的重組體是指包含根據(jù)本發(fā)明基因的重組載體。通過將根據(jù)本發(fā)明的基因?qū)牒线m的載體獲得根據(jù)本發(fā)明的重組載體。上述重組載體還包含外源基因或外源 DNA片段。用于插入根據(jù)本發(fā)明基因的載體不受任何的限制，只要該載體可以在宿主中復(fù)制，優(yōu)選為本領(lǐng)域常用的克隆載體和表達(dá)載體。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1是pBBRlMCS-purDl轉(zhuǎn)化突變體D得到高喹啉降解菌株。KT_ql_116是正對(duì)照，廣8為Dp廣8，E為突變體E，作為負(fù)對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，培養(yǎng)基中的溶劑均為水，具 nT#jAL ((Molecular Cloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell,
David W. ,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。MM2 降解培養(yǎng)基=Na2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1 g/L，微量元素液 5. 0ml/L ；其中每 1000ml 微量元素液包括 CaCl2 · 2H20 0. 0004g, FeSO4 · 7H20 0. 04g, MnSO4 · 4H20 0. 04g, ZnSO4 · 7H20 0. 02g, CuSO4 · 5H20 0. 005g, CoCl2 · 6H20 0. 004g, NaCl 1. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 005g。滅菌冷卻后添加喹啉終濃度為300mg/L。1/10LB固體培養(yǎng)基酵母粉0.5g/L，蛋白胨1 g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉15g/L ；滅菌后冷卻至60°C后添加喹啉終濃度為200mg/L。LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。如需要，在以上培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的抗生素。卡那霉素終濃度5(^g/ml，慶大霉素終濃度30μβ/πι1。實(shí)施例1、高喹啉降解基因purDl的獲得
一、降解菌/^ewi/offloaas putida KT-ql-116 Tn5突變體文庫(kù)的建立 本發(fā)明人從北京市肖家河污水處理廠活性污泥中經(jīng)初篩和復(fù)篩等大量的實(shí)驗(yàn)得到的對(duì)喹啉具有高降解活性的惡臭假單胞菌KT-ql-116，應(yīng)用Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合體技術(shù)建立細(xì)菌轉(zhuǎn)座突變體文庫(kù)的方法克隆高喹啉降解基因purDl。Tn5 Transposome是購(gòu)自Epicentre公司的 EZ: :TN<Kan_2>Tnp Transposome Kit。1.降解菌Aei/i/offloaas putida KT-ql-116電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
挑取KT-ql-116單菌落接種到20mlLB中，過夜培養(yǎng)。接種5ml培養(yǎng)液接種到250mlL中， 210rpm，30。C搖菌。菌液OD6tltl=L 1左右時(shí)停止搖菌，冰上放置lh。4。C，3000rpm離心lOmin， 去廢液后用200ml冰冷的ddH20漂洗2遍，同樣條件離心后去廢液，用300mM蔗糖30ml漂洗 2遍，離心后用300mM蔗糖和10%甘油混合液漂洗1遍，離心后用lml300mM蔗糖和10%甘油混合液懸浮，分裝40μ1/管，液氮快速冷凍后，放置在_80°C冰箱中。2.電轉(zhuǎn)化獲得突變體
采用MicroPuiser 生產(chǎn)電轉(zhuǎn)化儀，40μ1感受態(tài)中加入 μ Tnp Transposome,電壓 2. 5kV,時(shí)間 4. 4ms，加入 ImlLB 培養(yǎng)基，30°C, 200rpm 復(fù)蘇 2h。3.突變體的獲得
將復(fù)蘇完的菌涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。將單菌落劃線到1/10LB固體培養(yǎng)基篩選突變體。30°C培養(yǎng)15小時(shí)，觀察突變體周圍培養(yǎng)基顏色變化情況。根據(jù)顏色變化篩選Ae^/o^was putida KT-ql-116喹啉降解功能喪失的突變體。 1/10LB固體培養(yǎng)基為淺白色，若突變體降解喹啉會(huì)使培養(yǎng)基變成褐色，沒有顏色變化者為喹啉降解功能缺失的突變體。挑取不能使培養(yǎng)基變色的菌，此菌即為^ewiZ0ffl0Z7aiS putida KT-ql-116喹啉降解菌的功能喪失突變體。共獲得8株突變體，分別命名為A、B、C、D、E、F、 H、I。二、利用反向PCR獲得Tn5插入序列的側(cè)翼序列根據(jù)Τη5提供的序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)PCR引物，引物序列如下 Tn5 upl 5' -CGCAGA CGCAGACCGATACCAGGATCTTG-3‘， Tn5 downl 5' -GTAACCATGCATCATCAGGAGTACG-3‘；
Tn5 up 5' -GGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACG-3‘，
Tn5 down 5 ‘ -CATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACG-3‘
利用Tn5 upl和Tn5 downl、Tn5 up和Tn5 down擴(kuò)增其側(cè)翼序列。側(cè)翼
序列連接T載體后測(cè)序。根據(jù)側(cè)翼序列進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物a-Fl和a-Rl，序列如下
a-Fl 5' -TATACCACCGTCTATGAAACCG-3‘
a-Rl 5' -GATGAATCCGTAGATCACCAGA-3‘
用PCR擴(kuò)增的高喹啉降解候選基因。獲得的候選基因命名為purDl，由1083個(gè)核苷酸組成，如SEQ ID No 1所示；purDl編碼的蛋白質(zhì)由360個(gè)氨基酸組成，如SEQ ID No 2所
5不。實(shí)施例2、pBBRlMCS-purDl使突變菌株D具高喹啉降解活性一、pBBRlMCS-purDl 載體的構(gòu)建
把克隆得到的PurDl連接到T-easy Blunt載體上，經(jīng)測(cè)序無誤后，用HindIII和XbaI 雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收PurDl片段后待用。用HindIII和)(baI雙酶切廣宿主質(zhì)粒pBBRlMCS-5，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收pBBRlMCS_5載體片段。取8μ1 purDl片段和 μ 處理好的pBBRlMCS-5，加入連接酶0. 5Pl，buffer μ ，16°C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到五cWi，菌落PCR檢測(cè)單克隆，選取檢測(cè)正確的克隆測(cè)序，選取測(cè)序正確的克隆，得到 pBBRlMCS-purDl。二、pBBRlMCS-purDl 轉(zhuǎn)化突變菌株 D
突變菌株D是上述實(shí)施例1獲得一個(gè)喹啉降解功能喪失的惡臭假單胞菌突變體， 我們用pBBRlMCS-purDl轉(zhuǎn)化突變菌株D來驗(yàn)證候選基因purDl是否能使轉(zhuǎn)基因微生物具有高喹啉抗性。同時(shí)，這也是一個(gè)功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，使得實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)更具有邏輯性和嚴(yán)謹(jǐn)性。用KT-ql-116電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備方法制備突變菌株D的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。采用 MicroPuiser 電轉(zhuǎn)化儀，在40μ1突變菌株D的感受態(tài)中加入 μ pBBRlMCS-purDl質(zhì)粒， 電壓2. 5kV，電擊4. %is，然后加入ImlLB液體培養(yǎng)基，30°C, 200rpm條件復(fù)蘇池。將復(fù)蘇完的菌液涂布含慶大霉素和卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基，30°C溫箱培養(yǎng)2天，獲得單克隆。三、pBBRlMCS-purDl轉(zhuǎn)化菌株具有高喹啉降解活性
將所有的單克隆劃線培養(yǎng)后，接種的MM2培養(yǎng)基中，檢測(cè)pBBRlMCS-purDl的轉(zhuǎn)化菌株是否具有高喹啉降解活性。我們一共檢測(cè)了觀80個(gè)單克隆，獲得了 8株具有高喹啉降解活性的單克隆，分別命名為Dpl、Dp2、Dp3、Dp4、Dp5、Dp6、Dp7和Dp8。MM2液體培養(yǎng)基為淺白色，若菌株能夠降解喹啉，培養(yǎng)基變成褐色；培養(yǎng)基顏色沒有變化的為不具喹啉降解活性的菌株。Dpi、在MM2培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時(shí)候顏色變化見圖1，與突變菌株D相比，Dpl、Dp2、 Dp3、Dp4、Dp5、Dp6、Dp7和Dp8菌株的顏色都變深，同KT-ql-116的顏色相似，這表明我們確實(shí)獲得了具有高喹啉降解活性的菌株。實(shí)施例3、Dp2對(duì)喹啉的生物降解實(shí)驗(yàn)
我們進(jìn)一步研究了 Dp2的喹啉的生物學(xué)降解實(shí)驗(yàn)。將Dp2菌株接種于含有不同濃度喹啉的MM2液體培養(yǎng)基中，喹啉濃度分別為500 mg/L、650 mg/L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/ L、850 mg/L,900mg/L, 25°C，200rpm,振蕩培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除900mg/L的情況下，菌體沒有生長(zhǎng)以外，其它待試培養(yǎng)基中都不同程度的增殖。菌體在喹啉濃度分別為500 mg/L、650 mg/ L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/L 禾口 850 mg/L 的情況下生長(zhǎng) 40. 5h、64h、124h、142h、153h 和16 時(shí)，菌液0D600都可達(dá)到0. 7^0. 8，而這些培養(yǎng)基中的喹啉被降解完全。以上結(jié)果表明，Dp2菌體可以以喹啉為唯一碳源、氮源和能源生長(zhǎng)，而且可以很好的耐受和降解濃度高達(dá)850mg/L的喹啉，并且在此濃度下發(fā)生很好的增殖，生物量較高活細(xì)胞數(shù)可達(dá)106 107cfu/mlo該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明purD基因轉(zhuǎn)化微生物能使其具有高喹啉降解活性，這對(duì)污染物的降解具重要的意義。
權(quán)利要求
1.編碼下述(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因(a)、由SEQID No :2代表的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，以及(b)、與SEQID No :2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列組成且賦予喹啉降解活性的蛋白質(zhì)。
2.賦予喹啉降解活性的蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1所述的基因編碼。
3.重轉(zhuǎn)載體，其包含權(quán)利要求1所述的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其中重組載體還包含外源基因或外源DNA片段。
5.經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞，其具有如權(quán)利要求3或4所述的重組載體并具有高喹啉降解活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)對(duì)喹啉具有高降解性的新基因purD1。實(shí)驗(yàn)證明，將purD1基因轉(zhuǎn)化微生物能使該微生物獲得對(duì)喹啉的降解活性。purD1及其編碼蛋白賦予微生物的降解活性最大降解濃度能夠達(dá)到850mg/L。本發(fā)明對(duì)喹啉類污染物的治理具有非常重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102206653SQ20111010384
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者喬琳, 夏勉, 徐海英 申請(qǐng)人:北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司