專利名稱：霍山石斛微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種霍山石斛微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱作短串連重復(fù)(ShortTandem R印eats，STRs)、簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSRs)、簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)。是指一類遍布于生物基因組中的由幾個(gè)核苷酸對(稱為核心序列，一般為1 6bps)為重復(fù)單位組成的簡單串聯(lián)重復(fù)。其重復(fù)次數(shù)在同一物種不同的遺傳型間是高度可變的，但這段重復(fù)的兩端卻是相對保守的單拷貝序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，即可通過PCR技術(shù)分析核心序列重復(fù)次數(shù)的變異，在不同的遺傳型間檢測到多態(tài)。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成，微衛(wèi)星DNA序列被分為3種類型單一型(pure)，復(fù)合型(compound)和間斷型(interrupted)。例如單一型:ATATATATATATATATATATATAT復(fù)合型:ATATATCACACACACACACAC間斷型ATATATCA ATATATCA ATATATA作為一種分子標(biāo)記，微衛(wèi)星DNA具有以下特點(diǎn)廣泛分布于真核生物的基因組中， 據(jù)估計(jì)每61Λ長度中就有1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)；核心序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性，多態(tài)性信息容量高呈共顯性，遵循盂德爾法則遺傳；選擇中性等等?；谝陨咸攸c(diǎn)，微衛(wèi)星DNA被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定和種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、輔助育種、構(gòu)建指紋圖譜、遺傳多樣性及物種進(jìn)化與親緣關(guān)系等方面的研究?；羯绞?Dendrobiumhuoshanense. C. Z. Tang et S. J. Cheng)又名米斛，蘭科石斛屬植物，原產(chǎn)安徽霍山，是藥用石斛中的極品，并被譽(yù)為“中華仙草之最”。作為瀕危植物，霍山石斛現(xiàn)已被中國列入國家一級重點(diǎn)保護(hù)植物。同時(shí)，被世界自然保護(hù)聯(lián)盟 (International Union for Conservation of Nature，IUCN)主編的《瀕危物種紅皮書，The IUCN Red List of Threatened Species》確定為極危種(Critically Endangered, CR)， 瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約(Convention on InternationalTrade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, CITES)亦把它列入附錄 II。由于石斛是一種附生植物，對生態(tài)環(huán)境要求比較嚴(yán)格，自然繁殖頻率極低 (< 5%)，加上長期采集，野生植株已瀕臨滅絕?；羯绞蚱滟|(zhì)量上乘而馳名中外，多年來市場上霍山石斛有名無實(shí)，有價(jià)無市，資源接近枯竭?，F(xiàn)在國內(nèi)外市場上，凡冠以“霍山石斛”、“霍斗”或“野生金霍斛”等名稱的一些楓斗產(chǎn)品，均非用真正的霍山石斛加工而成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題分離克隆霍山石斛的微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，建立霍山石斛微衛(wèi)星DNA技術(shù)體系并用這些分子標(biāo)記進(jìn)行霍山石斛遺傳多樣性，石斛屬植物遺傳關(guān)系的研究，以及進(jìn)行霍山石斛種質(zhì)鑒定。
本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，包括霍山石斛微衛(wèi)星(CT)n富集文庫的構(gòu)建，微衛(wèi)星序列陽性克隆的篩選及測序，得到51個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆。得到12個(gè)多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記HS1、HS2、HS3、HS4、HS5、HS6、HS7、 Hs8、Hs9、HslO、Hsll、Hsl2 ；Hsl 為 5 個(gè)核苷酸，Hs2 為 7；34 個(gè)核苷酸，Hs3 為 709 個(gè)核苷酸，Hs4為530個(gè)核苷酸，Hs5為436個(gè)核苷酸，Hs6為510個(gè)核苷酸，Hs7為550個(gè)核苷酸， Hs8為611個(gè)核苷酸，Hs9為594個(gè)核苷酸，HslO為666個(gè)核苷酸，Hsll為559個(gè)核苷酸， Hsl2為577個(gè)核苷酸。


圖1 :Hsl位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖2 :Hs2位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖3 :Hs3位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖4 :Hs4位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖5 :Hs5位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖6 :Hs6位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖7 :Hs7位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖8 :Hs8位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖9 :Hs9位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖10 =HslO位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖11 :Hsl 1位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖12 :Hsl2位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增M個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明。實(shí)施例1 霍山石斛微衛(wèi)星DNA富集文庫的構(gòu)建1)基因組的提取與酶切用 Doyle J 介紹的 CTAB 法(Doyle J. DNA protocols for ρlants-CTAB total DNA isolation [A]. In Hewitt GM, Johnston A (eds.), Molecular Techniques in Taxonomy [M], Berlin =Springer, 1991, 283-293)提取基因組。用限制性內(nèi)切酶Sau 3AI (購于TaKaRa公司)酶切基因組。2%的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外光下切下400_900bp的DNA 片段。用膠回收試劑盒(購于Axygen公司)回收。2)加接頭將膠回收純化后的產(chǎn)物加入接頭oligo A(5，-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)oligo B(5，-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3，)，在T4DNA Ligase (購于!^ermentas公司)作用下于16°C水浴連接過夜。3) PCR檢測接頭連接以oligo A為引物，以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(50 μ 1反應(yīng)體系如下25μ 1GoTaq Green Master Mix (購于 Promega 公司)，5 μ 1 弓|物 oligo A，5 μ 1 連接產(chǎn)物，力口水補(bǔ)至50 μ 1。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性50秒，56°C退火一分鐘，72°C延伸 2分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)25次，最后72°C充分延伸10分鐘。在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(購于Axygen公司)進(jìn)行純化。4)磁珠富集^ ^ % W. Wl ^ Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles(PMPs)(購于Promega公司)結(jié)合微衛(wèi)星探針上的生物素，由于親和素和生物素的結(jié)合是一個(gè)牢固的，不可逆的過程，因此在二者結(jié)合的同時(shí)，磁珠也吸附了 “微衛(wèi)星探針及包含微衛(wèi)星的基因組DNA單鏈”，在此同時(shí)通過多次洗脫去除不含微衛(wèi)星的基因組片斷， 最后通過高溫變性打開微衛(wèi)星探針與DNA鏈的結(jié)合，從而達(dá)到富集含微衛(wèi)星片斷的目的。 將雜交液加入已處理好的磁珠，室溫靜置30分鐘。將離心管放在磁力架上，吸去上清，依次用0. 5 X SSC，6 X SSC在室溫下洗三次，再用6父55(，2\55(，1\55(在601下洗兩次，最后用0. 1 X SSC室溫下洗一次。加入TE緩沖液，在PCR儀上95°C變性10分鐘，收集上清。重復(fù)兩次。5) PCR 富集以磁珠富集產(chǎn)物為模板，oligo A為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μ 1反應(yīng)體系如下， 12. 5μ 1 GoTaq Green Master Mix (購于 Promega 公司)，1· 5 μ 1 引物 oligo Α，2·5μ1 富集后的DNA，加水補(bǔ)至25 μ 1。PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性35秒， 60°C退火性35秒，72°C延伸1分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)25次，最后72°C充分延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用純化試劑盒(購于Axygen公司) 進(jìn)行純化。6)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取平板上E. coliDH-5a單菌落，接種于5ml的不含Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取Iml培養(yǎng)液于50ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，2 4h至對數(shù)期。 測OD (0. 2 0. 6)。將培養(yǎng)液分裝至EP管中(每管1. 5ml菌液)，水浴10 15min。在4°C 離心，4000rpm，IOmin (先降溫后再離心)棄上清。棄上清后三管并一管，冰浴30min (第一管加入0. lmol/L, Iml事先冰中預(yù)冷的CaCl2,混勻，吸出至第二管，如此將三管并一管)。取出后梯度離心，4°C，4000rpm，5 anin。棄上清。加入200 μ 1預(yù)冷甘油(15% )/CaCl2 (0. 1Μ) 混勻，_80°C保存。7)連接轉(zhuǎn)化取PCR富集后的純化產(chǎn)物連接入TA克隆載體(pMD19-T Simple Vector)(購于 TaKaRa公司)，16°C水浴連接2_3小時(shí)。取出凍存管，冰上復(fù)蘇IOmin ；將10 μ 1的連接產(chǎn)物加入200 μ 1感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min ；42°C水浴熱休克90s ；冰浴anin，加入600 μ 1 LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)1.證；取70 μ 1培養(yǎng)液，滴入LB/Amp/X-gal/IPTG平板上并涂布均勻(X-Gal需避光)；將平板37°C正向放置培養(yǎng)0.證，然后于37°C烘箱中倒置培養(yǎng)過夜。 經(jīng)過12h的培養(yǎng)，待平板上的菌落大小適中，取出平板于4°C放置使藍(lán)斑充分顯現(xiàn)。用滅過菌的牙簽挑取平板上白色單克隆菌落，置于96深孔板中(深孔板事先加入了 400μ 1的含 Amp抗性的LB/Amp培養(yǎng)基)。當(dāng)白色單菌落挑取結(jié)束后，用不干膠將孔板蓋好后于37°C， 225rpm振蕩培養(yǎng)4h。
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8)含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選以連接轉(zhuǎn)化所得的菌液為模板，利用引物oligo A和引物(CT)12進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 15 μ 1 PCR 反應(yīng)體系包括rTaq 酶 0. 375U (購自 TaKaRa 公司)，10 X Buffer 1. 5 μ 1，dNTP 0.2μΜ，Μβα21.5μΜ3|*0.4μΜ(ο1 igo A, (CT) 12)，水，模板。反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 3 分鐘，94°C變性50秒，56°C退火35秒，72°C延伸1分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)30次。 最后72°C充分延伸12分鐘。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。對于PCR產(chǎn)物檢測中有2條或3 條帶的克隆，則這些克隆內(nèi)可能含有微衛(wèi)星的插入片段。9)陽性克隆測序及引物設(shè)計(jì)選取擴(kuò)增片斷長度在300_900bp的可能含有微衛(wèi)星插入片段的陽性克隆菌液，送生工生物(上海)有限公司測序，共得到36條含有微衛(wèi)星DNA的序列。利用軟件ft~imer Premier 5. 0根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的序列來設(shè)計(jì)引物。10)篩選有多態(tài)性的引物用上述的CTAB法提取霍山石斛的基因組。用設(shè)計(jì)好的引物(表1)擴(kuò)增基因組。 反應(yīng)程序94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性45秒，相應(yīng)的退火溫度30秒，72°C延伸35秒，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)35次。最后72°C充分延伸8分鐘。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物用PAGE電泳進(jìn)行檢測。共得到12個(gè)有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。Hsl為5 個(gè)核苷酸，Hs2為734個(gè)核苷酸，Hs3為709個(gè)核苷酸，Hs4為530個(gè)核苷酸，Hs5為436個(gè)核苷酸，Hs6為510個(gè)核苷酸，Hs7為550個(gè)核苷酸，Hs8為611個(gè)核苷酸，Hs9為594個(gè)核苷酸，HslO為666個(gè)核苷酸，Hsll為559個(gè)核苷酸，Hsl2為577個(gè)核苷酸。11)結(jié)果分析使用CervuS3. 0軟件計(jì)算期望雜合度和觀察雜合度。使用Gen印op3. 4軟件計(jì)算哈代-溫伯格以及連鎖不平衡的值，以此來描述12個(gè)霍山石斛微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點(diǎn)的特征。 由附圖1-12可看出，本發(fā)明的12個(gè)微衛(wèi)星序列的長度在供試的對個(gè)霍山石斛中都出現(xiàn)了多樣性，由此可見，本發(fā)明的這12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記能用于研究霍山石斛的遺傳多樣性，石斛屬植物種間和居群間的變異和進(jìn)化關(guān)系，具有很高的重復(fù)性，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。表1引物特性表
權(quán)利要求
1. 一種霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，其特征在于所述微衛(wèi)星標(biāo)記的標(biāo)號分別為 Hsl、Hs2、Hs3、Hs4、Hs5、Hs6、Hs7、Hs8、Hs9、HslO、Hsll、Hsl2 ;其核苷酸序列分別為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，其特征在于 所述的 Hs 1、Hs2、Hs3、Hs4、Hs5、Hs6、Hs7、Hs8、Hs9、Hs 10、Hs 11、Ps 12 十二個(gè)位點(diǎn)的弓 I 物序列為Hsl--FACACGGGTTCCGACATTGHsl--RCGACGGTTGGAGTTCTGGTHs2--FTTGTAACTTCCGAACCCGCHs2--RTCGTCCGAACTCCACCTCTHs3--FTCCTCAAAGCAAGAGTGAACCHs3--RAAGCAGCAGAAGCAACCCATAHs4--FTCATCAACGACAAGCCATCAHs4--RTACTGCCAAGTGCCAACCATAHs5--FTCTCATCGTCGCCGTTACHs5--RTGTTGCTCTGGTTCCATCTCHs6--FTTCCCAGTTCCTCCTCCTATHs6--RGCTGTCTTTGAAGTTGGTCTCHs7--FCTTGGAGCAACCTTTGTGAAHs7--RTCCCGACTGATTGAGCCTATHs8--FCTTGGAACCTTACTTGGAGCAHs8-R GCA TAA CAC CTT GAG TCT ACT ATC TTG Hs9-F TAT CCC TTC CTC TGG TTG TG Hs9-R AGA AAA GCT GCC CGT CATHslO--FATAATGGTATGACTAAACACTTCTHslO--RTGATACGAGATGACAAGATGCTHsll--FGTGCTGGGTGACGTGAGATAGTHsll--RGGAGTCTTTACATTTCTTCGCTTGHsl2--FCAAGGCTCACCTCACAATHsl2--RTGAAAGCGAATCTCCATCT。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，包括霍山石斛微衛(wèi)星(CT)n富集文庫的構(gòu)建，微衛(wèi)星序列陽性克隆的篩選及測序，得到36個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆，篩選得到了12個(gè)高多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hs1、Hs2、Hs3、Hs4、Hs5、Hs6、Hs7、Hs8、Hs9、Hs10、Hs11、Hs12。本發(fā)明可用于研究霍山石斛的遺傳多樣性，石斛屬植物種間和居群間的變異和進(jìn)化關(guān)系，具有重復(fù)性好，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。
文檔編號C12N15/11GK102168084SQ201110103370
公開日2011年8月31日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者朱國萍, 李雪, 王文才, 王暉, 鄭基陽, 陳乃富, 靳明明, 高鵬 申請人:安徽師范大學(xué)