本發(fā)明涉及N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val,涉及它的制備方法，涉及它的抗血栓活性，涉及它的溶血栓活性，涉及它治療腦缺血大鼠的作用，因而本發(fā)明涉及它在制備抗血栓藥物,溶血栓藥物和治療缺血性中風藥物中的應用。

背景技術：

缺血性中風是一類較常見且危害嚴重的腦血管疾病，特點是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風面臨沒有有效藥物的現(xiàn)實，尤其中風面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對中風面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經公開式II的咪唑啉化合物在中風面24h的大鼠缺血性中風模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa₁和aa₂可為同時存在,aa₁存在但aa₂不存在,或同時不存在；當aa₁和aa₂同時存在時,aa₁為R(Arg),且aa₂為G(Gly),A(Ala)或Q(Gln)；當aa₁存在但aa₂不存在時,aa₁為R(Arg)；aa₃可為S(Ser),V(Val)或F(Phe)。由于式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys。而該Lys的側鏈氨基和主鏈羧基分別與RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相連接,所以結構比較復雜需要簡化。

發(fā)明人經過3年實驗研究，發(fā)現(xiàn)用3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲?；嫔鲜街械?-取代苯基咪唑啉基,用Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val十肽基代替上式中的肽基可以獲得療效好的意想不到的技術效果。按照這個發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術實現(xiàn)要素：

1.本發(fā)明的內容之一是提供下式的N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val

2.本發(fā)明的內容之二是提供N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的制備方法,該方法由以下方法構成:

(1)按照標準方法制備Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBz；

(2)按照標準方法制備Gly-Arg(NO₂)-Pro-Als-Lys(Z)-OBz；

(3)制備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-羧酸；

(4)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)-OBzl；

(5)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)；

(6)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(7)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(8)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys[Gly-Arg(NO₂)-Pro-Als-Lys(Z)-OBz]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(9)制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Als-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val。

3.本發(fā)明的內容之三是評價N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的抗血栓活性。

4.本發(fā)明的內容之四是評價N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的溶血栓活性。

5.本發(fā)明的內容之五是評價N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val在腦缺血24h后治療腦缺血的活性。

附圖說明

圖1是N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的合成路線.i)丙酮,三氟乙酸,MgSO₄；ii)DCC,HOBt,NMM；iii)乙醇,Pd/C；iv)氯化氫-乙酸乙酯溶液(4M),冰??；v)三氟甲磺酸,三氟乙酸。

具體實施方式

為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制。

實施例1液相接肽反應通法

將N端保護的原料以無水DMF溶解，向得到的溶液中加入N-羥基苯并三氮唑(HOBt)。冰浴下緩慢加入用無水DMF溶解的N,N-二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，0℃攪拌15分鐘得到反應液(I)。羧端保護的原料也用無水DMF溶解，用N-甲基嗎啉(NMM)調pH至9，然后與反應液(I)混合，用N-甲基嗎啉維持pH 9，室溫攪拌10小時，TLC監(jiān)測原料點消失后，反應混合物過濾，濾液減壓濃縮，得到粘稠狀物質用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用5％NaHCO₃水溶液洗，5％KHSO₄水溶液洗，飽和NaCl水溶液洗，乙酸乙酯相加無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干,殘留物經柱層析純化(二氯甲烷/甲醇,50/1)，得到目標化合物。

實施例2脫Boc通法

將Boc保護的肽用少量的無水乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入氯化氫的乙酸乙酯溶液(4M)。TLC顯示原料點消失后，反應溶液用水泵反復抽干，除凈氯化氫氣體，殘留物用石油醚或無水乙醚反復研磨，得到目標化合物。

實施例3脫芐酯基通法

將多肽芐酯用CH₃OH溶解，冰浴攪拌下緩慢滴加NaOH的水溶液(2M)，冰浴維持反應液溫度在0℃，TLC顯示原料消失。反應液用1M的鹽酸調至中性，減壓除去甲醇，繼續(xù)用1M的鹽酸酸化至pH 2，溶液用乙酸乙酯萃取，合并的乙酸乙酯相用飽和NaCl水溶液洗滌至中性，用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物。

實施例4脫芐氧羰基或芐酯基通法

將具有芐氧羰基或芐酯保護的肽用適量的乙醇溶解，加入鈀碳(反應物量的10％)，通入氫氣室溫氫解。反應結束后過濾,減壓濃縮，得到目標化合物。

實施例5制備Boc-Pro-Ala-OBzl

按照實施例1的方法,從4.3g(20.0mmol)Boc-Pro和8.45g(24.0mmol)Tos·Ala-OBzl得到5.19g(68％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):377[M+H]⁺。

實施例6制備Boc-Pro-Ala

按照實施例4的方法,從5.19g(13.8mmol)Boc-Pro-Ala-OBzl制得3.59g(91％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):285[M-H]^-。

實施例7制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實施例1的方法,從3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和4.06g(10mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl得到4.15g(65％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e):639[M+H]⁺。

實施例8制備Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實施例2的方法,從3.84g(6mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl制得3.34g(96％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e):539[M+H]⁺。

實施例9制備Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實施例1的方法,以1.91g(6mmol)Boc-Arg(NO₂)和3.34g(5.8mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl反應，得到4.13g(82％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e):840[M+H]⁺。

實施例10制備Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實施例2的方法,以3.36g(4mmol)Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl制得到2.86g(92％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e):740[M+H]⁺。

實施例11制備Boc-Gly-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實施例1的方法,以0.7g(4mmol)Boc-Gly和2.86g(3.68mmol)HCl·Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl反應，得到2.47g(75％)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e):897[M+H]⁺。

實施例12制備Boc-Gly-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)

按照實施例3的方法,以2.24g(2.5mmol)Boc-Gly-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl制得1.73g(86％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):805[M-H]^-。

實施例13制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl

按照實施例1的方法,以3.5g(11mmol)Boc-Arg(NO₂)和3.38g(10mmol)Tos·Gly-OBzl反應得到3.3g(73％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):453[M+H]⁺。

實施例14制備Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實施例1的方法,以3.4g(11mmol)Boc-Asp(OBzl)和3.95g(10mmol)Tos·Val-OBzl反應得到3.39g(66％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):515[M+H]⁺。

實施例15制備Boc-Arg(NO₂)-Gly

按照實施例3的方法,以3.3g(7.3mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl制得2.32g(88％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):375[M-H]^-。

實施例16制備Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實施例2的方法,以3.39g(6.6mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl制得2.76g(93％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):415[M+H]⁺。

實施例17制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實施例1的方法,以1.99g(5.5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和2.25g(5mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl反應得到2.58g(67％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):771[M+H]⁺。

實施例18制備Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實施例2的方法,以2.31g(3mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl制得1.83g(91％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):671[M+H]⁺。

實施例19制備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸(1)

將5.0g(25mmol)3,4-二羥基-L-苯丙氨酸用250mL丙酮溶解。向得到的溶液中加入6.0g(30mmol)無水硫酸鎂。30分鐘后，冰浴下加入25mL三氟醋酸(TFA)，之后室溫攪拌96h，TLC(二氯甲烷/甲醇，1:1)顯示原料點消失。反應液過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用丙酮溶解繼續(xù)減壓濃縮，反復3次。殘留物加200mL無水乙醚，析出5.8g(95％)標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e):238[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝6.61(s,1H),6.45(s,1H),3.70(dd,J＝3.9,11.4Hz,1H),2.76(dd,J＝11.7,15.3Hz,1H),2.62(m,1H),1.41(s,3H),1.32(s,3H)。

實施例20制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)-OBzl(2)

按照實施例1的方法，將1.19g(5.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸用10mL無水DMF溶解。向得到的溶液中加入675mg(5.00mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)。10分鐘后，冰浴下加入1.20g(5.83mmol)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)與5mL無水DMF的溶液，得到反應液(I)。把2.83g(5.53mmol)Lys(Boc)-OBzl溶于15mL無水DMF并攪拌30分鐘，得到反應液(II)。冰浴攪拌下，將反應液(II)加入反應液(I)中，然后室溫攪拌12h，TLC(二氯甲烷/甲醇，10:1)顯示3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸消失。反應混合物過濾除二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮除去DMF。殘留物用150mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。乙酸乙酯溶液用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干,殘留物經柱 層析純化(二氯甲烷/甲醇,50/1)，得到1.64g(59％)標題化合物,為淺粉色粉末。ESI-MS(m/e):556[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝8.64(s,1H),8.52(s,1H),8.14(d,J＝7.5Hz,1H),7.36(m,5H),6.74(m,1H),6.57(s,1H),6.37(s,1H),5.14(m,2H),4.30(m,1H),3.55(m,2H),3.32(m,2H),2.88(m,2H),2.57(d,J＝3.9Hz,1H),2.27(m,1H),2.15(s,1H),1.69(m,4H),1.36(s,9H),1.33(s,3H),1.25(s,3H)。

實施例21制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)(3)

按照實施例4通法，從1.50g(2.73mmol)N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)-OBzl得到1.04g(82％)標題化合物，為淺粉色固體，直接用于下一步反應。ESI-MS(m/e):464[M-H]^-。

實施例22制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(4)

按照實施例21的方法，從937mg(2.02mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲酰基-Lys(Boc)和1.41g(2mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到1.63g(73％)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e):1118[M+H]⁺。

實施例23制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(5)

按照實施例2的方法,以1.63g(1.46mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲?；?Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl制得1.35g(91％)標題化合物,為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e):1018[M+H]⁺。

實施例24制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys[Boc-Gly-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(6)

按照實施例21的方法,從1.18g(1.3mmol)Boc-Gly-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)和1.286g(1.22mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲?；?Lys(HCl·)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到1.07g(46％)標題化合物,為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e):1907[M+H]⁺。

實施例25制備N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val(7)

冰浴下,將573mg(0.3mmol)N-(3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酰)-Lys[Boc-Gly-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl用4mL三氟乙酸溶解。向得到的溶液中加入1mL三氟甲磺酸，冰浴下攪拌反應30分鐘后，將反應 液轉入100mL無水乙醚中，有大量沉淀析出，靜置，待沉淀沉降完全后棄去上清，再向殘余物中加入50mL無水乙醚，待沉淀沉降完全后再次棄去上清，減壓濃縮至干，殘余物以Sephadex G10純化除去三氟乙酸和三氟甲磺酸鹽，得到130mg(36％)標題化合物,為無色粉末。ESI-MS(m/e):1204[M+H]⁺.¹H NMR(800MHz,D₂O):δ/ppm＝6.698(s,1H),6.572(s,1H),4.508(t,J＝6.4Hz,1H),4.332(dd,J＝12Hz,J＝4Hz,1H),4.231(m,2H),4.151(t,J＝6.4Hz,1H),4.096(m,1H),3.985(t,J＝6.4Hz,1H),3.935(d,J＝4.8Hz,1H),3.838(m,2H),3.695(m,1H),3.678(m,1H),3.433(m,1H),3.080(dd,J＝16.8Hz,J＝4Hz,2H),3.070(m,4H),3.025(m,1H),2.977(m,1H),2.815(t,J＝7.2Hz,2H),2.645(dd,J＝8Hz,J＝4Hz,2H),2.150(m,1H),1.950(m,1H),1.793(m,2H),1.688(m,4H),1.638(m,3H),1.622(s,3H),1.524(m,6H),1.490(m,2H),1.477(s,3H),1.386(m,2H),1.250(m,2H),1.212(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,D₂O):δ/ppm＝177.410,175.910,174.900,173.895,173.757,173.703,173.574,172.235,171.554,171.511,170.949,169.156,166.873,156.757,144.075,143.804,129.213,120.995,120.421,118.845,115.497,112.304,60.301,58.683,54.108,53.857,53.601,51.371,51.325,50.874,49.539,47.923,42.360,40.550,40.525,40.222,39.127,38.860,37.041,30.558,30.489,30.363,29.402,29.277,27.966,27.946,27.797,27.424,26.864,26.309,24.675,24.326,24.022,22.145,18.699,17.277,16.509,16,378。

實驗例1評價化合物7的抗血栓活性

將雄性SD大鼠(200±20g)，隨機分組，每組10只，飼養(yǎng)1天，停止喂食過夜。灌胃給予化合物7的生理鹽水溶液(劑量為1nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10mL/kg)30min之后，大鼠用20％烏來糖的生理鹽水溶液麻醉，之后手術。分離大鼠的右頸動脈和左頸靜脈，將準確稱重的絲線置于旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側動脈并注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側動脈流經旁路插管進入左側靜脈，15min之后取出附有血栓的絲線稱量，計算血液循環(huán)前后絲線的重量，得到的血栓重,以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t檢驗。數(shù)據列入表1。結果表明口服1nmol/kg化合物7能有效地抑制血栓形成。說明本發(fā)明獲得了意想不到的技術效果。

表1 1nmol/kg化合物7的抗血栓活性

n＝10；a)與生理鹽水相比p<0.01。

實驗例2評價化合物7的溶血栓活性

SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進行麻醉。麻醉大鼠后將其仰臥位固定，分離其右頸總動脈，近心端處夾住動脈夾，將近心端及遠心端分別穿入手術線，遠心端的手術線結扎，遠心端插管，將動脈夾松開，取出約1mL動脈血，置于1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長15mm，內徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內注入0.1mL大鼠動脈血，隨后在管內迅速插入一支不銹鋼材質的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長10mm，內含15個螺圈，螺圈的直徑為1.0mm托柄與螺旋相連，長約7.0mm，呈問號型)。血液凝固45min后，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。

旁路插管由三部分構成，中間段為長60.0mm，內徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長100.0mm，內徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長約10.0mm(用于插入大鼠頸動脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯膠管內)，3段管的內壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯膠管內，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環(huán)的過程中不會漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。

分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠心端分別穿入手術線，結扎遠心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述制備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時遠離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內血栓固定螺旋。用注射器通過另一端的尖管注入準確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時注射器不要撤離聚乙烯管，用動脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動脈的近心端用動脈夾止血，結扎遠心端，在離動脈夾不遠處將右頸總動脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號手術縫線將動靜脈固定。

用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IU/kg)或化合物7的生理鹽水溶液(劑量為1nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)，扎入遠離血栓固定螺旋的近靜脈端，松開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動脈的順序作用于螺旋的血栓上。血液循環(huán)1h之后，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計算每只大鼠旁 路管道中固定血栓的螺旋血液循環(huán)前后血栓的重量差，以均值±SD mg表示并代表溶血栓活性，作t檢驗。數(shù)據列入表2。結果表明1nmol/kg化合物7能有效地溶解形成的血栓。說明本發(fā)明獲得了意想不到的技術效果。

表2 1nmol/kg化合物7的溶血栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p<0.01,與尿激酶相比p>0.05.

實驗例3評價化合物7對缺血性中風大鼠的治療作用

在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長切口,沿胸鎖乳突肌內側緣分離出右頸總動脈,頸外動脈及頸內動脈。用無創(chuàng)動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端,結扎頸外動脈的遠心端,在頸外動脈剪1小口,松開頸總動脈近心端的動脈夾,取10μL血,之后再用無創(chuàng)動脈夾夾閉頸總動脈的近心端。將取得的10μL血放置在1mLEP管中常溫放置30分鐘使血液凝固,然后轉移至-20℃冰箱中放置1小時,使血液凝塊結實。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉,劑量為400mg/kg。取出血液凝塊,加入1mL生理鹽水,用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細小血栓塊,制備細小血栓的懸液并轉移至1mL注射器內。松開頸總動脈近心端的動脈夾，將1mL血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大鼠的大腦,然后結扎頸外動脈近心端,打開頸內動脈和頸總動脈處得動脈夾,恢復血流。等待蘇醒。大鼠蘇醒24小時后按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體征,1分表示未損傷側前肢不能伸展,2分表示向未損傷側行走,3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走,4分表示意識障礙無自主行走,5分表示死亡。按照得分平均分組。各組大鼠經尾靜脈每天注射1次化合物7劑量為1nmol/kg。連續(xù)注射6天，每天評分。結果列入表3。表3的數(shù)據表明,化合物7連續(xù)治療6天可使10只腦缺血24小時的大鼠神經生物學評分為0分，可使2只腦缺血24小時的大鼠神經生物學評分為神經生物學評分為1分。因為不像已經公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg,后5次維持劑量需要2μmol/kg,化合物7的6次劑量均為1nmol/kg。這樣一來,首次劑量和維持劑量分別降低了5000倍和2000倍。

表3化合物7連續(xù)治療6天對腦缺血24小時大鼠神經生物學評分的影響

n＝12,目標化合物劑量＝1nmol/kg,鼠尾靜脈注射給藥。