專利名稱：水稻穎花發(fā)育的一種新基因Dhl及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻的功能基因分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
T-DNA標(biāo)簽是一種高通量的克隆和分析植物功能基因的方法，在擬南芥等高等植物上，已廣泛開展利用T-DNA標(biāo)簽技術(shù)來闡明基因的功能，并相繼克隆了一批基因(Jeon等，2001；Tyagi等，2000；Krysan等，1999等；Green等，1999；Papi等，2000；Oyama等，2002)。隨著高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的建立(Heli等，1994)，在水稻上也已有了構(gòu)建T-DNA插入突變體庫和成功利用該體系分離、克隆基因的報(bào)道(Jung等，2003；Jeon等，2000；Jeong等，2002；Wu等，2003；Lee等2004)。
雖然水稻基因全序列已為人類所獲知，但各基因片段分別在水稻生長(zhǎng)、傳代過程擔(dān)任的角色還不為人所知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于探究影響水稻穎花發(fā)育的基因及其克隆該基因的方法，以為人類進(jìn)一步對(duì)水稻功能的完全識(shí)別。
水稻穎花發(fā)育的一種新基因Dh1長(zhǎng)度為1207bp，其基因全序列為aggttaatta gcaagtgagt cgtagtaagg cagaggacgt tggccttctt attcaacgca 60gcattaacac gtttgctccc ctcgaaccag acaccctacc ctacctgtcc tcctctcttc 120ttcctcctct cctctccttc ctcctcttat aaatccacct cctccatctc aagttgcacc 180gctactagca gctaacctac ctacactaca ctacaccaca cactacactt ggagagaagc 240acacgtagct agagtgatcg attcattttc ttgctcgatc ttgatcggta tggctggtgc 300tacggctgcc ggcgctgccg ctgccgcggc ggggacggga gccgggtcgc cgtgcggcgc 360gtgcaagttc ttgcggcggc ggtgcgtgcc ggagtgcgtg ttcgcgccct acttcagctc 420ggagcaaggg gcggcgaggt tcgcggcgat ccacaaggtg ttcggcgcca gcaacgcctc 480caagctcctc tcccacctcc ccgtcgccga ccgctgcgag gccgtcgtca ccatcaccta 540
cgaggcccag gccaggctcc gcgaccccgt ctatggctgc gtcgcccaaa tcttcgccct 600ccagcagcag gtactatttc atttcatgga tgagaatgag atgatctcgt cgctgctcga 660tcgatcgatc gatcgcctct cggatttgtg actgattcga tcgatgctac atacaggtcg 720cgatcctgca agcgcagctg atgcaggcga gggcgcagct ggcgtgcggc atccagagca 780gctcgcactc tccggtgagc tggccggaca gcggcagcat cagcgcgcta ctccggcagg 840acatggcgag aaggccgccc ggcggcgccc tcgacgactg cttcggcggc ggcggcgcgc 900tgctgccgga gctcatggcg gccggcttca aggacgacgt cgccgccgtg cagatgcagc 960agcattgctc caaggcggtg gacgccggcg agctccagta tctggcccag gcgatgatga 1020gatcaacctc caactactct cagtagaaag aaaaatcaaa caatgcaacg ctttgcatgc 1080aggagttaga gagtggacaa gcaaaaattt agcctgtgta ctactgaact tttttatcag 1140tgcaacgtca tagtgaagca attagtctgc ttcatgatga tgattagtac gtagtactac 1200taaataa其編碼的氨基酸序列為MAGATAAGAAAAAAGTGAGSPCGACKFLRRRCVPECVFAPYFSSEQGAARFAAIHKVFGASNASKLLSHLPVADRCEAVVTITYEAQARLRDPVYGCVAQIFALQQQVAILQAQLMQARAQLACGIQSSSHSPVSWPDSGSISALLRQDMARRPPGGALDDCFGGGGALLPELMAAGFKDDVAAVQMQQHCSKAVDAGELQYLAQAMMRSTSNYSQ。
水稻穎花發(fā)育的一種新基因Dh1的克隆方法是先獲取日本晴相應(yīng)BAC(AP004048)，用核酸內(nèi)切酶Hind III切割日本晴相應(yīng)BAC，電泳后回收目標(biāo)DNA片段，與用相同酶切割的載體連接。
本發(fā)明通過對(duì)項(xiàng)目組T-DNA插入突變體庫的篩選，發(fā)現(xiàn)一種穎花穎殼退化突變體(Degenerated hull1，簡(jiǎn)稱Dh1)，側(cè)翼序列比對(duì)和共分離分析結(jié)果顯示是一種LOB domain-like protein的基因突變引發(fā)的功能喪失(減弱)。通過互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證了其功能。通過構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體研究其時(shí)空表達(dá)模式，進(jìn)一步證實(shí)了其功能。


圖1為突變體庫構(gòu)建設(shè)采用的載體圖片。
圖2為T-DNA插入序列GAL4/VP16的特異PCR分子檢測(cè)的電泳圖。
圖3為預(yù)測(cè)的1基因的基本情況示意圖。
圖4為互補(bǔ)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)真轉(zhuǎn)化子的表型照片。
圖5為對(duì)轉(zhuǎn)化獲得的擬雜合體進(jìn)行PCR擴(kuò)增的兩側(cè)擴(kuò)增出特異條帶電泳圖。
圖6為互補(bǔ)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)各轉(zhuǎn)化子的RT-PCR分析圖。
圖7為GFP融合蛋白基因轉(zhuǎn)化后代的電泳圖。
圖8為不同時(shí)期基因在發(fā)育早期的幼穗和穎花中表達(dá)熒光圖。
圖9為構(gòu)建突變體庫所用載體示意圖。
圖10為互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體示意圖。
具體實(shí)施方法一、突變體的篩選采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入方法，構(gòu)建水稻品種中花11號(hào)插入突變體庫，突變體庫構(gòu)建設(shè)采用的載體，如圖1所示。
每個(gè)轉(zhuǎn)化子的T1代株系種植20株，共種植4000余個(gè)轉(zhuǎn)化子。發(fā)現(xiàn)1個(gè)株系內(nèi)突變出2株穎花退化的變異個(gè)體。對(duì)其全部單株進(jìn)行基于T-DNA插入序列GAL4/VP16的特異PCR分子檢測(cè)，上下游引物序列為5’-GGCATCGGTAAACATCTGCT-3’和5’-GCCTCAAGAAGCTCAAGTGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為0.611kb。檢測(cè)結(jié)果突變株為陽性(能夠擴(kuò)增出1條特異性電泳條帶)，正常型植株中陽性率為67％。收獲陽性正常株種植T2代36株，繼續(xù)上述分子檢測(cè)，群體中的9個(gè)突變株均表現(xiàn)為陽性，正常株中9株為陰性，而且，在這一世代發(fā)現(xiàn)雜合體有表型，即雜合株穗子上有少數(shù)穎花的穎殼退化，18個(gè)雜合株檢測(cè)結(jié)果均為陽性，如圖2所示，從左向右各泳道依次為4-9為突變體，1-3和10-22為表型正常植株，22為陽性對(duì)照(載體)，23-24為陰性對(duì)照(分別水和野生型植株)，25為marker。
至此，確認(rèn)突變表型與T-DNA插入共分離，即該插入為T-DNA單拷貝插入，突變表型系由T-DNA插入引起的單基因突變所致。
二、側(cè)翼序列的獲得和共分離檢測(cè)通過TAIL-PCR的方法分離側(cè)翼序列，其方法參見Liu等(1995)的介紹。經(jīng)過測(cè)序，獲得長(zhǎng)度為316bp(堿基對(duì))的側(cè)翼序列。
通過側(cè)翼序列與水稻全基因組序列的比對(duì)，其與水稻BAC克隆AP004048中的一段DNA序列幾乎完全相同。至此，將突變基因初步定位于水稻第2染色體。
在T-DNA插入點(diǎn)的兩側(cè)設(shè)計(jì)基因組序列引物F1(CCA ACG TCC TCT GCCTTA C)、R1(AGT GGC TAC ATT TAG TTT GCT G)，在T-DNA右邊界設(shè)計(jì)引物F2(GAC ACT CCC AGT TGT TCT TC)，分別以F1/R1和F2/R1配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果與表型對(duì)應(yīng)進(jìn)行分析，證實(shí)側(cè)翼序列與突變表型共分離，即該側(cè)翼序列確系T-DNA插入點(diǎn)的旁側(cè)序列，可以據(jù)此確定插入點(diǎn)處被破壞的基因的DNA序列。
三、預(yù)測(cè)基因的全序列和功能根據(jù)生物信息學(xué)軟件的分析，突變基因從前一種基因的末端后開始至下游調(diào)控區(qū)域結(jié)束，全長(zhǎng)共2888bp，如圖3所示。其包括2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，編碼1個(gè)含有l(wèi)ateral organ boundary(LOB)-like結(jié)構(gòu)域的蛋白，控制特定器官邊界組織的分化和發(fā)育。
Dh1基因全序列aggttaatta gcaagtgagt cgtagtaagg cagaggacgt tggccttctt attcaacgca 60gcattaacac gtttgctccc ctcgaaccag acaccctacc ctacctgtcc tcctctcttc 120ttcctcctct cctctccttc ctcctcttat aaatccacct cctccatctc aagttgcacc 180gctactagca gctaacctac ctacactaca ctacaccaca cactacactt ggagagaagc 240acacgtagct agagtgatcg attcattttc ttgctcgatc ttgatcggta tggctggtgc 300tacggctgcc ggcgctgccg ctgccgcggc ggggacggga gccgggtcgc cgtgcggcgc 360gtgcaagttc ttgcggcggc ggtgcgtgcc ggagtgcgtg ttcgcgccct acttcagctc 420ggagcaaggg gcggcgaggt tcgcggcgat ccacaaggtg ttcggcgcca gcaacgcctc 480caagctcctc tcccacctcc ccgtcgccga ccgctgcgag gccgtcgtca ccatcaccta 540cgaggcccag gccaggctcc gcgaccccgt ctatggctgc gtcgcccaaa tcttcgccct 600ccagcagcag gtactatttc atttcatgga tgagaatgag atgatctcgt cgctgctcga 660tcgatcgatc gatcgcctct cggatttgtg actgattcga tcgatgctac atacaggtcg 720cgatcctgca agcgcagctg atgcaggcga gggcgcagct ggcgtgcggc atccagagca 780gctcgcactc tccggtgagc tggccggaca gcggcagcat cagcgcgcta ctccggcagg 840acatggcgag aaggccgccc ggcggcgccc tcgacgactg cttcggcggc ggcggcgcgc 900tgctgccgga gctcatggcg gccggcttca aggacgacgt cgccgccgtg cagatgcagc 960
agcattgctc caaggcggtg gacgccggcg agctccagta tctggcccag gcgatgatga 1020gatcaacctc caactactct cagtagaaag aaaaatcaaa caatgcaacg ctttgcatgc 1080aggagttaga gagtggacaa gcaaaaattt agcctgtgta ctactgaact tttttatcag 1140tgcaacgtca tagtgaagca attagtctgc ttcatgatga tgattagtac gtagtactac 1200taaataa編碼的氨基酸序列MAGATAAGAAAAAAGTGAGSPCGACKFLRRRCVPECVFAPYFSSEQGAARFAAIHKVFGASNASKLLSHLPVADRCEAVVTITYEAQARLRDPVYGCVAQIFALQQQVAILQAQLMQARAQLACGIQSSSHSPVSWPDSGSISALLRQDMARRPPGGALDDCFGGGGALLPELMAAGFKDDVAAVQMQQHCSKAVDAGELQYLAQAMMRSTSNYSQ四、互補(bǔ)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化獲取日本晴相應(yīng)BAC(AP004048)，用核酸內(nèi)切酶Hind III切割該BAC，電泳后回收合乎預(yù)計(jì)大小的DNA片段，與用相同酶切割的載體連接，電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株，檢測(cè)并篩選出單克隆重組體，如圖2，構(gòu)建的載體示意圖)。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化突變株自交后代的成熟胚，在含有抗菌素篩選劑的繼代培養(yǎng)基上篩選，再經(jīng)胚性愈傷分化成苗過程，獲得較多轉(zhuǎn)化后代，部分T0代轉(zhuǎn)化子的突變表型得到不同程度的恢復(fù)，如圖4所示。
五、轉(zhuǎn)化后代的PCR和RT-PCR分析從功能驗(yàn)證載體T-DNA中的兩側(cè)載體序列至目的基因內(nèi)，分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物一對(duì)引物為5′-GCAGAGGCATCTTGAACGATAG-3′5′-ACGGAGTACTTTACTGAAGTGTTG-3′另一對(duì)引物為5′-GTTTTCCCAGTCACGACGTTG-3′5′-GCTTGGTCACTGGCTGTTTG-3′對(duì)轉(zhuǎn)化獲得的擬雜合體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩側(cè)均能擴(kuò)增出特異條帶，如圖5所示的個(gè)體被認(rèn)為是真轉(zhuǎn)化子。圖5中，I為基因一側(cè)的PCR檢測(cè)結(jié)果，II為基因另一側(cè)的PCR檢測(cè)結(jié)果。擴(kuò)增片斷為從基因外至基因內(nèi)的基因組序列。Ck為載體對(duì)照，1-5為全長(zhǎng)基因過表達(dá)的不同T0植株，6-9為互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的不同T。植株。
分別提取這些轉(zhuǎn)化子幼穗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)特異引物5′-TCGTCACCATCACCTACGAG-3′和5′-CAATGCTGCTGCATCTGCA-3′進(jìn)行RT-PCR分析。以組成性表達(dá)的actin基因的表達(dá)強(qiáng)度和一致性為參照，以正常株和突變株的RT-PCR結(jié)果作為對(duì)照，對(duì)各轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，如圖6所示，以actin基因的RT-PCR結(jié)果作為參照，野生型和突變體的RT-PCR結(jié)果作為對(duì)照。結(jié)果田間表現(xiàn)明顯雜合表型的個(gè)體的RT-PCR電泳條帶的亮度均介于正常株和突變株之間而偏向于正常株，說明這些轉(zhuǎn)化子有目的基因的表達(dá)。
以上互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，克隆的基因即為Dh1目的基因。
六、GFP融合表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計(jì)特定引物5′-CGGGATCCTGGAGGTTGATCTCATCATCG-3′5′-GGAATTCCAATCCAATGGCAGGTGGTC-3′擴(kuò)增Dh1基因的上游調(diào)控序列，插入到帶有GFP基因的結(jié)構(gòu)基因區(qū)的載體中，構(gòu)成融合表達(dá)載體。同樣方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。轉(zhuǎn)化親本中花11號(hào)，獲得轉(zhuǎn)化植株，如圖7所示。
不同時(shí)期通過熒光體視顯微鏡觀察，該基因在發(fā)育早期的幼穗和穎花中表達(dá)，如圖8所示。進(jìn)一步證實(shí)預(yù)測(cè)基因即為目的基因Dh1。
權(quán)利要求
1.水稻穎花發(fā)育的一種新基因Dh1，其基因全序列長(zhǎng)度為1207bp，其基因全序列為aggttaatta gcaagtgagt cgtagtaagg cagaggacgt tggccttctt attcaacgca 60gcattaacac gtttgctccc ctcgaaccag acaccctacc ctacctgtcc tcctctcttc 120ttcctcctct cctctccttc ctcctcttat aaatccacct cctccatctc aagttgcacc 180gctactagca gctaacctac ctacactaca ctacaccaca cactacactt ggagagaagc 240acacgtagct agagtgatcg attcattttc ttgctcgatc ttgatcggta tggctggtgc 300tacggctgcc ggcgctgccg ctgccgcggc ggggacggga gccgggtcgc cgtgcggcgc 360gtgcaagttc ttgcggcggc ggtgcgtgcc ggagtgcgtg ttcgcgccct acttcagctc 420ggagcaaggg gcggcgaggt tcgcggcgat ccacaaggtg ttcggcgcca gcaacgcctc 480caagctcctc tcccacctcc ccgtcgccga ccgctgcgag gccgtcgtca ccatcaccta 540cgaggcccag gccaggctcc gcgaccccgt ctatggctgc gtcgcccaaa tcttcgccct 600ccagcagcag gtactatttc atttcatgga tgagaatgag atgatctcgt cgctgctcga 660tcgatcgatc gatcgcctct cggatttgtg actgattcga tcgatgctac atacaggtcg 720cgatcctgca agcgcagctg atgcaggcga gggcgcagct ggcgtgcggc atccagagca 780gctcgcactc tccggtgagc tggccggaca gcggcagcat cagcgcgcta ctccggcagg 840acatggcgag aaggccgccc ggcggcgccc tcgacgactg cttcggcggc ggcggcgcgc 900tgctgccgga gctcatggcg gccggcttca aggacgacgt cgccgccgtg cagatgcagc 960agcattgctc caaggcggtg gacgccggcg agctccagta tctggcccag gcgatgatga 1020gatcaacctc caactactct cagtagaaag aaaaatcaaa caatgcaacg ctttgcatgc 1080aggagttaga gagtggacaa gcaaaaattt agcctgtgta ctactgaact tttttatcag 1140tgcaacgtca tagtgaagca attagtctgc ttcatgatga tgattagtac gtagtactac 1200taaataa其編碼的氨基酸序列為MAGATAAGAAAAAAGTGAGSPCGACKFLRRRCVPECVFAPYFSSEQGAARFAAIHKVFGASNASKLLSHLPVADRCEAVVTITYEAQARLRDPVYGCVAQIFALQQQVAILQAQLMQARAQLACGIQSSSHSPVSWPDSGSISALLRQDMARRPPGGALDDCFGGGGALLPELMAAGFKDDVAAVQMQQHCSKAVDAGELQYLAQAMMRSTSNYSQ。
2.水稻穎花發(fā)育的一種新基因Dh1的克隆方法，其特征在于先獲取日本晴相應(yīng)BAC，用核酸內(nèi)切酶Hind III切割日本晴相應(yīng)BAC，電泳后回收目標(biāo)DNA片段，與用相同酶切割的載體連接，得到基因Dh1。
全文摘要
水稻穎花發(fā)育的一種新基因Dh1及其克隆方法，涉及水稻的功能基因分析技術(shù)領(lǐng)域。用核酸內(nèi)切酶Hind III切割日本晴相應(yīng)BAC，電泳后回收目標(biāo)DNA片段，與用相同酶切割的載體連接，得到水稻穎花發(fā)育的一種基因Dh1，并通過互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證了其功能。通過構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體研究其時(shí)空表達(dá)模式，進(jìn)一步證實(shí)了其功能，對(duì)于今后研究水稻新品種的開發(fā)打下了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1786168SQ200510095020
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月26日
發(fā)明者潘學(xué)彪, 張亞芳, 李愛宏, 陳宗祥, 左示敏 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)