專利名稱：水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因tri1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆水稻TRIl (Triangle Hull 1)基因，以及利用轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)鑒定該基因的功能；同時(shí)還涉及利用該基因產(chǎn)物對(duì)水稻穎殼形狀進(jìn)行調(diào)控，用做形態(tài)標(biāo)記或者提高產(chǎn)量等應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻花器官的發(fā)育結(jié)果直接影響稻谷產(chǎn)量和稻米品質(zhì)，而且水稻是單子葉植物發(fā)育分子生物學(xué)研究的模式植物，近年來有關(guān)水稻花發(fā)育基因調(diào)控的研究已取得了長足的進(jìn)展，通過突變體獲得了一系列與水稻花發(fā)育相關(guān)的基因。因此，利用水稻穎花突變體研究單子葉植物花器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制是目前植物分子遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)，并為將來水稻產(chǎn)量的提高打下基礎(chǔ)。隨著越來越多的水稻花器官突變體的獲得和花發(fā)育相關(guān)的基因被克隆，但是它們與ABC模型中的典型基因并沒有同源性，比如水稻無穎殼突變體dhl，它編碼一個(gè)包含LOB 結(jié)構(gòu)域的蛋白，雖然大部分突變體表現(xiàn)為穎殼缺失，但是還有一些表現(xiàn)為漿片缺失，雄蕊數(shù)目異?；蛘咧^數(shù)目異常等等，還有水稻凹陷內(nèi)穎突變體retared paleal (repl) 0它在花發(fā)育的早期只在內(nèi)穎原基表達(dá)，但是到了發(fā)育后期，又迅速擴(kuò)散在雄蕊和內(nèi)外穎都表達(dá)，從而導(dǎo)致內(nèi)穎發(fā)育不良，但并沒有完全消失。最近人們通過水稻額外穎突變體克隆了 EXTRA GLUME 1 (EGl)基因，它編碼一個(gè)可能是脂肪酶的蛋白，并獲得了兩個(gè)等位突變體，它們都表現(xiàn)為有多個(gè)穎殼，但是除此之外強(qiáng)突變體中有的單株表現(xiàn)為內(nèi)部產(chǎn)生額外的穎花，各輪花器官無法分化等性狀，通過RT-PCR 和原位雜交發(fā)現(xiàn)在穗原基的時(shí)候該基因就開始大量表達(dá)，一直到花發(fā)育成熟。因此簡(jiǎn)單的 ABC模型已不能完全描述花的發(fā)育全過程，這牽涉到許多基因的調(diào)控，它們之間通過各種轉(zhuǎn)錄因子組成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，我們只有通過發(fā)現(xiàn)這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中更多的節(jié)點(diǎn)，從而深入了解花發(fā)育過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種能影響水稻穎殼形狀的基因及其蛋白質(zhì)，以及由此獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，和利用所述基因?qū)λ痉f殼進(jìn)行改造的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl編碼的蛋白質(zhì)的改進(jìn)上述氨基酸序列還包括在SEQ ID No :2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸生成的衍生物。本發(fā)明還提供一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因一水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRI1， 其具有SEQ ID No 1所示的核苷酸序列。作為本發(fā)明的水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl的改進(jìn)上述核苷酸序列還包括在SEQ ID No :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸生成的突變體、等位基因或衍生物。本發(fā)明還提供一種包含上述水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl的質(zhì)粒。本發(fā)明還提供一種包含上述水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl的植物表達(dá)載體。本發(fā)明還提供一種包含上述核酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種改變水稻穎殼形狀的方法，包括用具有SEQ ID No 1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。進(jìn)一步具體說明本發(fā)明的目的是提供一種從水稻突變體triangle hull 1中克隆的新基因TRI1，如SEQ ID No :1所示的DNA序列，也包括與SEQ ID No :1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ ID No :2所示的蛋白質(zhì)屬于含有DUF640 結(jié)構(gòu)域的表達(dá)蛋白，其中進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括在SEQ ID No :1中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達(dá)到本發(fā)明的目的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用TRIl基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID No :1所示的序列的基因或基因部分片段的載體，其中，如圖4所示的pCAMBIA1300+promoter+TRIl+nos，該載體可以表達(dá)有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。本發(fā)明還提供了一種利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞影響水稻穎殼形狀的方法。 具體地是利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以影響農(nóng)作物穎殼形狀的方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、水稻穎殼突變體tril的分離和遺傳分析本發(fā)明的水稻穎殼突變體tril來自EMS處理粳稻品種日本晴導(dǎo)致的突變。通過與野生型水稻的正反交實(shí)驗(yàn)，證明該突變體受隱性單基因控制，如圖1所示。二、圖位克隆控制水稻穎殼形狀的TRIl基因1、TRIl基因的初步定位為了分離TRIl基因，本發(fā)明首先組建了兩個(gè)定位群體，由tril分別與秈稻品種南京6號(hào)和明恢63 (Indica)雜交組配成兩個(gè)F2定位群體，再通過圖位克隆的方法，利用STS、 SSR等分子標(biāo)記對(duì)TRIl位點(diǎn)進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第2號(hào)染色體的長臂上，并介于 RM5607和RM6312兩SSR標(biāo)記之間，見圖2。2), TRIl基因的精細(xì)定位通過對(duì)RM5607和RM6312兩個(gè)標(biāo)記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的SSR、STS標(biāo)記將TRIl精確定位于BAC號(hào)為AP004081和AP005303之間重疊的區(qū)段上LT1-2和LT1-8標(biāo)記之間23kb范圍之內(nèi)，并且與分子標(biāo)記LT1-6共分離(圖3)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框 (ORF)推測(cè)候選基因。3)、TRIl基因的鑒定和功能分析通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻 (圖5)，證明了本發(fā)明正確克隆了 TRIl基因，氨基酸序列分析表明TRIl編碼一個(gè)含有 DUF640結(jié)構(gòu)域的表達(dá)蛋白。綜上所述，本發(fā)明利用水稻三角穎突變體，通過圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了 TRI1基因，該基因編碼一含有DUF640結(jié)構(gòu)域的表達(dá)蛋白，在水稻中控制了穎殼形狀以及穗頸節(jié)長度。通過對(duì)TRIl基因的功能解讀，再通過梳理其上下游基因的關(guān)系，那么將為進(jìn)一步探索單子葉植物花發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理打下基礎(chǔ)。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是水稻三角穎突變體tril與野生型材料的表型；在圖1的下圖中第一、二列為野生型日本晴的穎殼；第第三、四列為突變體的穎殼；圖2是TRIl基因在水稻第2染色體上的初步定位圖；圖3是TRIl基因的精細(xì)定位圖；圖 4 是 pCAMBIA1300+TRIl 載體圖譜；圖5是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)Ttl轉(zhuǎn)基因水稻植株穎殼的表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1、水稻材料水稻(Oryza sativa L.)穎殼突變體tril (triangle hull 1)，原始野生材料為粳稻品種“日本晴”。其等位突變體為粳稻品種“中花11”。上述水稻穎殼突變體tril是來自EMS處理粳稻品種日本晴導(dǎo)致的突變。其表型如圖1所示。2、分析和定位群體純合的tril突變體分別和正常表型品種明恢63以及南京6號(hào)進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交，得到F2群體，并從中選出一共1204株tril突變體表型的個(gè)體作為定位群體。在抽穗期每株取1克左右的嫩葉，用來提取總DNA。該基因是隱性突變，因此在F2群體中會(huì)按照1 3的比例分離，其中正常野生型表型的占3/4，突變體表型的占1/4，我們選擇了突變體表型的單株作為定位群體。3、SSR和STS標(biāo)記定位TRIl基因采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組 DNA0具體如下取大約0. 2g水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于200 μ 1超純水中作為DNA樣品。每一個(gè)PCR反應(yīng)用2μ 1 DNA樣品。TRIl基因的初步定位在tril與明恢63組合的F2群體中選取60個(gè)隱性個(gè)體， 組成的小群體進(jìn)行SSR分析，根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶(EB)染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將TRIl初步定位在第2號(hào)染色體長臂RM5607和RM6312標(biāo)記之間，見圖2。PCR反應(yīng)體系的組成為
權(quán)利要求
1.水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有SEQ IDNo 2所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于所述氨基酸序列還包括在SEQ ID No :2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRI1，其特征在于該基因具有SEQID No :1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRI1，其特征在于所述核苷酸序列還包括在SEQ ID No :1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。
5.一種含有權(quán)利要求3或4所述的水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl的質(zhì)粒。
6.一種含有權(quán)利要求3或4所述的水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl的植物表達(dá)載體。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求3或4所述的水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRIl序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于該宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
9.一種改變水稻穎殼形狀的方法，其特征在于包括用具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRI1編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQIDNo2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開了一種水稻穎殼形態(tài)建成調(diào)控基因TRI1，該基因具有SEQIDNo1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開了一種改變水稻穎殼形狀的方法，包括用具有SEQIDNo1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。利用本發(fā)明的基因能對(duì)水稻穎殼進(jìn)行改造。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102219840SQ20111010365
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者劉堅(jiān), 張光恒, 曾大力, 朱麗, 李峰, 胡江, 董國軍, 薛永彪, 郭龍彪, 錢前, 顏美仙, 高振宇 申請(qǐng)人:中國水稻研究所