專利名稱：檢測(cè)恩諾沙星的scFv抗體、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)恩諾沙星的SCFv重組抗體、其編碼基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR0)，化學(xué)名稱為1_環(huán)丙基_7-(4_乙基哌嗪基)-6-氟-1，4- 二氫-4-氧代-3-喹啉羧酸，屬于氟奎諾酮類，具廣譜抗菌活性，對(duì)支原體有特效，對(duì)大腸桿菌、克雷白桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、綠膿桿菌、嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、金葡菌、鏈球菌等都有殺菌效用。恩諾沙星可作為動(dòng)物用藥品，在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)，有良好之組織分布性，屬于廣效性抑菌劑，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌及霉?jié){體具有抑菌作用。它作為一種常用獸藥在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛使用。但因其具有一定的毒性，在動(dòng)物性食品中的殘留對(duì)食品衛(wèi)生和公共健康產(chǎn)生威脅。檢測(cè)恩諾沙星殘留的方法主要有儀器分析法和免疫學(xué)方法?；瘜W(xué)分析方法因需要昂貴的儀器設(shè)備、對(duì)樣品前處理要求高，且需要配備專門操作人員等，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控檢測(cè)。免疫學(xué)方法，目前主要是Elisa(酶聯(lián)免疫吸附)方法，但該方法的核心試劑-單克隆抗體，因其制備和篩選過(guò)程繁瑣，并對(duì)操作技術(shù)要求很高，故其廣泛運(yùn)用受到了很大限制。綜上，本發(fā)明人提出了運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)制備抗恩諾沙星的scFv重組抗體，并以此建立檢測(cè)恩諾沙星殘留的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)恩諾沙星的scFv抗體及編碼該抗體的基因序列及氨基酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供上述scFv抗體及其編碼基因在檢測(cè)恩諾沙星中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明人運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)，將小鼠抗體的重鏈、輕鏈可變區(qū)基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，并借助了 15肽的連接肽段將重鏈和輕鏈片段拼接成一條單鏈抗體scFv，接著將該scFv片段插入噬菌體展示載體pCANTABk中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌中，經(jīng)過(guò)3輪固相淘篩和鑒定，獲得了抗恩諾沙星的scFv單鏈抗體。其包括重鏈和輕鏈，其中，重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示。前述的scFv抗體，重鏈和輕鏈之間的連接肽段為(GlyJer) 3。本發(fā)明還提供編碼上述scFv抗體的基因，其中，編碼scFv抗體重鏈的基因具有 SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，編碼scFv抗體輕鏈的基因具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有編碼上述SCFv抗體的基因的載體。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細(xì)胞。
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本發(fā)明進(jìn)一步提供上述scFv抗體、編碼該抗體的基因、含有所述基因的載體或含有該載體的宿主細(xì)胞在檢測(cè)恩諾沙星中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供上述scFv抗體的制備方法，其是將編碼上述scFv抗體的基因構(gòu)建至表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后進(jìn)行蛋白的表達(dá)及分離純化。其中，所述表達(dá)載體為 pCANTAB5e。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果本發(fā)明檢測(cè)恩諾沙星的scFv抗體，主要采用競(jìng)爭(zhēng)性Elisa方法定性或定量檢測(cè)樣品中恩諾沙星的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；采用高特異性的恩諾沙星scFv抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測(cè)。能簡(jiǎn)便、高效地運(yùn)用本發(fā)明獲得的能分泌表達(dá)抗恩諾沙星重組抗體的重組菌株制備特異性的抗恩諾沙星scFv重組抗體。


圖IA和圖IB :scFv-pCANTAB5e重組質(zhì)粒sfil和NotI雙酶切電泳圖，M :DL2000 核酸分子量Marker，1 20 :scFv-pCANTAB5e酶切產(chǎn)物。圖2 為30個(gè)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生可溶性抗體scFv-ELISA檢測(cè)結(jié)果。圖3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖，1 陰性對(duì)照，2 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)胞周間質(zhì)，3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)上清液，4 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)全細(xì)胞提取物。圖4 恩諾沙星誘導(dǎo)表達(dá)上清可溶性重組抗體IC5tl實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的試劑盒材料均為市售商品。實(shí)施例1免疫原及檢測(cè)原的偶聯(lián)制備1、材料牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺(EDC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、恩諾沙星(ENRO)標(biāo)準(zhǔn)品、透析膜、透析膜處理液、磁力攪拌儀、紫外分光光度儀。2、方法采用混合酸酐法，將恩諾沙星與蛋白大分子(BSA、OVA)進(jìn)行偶聯(lián)，制備免疫原和包被原。2. 1免疫原及包被原合成及純化A.中間產(chǎn)物制備a.取20mg藥物置于燒杯中，加入^iil DMF，若溶解不充分，可在超聲波中助溶；b.充分溶解后，加入25mg EDC和20mg NHS,磁力攪拌反應(yīng)；c.將以上燒杯用錫箔紙包裹好，室溫磁力攪拌反應(yīng)M小時(shí)，此液為A液。B.合成及初步純化a.取 50mg BSA (或 OVA)溶于 6ml PBS (0. 01M, ρΗ7· 4)中，充分溶解，此液為 B 液；
b.在磁力攪拌下，將A液逐滴滴入B液中；c.用錫箔紙將燒杯包裹，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜；d.待以上反應(yīng)完成，將過(guò)夜反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至處理好的透析袋中，于4°C冰箱中，用 PBS透析3天。透析中，前3次，每隔2小時(shí)換液，之后每8-12小時(shí)換液；e.透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液以4000rpm離心30min，取上清，_20°C凍存；f.取透析液在紫外分光光度儀下，檢測(cè)偶聯(lián)效果及偶聯(lián)物濃度測(cè)定表明 ENRO-BSA, ENRO-OVA偶聯(lián)物制備成功。實(shí)施例2小鼠免疫1、材料Balb/c小鼠(雄性、6周齡)、弗氏完全佐劑(sigma公司)、弗氏不完全佐劑(sigma 公司)、96孔酶標(biāo)板、免疫原ENR0-BSA、包被原ENRO-OVA、包被緩沖液(Na2CO3緩沖液0. 05N, ρΗ9· 6)、封閉液(2%脫脂乳PBS)、洗滌緩沖液(PBS、0. 1% Tween20 PBST)、終止液、鼠源抗恩諾沙星單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體(sigma公司)、TMB顯色液(sigma公司)。2、方法2.1小鼠免疫a.取100 μ g免疫原ENRO-BSA加入等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑；b.首免取8只6周齡Balb/c小鼠，采用背部多點(diǎn)注射免疫，0. 2ml/只，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組；c. 二免與三免免疫方法取100 μ g免疫原與等量弗氏不完全佐劑制成乳化劑， 背部多點(diǎn)免疫小鼠；每次免疫間隔15天。d.三免15天后，處死小鼠，摘取脾臟，_70°C凍存。眶下竇取血，離心取血清。2. 2ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)a.將包被原 ENRO-OVA 用包被緩沖液，按照 0. 5mg/l、0. 4mg/l,0. 3mg/l,0. 2mg/l, 0. lmg/1濃度梯度，200 μ 1/孔，包被酶標(biāo)板，4°C包被過(guò)夜；b.洗滌棄包被液，用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；c.封閉向每孔加滿封閉液，于37 °C封閉1. 5小時(shí)；d.洗滌棄封閉液，用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；e.加血清抗體將小鼠血清抗體，用PBS按照1 IOOU 200,1 400,1 800、 1 1600、1 3200、1 6400、1 12800、1 25600、1 51200 進(jìn)行梯度稀釋后，加入封閉好的酶標(biāo)孔中，200 μ 1/孔，37°C孵育反應(yīng)2小時(shí)；f.洗滌棄血清抗體液，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；g.加酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體用PBS做1 10000稀釋，200 μ 1/孔， 37 °C孵育反應(yīng)1小時(shí)；h.洗滌棄酶標(biāo)抗體液，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；i.顯色加入200 μ 1/孔TMB顯色液，37°C孵育顯色45min左右；j.終止用200 μ 1/孔終止液，終止顯色，在450nm處讀值。3、結(jié)果 通過(guò)間接ELISA檢測(cè)，包被原最佳濃度0. 2mg/ml。恩諾沙星免疫組的5只小鼠(1、 2、6、7、8號(hào))血清抗體效價(jià)達(dá)到1 1觀00以上，可滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。
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實(shí)施例3免疫小鼠脾細(xì)胞RNA的提取及通過(guò)RT-PCR獲得cDNA1、材料免疫小鼠脾臟、細(xì)胞篩、DEPC處理的滅菌PBS、DEPC處理去離子水、總RNA提取試劑盒RNA iso Plus (Takara公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)。2、方法2. 1脾細(xì)胞總RNA的提取采用總RNA提取試劑盒RNA iso Plus,參照說(shuō)明書進(jìn)行。待RNA完全溶解后，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定獲得RNA的質(zhì)與量。將RNA凍存于-70°C。2. 2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA從-70°C低溫冰箱中取出獲得的小鼠脾臟RNA，在低溫環(huán)境下進(jìn)行操作。采用商品化總RNA提取試劑盒(Takara)，參照說(shuō)明書進(jìn)行。擴(kuò)增獲得cDNA第一鏈，-70°C保存。3、結(jié)果根據(jù)免疫小鼠血清抗體效價(jià)，選取了效價(jià)高的小鼠脾臟，通過(guò)提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，共制得恩諾沙星免疫組小鼠(共5只1、2、6、7、8號(hào))脾細(xì)胞cDNA文庫(kù)，cDNA濃度均達(dá)到 500ng/y L·實(shí)施例4scFv單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建1、材料免疫小鼠cDNA、重組噬菌體抗體擴(kuò)增系統(tǒng)(Recombinant PhageAntibody System) (27-9400-01)包括重鏈引物對(duì)、輕鏈引物混合物和linker引物混合物、RS引物混合物 (Pharmacia 公司)、long amp TaqDNA聚合酶(NEB 公司)、瓊脂糖凝膠、DNA ladder (DL2000、 lkb) (TaKara公司)、凝膠回收試劑盒(TaKara公司)、質(zhì)粒提取試劑盒(TaKara公司)、T4 DNA連接試劑盒(NEB公司)、限制性內(nèi)切酶(sfiI、NotI) (NEB公司)、pMD18_T simple載體系統(tǒng)(TaKara公司)、DH5 α工程菌、TGl宿主菌、pCANTAB5e噬菌體載體、0. IN CaCl2、酵母提取物、Tryptone、氨芐青霉素、卡那霉素。2、方法2. IVH 禾口 VL 基因 PCR 擴(kuò)增A.從超低溫冰箱取出cDNA，在低溫環(huán)境下構(gòu)建VH基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
；xPCR緩沖液20 μLIOmM dNTP (each)6 pLcDNA (約 200ng )5 μ ν重鏈引物對(duì)4 μ Longamp Taq4 μL雙蒸水補(bǔ)足100 μL 將以上反應(yīng)體系除longamp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增
950C 5min 熱啟動(dòng)，加入 Longamp Taq 后94°C lmin，55°C 2min，65°C 2min ；；35 個(gè)循環(huán)后，65°C 10min，4°C 保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(340bp)的目的條帶。B.從超低溫冰箱取出cDNA，在低溫環(huán)境下構(gòu)建VL基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)體系如本節(jié)A所列，加入輕鏈引物混合物2 μ L，用雙蒸水補(bǔ)足100 μ L反應(yīng)體系。將以上反應(yīng)體系除long amp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，擴(kuò)增參數(shù)如本節(jié)A所列。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(32^p)的目的條帶。C. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化回收使用膠純化試劑盒(Takara公司)回收，參照說(shuō)明書進(jìn)行。將純化回收獲得的VH和VL基因片段，在微量紫外分光光度計(jì)上測(cè)定片段的量。2. 2 SOE-PCR 拼接 VH-Linker-VL 基因采取“VH-Linker-VL”形式將VH基因、Linker及VL基因進(jìn)行拼接。采用二步法 SOR-PCR法進(jìn)行。取以上純化獲得的VH和VL基因片段，在低溫環(huán)境下構(gòu)建scFv基因拼接PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系
5xPCR緩沖液 IOmM dNTP (每種)
VH基因片段 VL基因片段 Linker引物混合物 Longamp Taq
雙蒸水 將以上反應(yīng)體系加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增 940C Imin，63 °C 4min，7 個(gè)循環(huán)。
10 μL 5 μ ν 約 50 ng 約 50 ng 4 μL 2 pL 補(bǔ)足50 μL
2. 3引入sfil、NotI酶切位點(diǎn)
Α.以上反應(yīng)結(jié)束，立即取出反應(yīng)體系，迅速加入預(yù)先配制好的以下反應(yīng)體系
5xPCR緩沖液
IOmM dNTP (每種)
RS引物混合物 Long amp Taq
雙蒸水
10 μL
2 pL 4 μ 2 pL 32 pL
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將以上反應(yīng)體系迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增940C lmin，55°C 2min，65°C 2min，30 個(gè)循環(huán)后，65°C 10min，4°C保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(750bp)的目的條帶。B. scFv拼接產(chǎn)物切膠純化回收使用凝膠純化試劑盒Oiiagen)回收，參照說(shuō)明書進(jìn)行。將純化回收獲得的scFv基因片段，在微量紫外分光光度計(jì)上測(cè)定片段的量。C. scFv 基因連接 pCANTAB5e使用商品化T4 DNA連接酶(ftOmega)，將經(jīng)sf Π和NotI酶切處理的scFv片段與 pCANTABk載體連接。操作方法參照說(shuō)明書進(jìn)行。取適量pCANTABk載體和scFv基因片段，在低溫環(huán)境下構(gòu)建連接反應(yīng)體系
IOx連接酶緩沖液
T4 DNA連接酶IpL
scFv 片段MpL
pCANTAB5eN μ
雙蒸水補(bǔ)足20 pL酶切體系將連接體系置4°C連接過(guò)夜。scFv片段(S+N)與pCANTA肪e (S+N)使用量，按照如下公式進(jìn)行
載體質(zhì)量(ng) χ插入片段大小(kb) -χ插入載體摩爾比=插入片段量ngD.電轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)細(xì)胞制備a.取新鮮培養(yǎng)獲得的宿主菌TGl (OD600 = 0. 72-0. 76)，置于冰水混合物中驟冷；b.將細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4°C，2000 Xg離心lOmin，收集菌體；C.用預(yù)冷的雙蒸水輕輕重懸菌體沉淀，先加入少量雙蒸水重懸菌體，再加滿雙蒸水，4°C，2000Xg，離心 lOmin，棄上清；d.用10%甘油重復(fù)以上c步驟兩次，2400 X g，離心lOmin，最后一次倒盡上清后， 用殘存管底的甘油懸浮細(xì)胞，分裝離心管，100 μ L/管；e.將離心管放入液氮中速凍，-70°C低溫冰箱保存。E.電轉(zhuǎn)化a.將電擊杯(0. 2cm間隙)置于冰上預(yù)冷，取出_70°C凍存的感受態(tài)細(xì)胞，于冰水混合物上融解；b.取30μ L感受態(tài)細(xì)胞，向其中加入2μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻后，置于冰上90秒；c.將混合液加入預(yù)冷電擊杯的間隙中，擦干杯體，將電擊杯置于電轉(zhuǎn)化儀中；d.設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)15kv/cm，5ms，電轉(zhuǎn)；e.取出電擊杯，立即輕柔加入Iml預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，輕輕混勻后，吸出轉(zhuǎn)化液， 37°C，150rpm，培養(yǎng) 1. 5 小時(shí)。
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2. 4 建庫(kù)A.取上步轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)的菌液IOOyL,用2XYT培養(yǎng)液做梯度倍比稀釋，涂布 SOB-AG平板，30°C培養(yǎng)過(guò)夜。計(jì)數(shù)平板上的單菌落數(shù)，推算庫(kù)容。剩余的轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)的菌液，加入80%終濃度滅菌甘油，-70°C凍存，此即為初級(jí)抗體庫(kù)。B.隨機(jī)挑取SOB-AG平板上，長(zhǎng)出的單克隆10個(gè)，提取質(zhì)粒DNA，用sfil和NotI 雙酶切，初步鑒定陽(yáng)性克隆。質(zhì)粒提取及酶切反應(yīng)操作和以上步驟相同。對(duì)酶切陽(yáng)性的重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列測(cè)定和分析。3、結(jié)果以恩諾沙星免疫組小鼠(共8只)脾細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，通過(guò)初步擴(kuò)增，獲得了各免疫小鼠抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因VH、VL片段，電泳顯示條帶大小為340bp和32^p， 符合預(yù)期大小。將VH、VL片段切膠純化回收，與linker進(jìn)行拼接，獲得全長(zhǎng)750bp的scFv電泳片段。切膠純化回收scFv片段，與pMD18-T simple載體做T-A克隆，插入載體構(gòu)建 scFv-pMD18-T重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化0 α感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落，過(guò)夜培養(yǎng)后，提取重組菌質(zhì)粒，用sfil和NotI雙酶切初步鑒定陽(yáng)性克隆，電泳顯示正確連接率達(dá)到100%。將亞克隆板上所有菌落洗下，培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，sfil和NotI雙酶切獲得scFv 片段，與用同樣雙酶切處理的pCANTABk噬菌粒載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后，涂布SOBAG平板。隨機(jī)挑取20個(gè)單菌落，過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，sfiI和NotI雙酶切鑒定scFv與pCANTABk 連接情況，結(jié)果有18個(gè)酶切陽(yáng)性，分別切出約4. 5kb大小的噬粒和約750bp的scFv插入片段，說(shuō)明scFv片段成功插入pCANTAB5fe噬粒載體。計(jì)算庫(kù)容均達(dá)到1. 3X 107。20個(gè)單菌落中有18個(gè)均能切出目的條帶和載體片段(圖IA和圖1B)，重組率達(dá)到90%。通過(guò)以上操作，共制備了恩諾沙星免疫組小鼠各5個(gè)初級(jí)抗體庫(kù)，各抗體庫(kù)庫(kù)容如表1所示表1構(gòu)建鼠源抗恩諾沙星單鏈抗體初級(jí)抗體庫(kù)情況
初級(jí)抗體庫(kù)重組率庫(kù)容ENR0-195%2. 5 X IO5ENR0-285%1. 2 X IO8ENR0-670%2. IXlO7ENR0-785%1. 6 X IO6ENR0-880%1. 3 X IO6實(shí)施例5淘篩1、材料
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酶標(biāo)板、包被原ENRO-OVA、包被緩沖液(PBS緩沖液pH7. 2和Na2CO3緩沖液0. 05N, ρΗ9· 6)、免疫管、封閉液(2%脫脂乳PBS)、洗滌緩沖液(PBS、0. l%Tween20 PBST)、終止液、 PEG8000ZNacUTG1 宿主菌、洗脫液(0. IN HC1、0. 2N 甘氨酸-Hcl ρΗ2· 5、0· IN TEA)、SOBAG 平板(SOB平板含有氨芐青霉素和葡萄糖)、2 X YT-AG、2 X YT-KG、2 X YT-G、2 X YT-AK^M13K07,鼠源恩諾沙星單克隆抗體、山羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體(sigma公司)、TMB顯色液(sigma公司)。2、方法2.1包被淘篩管a.包被選用含200 μ g/ml_包被原的Na2CO3緩沖液(0. 05N, ρΗ9· 6)作為包被原的包被緩沖液，包被酶標(biāo)板200 μ 1/孔，包被條件分別為室溫包被過(guò)夜。用PBS洗管3次，拍干；(注對(duì)洗管的定義為加入洗滌液，后將洗滌液倒出即可， 以下適用此)c.用封閉液(2%脫脂乳PBS，MPBS)封閉免疫管，37°C封閉2小時(shí);d.傾去封閉液，用PBS洗3次，拍干。2. 2淘篩前準(zhǔn)備a.取初級(jí)抗體庫(kù)一支(Iml)，加入到250ml 2 X YT-G培養(yǎng)基中，37°C，250rpm，1小時(shí)；b.取培養(yǎng)液，測(cè)定細(xì)菌濃度，加入100 μ g/ml AMP和moi = 20 1的M13Ktl7噬菌體，37 °C水浴輕搖30分鐘，再搖床37°C上振蕩250rpm，培養(yǎng)30分鐘；c.此時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出適量的培養(yǎng)液做梯度稀釋，分別在2X YT-AG如2X YT-KG 平板上鋪板，以確定感染的有效性；d. IOOOXg離心10分鐘，小心取上清；e.用2X體積(500ml)的2XYT-AK懸浮細(xì)菌沉淀，37°C，250rpm，培養(yǎng)過(guò)夜；f. IOOOOrpm離心20min，取上清至另一新管中，準(zhǔn)備進(jìn)行淘篩。2. 3PEG/NaCl 沉析噬菌體a.按1/5體積(約100ml)的量加入PEG/Nacl，4°C冰浴上進(jìn)行噬菌體沉析，不超過(guò)1小時(shí)；b. 4000rpm離心20分鐘，4°C，棄上清，盡量除盡管壁的殘液；c.用起始培養(yǎng)液1/50體積(約5ml)的PBS或2XYT懸浮噬菌體沉淀，再次 IOOOOrpm離心15分鐘，取上清備用；d.此時(shí)，取100 μ 1制備獲得的噬菌體上清，用2XYT培養(yǎng)基做梯度倍比稀釋，取稀釋液100 μ 1加入至新鮮培養(yǎng)的TG1宿主菌(OD6tltl = 0. 5)，37°C輕搖孵育20min，涂布SOBAG 平板，30°C培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算輸入淘篩步驟的噬菌體量。此時(shí)的上清，應(yīng)立即進(jìn)行淘篩，因有些噬菌體抗體穩(wěn)定性不是很好。2. 4 淘篩a.提前一天完成2. 1中包被工作；b.將包被好的淘篩小管用PBS洗3次，拍干；c.向封閉好的免疫管加入處理過(guò)的噬菌體上清混合液，2ml/管，輕搖溫育30min 后，再靜置溫育1.5小時(shí)；d.棄免疫管內(nèi)噬菌體上清，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干；
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e.洗脫條件優(yōu)化分別采用如下4種洗脫條件1.加入宿主菌TG1 (OD600 = 0 . 5)，2ml/管，37 °C， 150rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；2.加入0. IN三乙胺(TEA)，^il/管，37°C輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)洗脫6min，后立即加入等體積Tris-Hcl pH7. 4緩沖液中和洗脫液，后加入宿主菌TG1 (OD600 = 0. 5) 37°C， 150rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；3.加入0. 2N甘氨酸-HCl pH2. 5，^il/管，37 °C輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)洗脫 6min,后立即加入等體積Tris-HCl pH7. 4緩沖液中和洗脫液，后加入宿主菌TG1 (OD600 = 0. 5)37°C，150rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；4.加入0. IN HC1，^il/管，37°C輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)洗脫6min，后立即加入等體積Tris-HCl pH7. 4緩沖液中和洗脫液，后加入宿主菌TG1 (OD600 = 0. 5) 37°C， 150rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；此時(shí)，完成了第一輪淘篩，獲得了一級(jí)抗體庫(kù)；f.取振蕩培養(yǎng)的菌液，用2XYT培養(yǎng)基做梯度倍比稀釋，取稀釋液100 μ 1涂布 SOBAG平板，30°C培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算輸出淘篩步驟的噬菌體量；g.向一級(jí)庫(kù)中，加入終濃度為100 μ g/ml amp和2 %葡萄糖，同時(shí)加入 4 X IO10M13K07噬菌體，靜置溫育30min后，再250rpm振蕩培養(yǎng)30min ； 1000 Xg離心IOmin, 去上清，用IOOml 2\丫1^\1(輕懸細(xì)胞，371，250印111，培養(yǎng)過(guò)夜；h.以下步驟從以上2. 步驟，進(jìn)行循環(huán)淘篩，開始下一輪淘篩；i.最終經(jīng)過(guò)3輪淘篩，取獲得的菌液，用2XYT培養(yǎng)基做梯度倍比稀釋，取稀釋液 100 μ 1涂布SOBAG平板，30°C培養(yǎng)過(guò)夜。剩余菌液按照800 μ 1以上洗脫菌液+200 μ 1 (含 80%滅菌甘油的2ΧΥΤ，混勻后，-70°C凍存)，標(biāo)記為三級(jí)抗體庫(kù)。3、結(jié)果通過(guò)平行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，最終確定了使用新鮮制備的宿主菌TG1(C)D6cici = O. 5)作為洗脫液，淘篩輸出的重組抗體數(shù)量明顯高于其他3種洗脫方法。初步選擇了 ENR0-2初級(jí)抗體庫(kù)，將抗原包被免疫管進(jìn)行固相淘篩，經(jīng)過(guò)三輪淘篩富集，獲得重組抗體三級(jí)庫(kù)。通過(guò)淘篩，與抗原有特異性結(jié)合的重組抗體，得到了有效的選擇和富集(表2)。表2ENR0-2重組抗體庫(kù)各輪淘篩富集情況
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)恩諾沙星的SCFv抗體，其包括重鏈和輕鏈，其特征在于，重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，重鏈和輕鏈之間由連接肽段連接。
2.如權(quán)利要求1所述的scFv抗體，其特征在于，重鏈和輕鏈之間的連接肽段為 (Gly4Ser)30
3.編碼權(quán)利要求1或2所述scFv抗體的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，編碼scFv抗體重鏈的基因具有SEQID No. 3 所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，編碼scFv抗體輕鏈的基因具有SEQID No. 4 所示的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述基因的載體。
7.含有6所述載體的宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1或2所述的scFv抗體、權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的基因、權(quán)利要求6所述的載體或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞在檢測(cè)恩諾沙星中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述scFv抗體的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建至表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后進(jìn)行蛋白的表達(dá)及分離純化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為pCANTABk。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)恩諾沙星的scFv抗體，其包括重鏈和輕鏈，重鏈和輕鏈之間由柔性連接肽(Gly4Ser)3連接。重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ ID No.1和2所示。本發(fā)明還提供編碼上述scFv抗體的基因。本發(fā)明檢測(cè)恩諾沙星的scFv抗體，主要采用競(jìng)爭(zhēng)性Elisa方法定性或定量檢測(cè)樣品中恩諾沙星的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；初次建庫(kù)后，該種scFv抗體的制備便很方便，簡(jiǎn)單。采用高特異性的抗恩諾沙星scFv抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性好、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102206279SQ201110074358
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者侯曉林, 劉文娟, 趙揚(yáng), 鄭志明, 金社勝 申請(qǐng)人:商務(wù)部流通產(chǎn)業(yè)促進(jìn)中心