專(zhuān)利名稱(chēng)：高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高效表達(dá)中溫α -淀粉酶的菌株,屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
α -淀粉酶(α -amylase)為糖苷水解酶類(lèi)(glycosylhydrases)的第13家族，屬 于α -葡萄糖苷水解酶(α -Glycosylhydrases, EC3. 2. 1), α -淀粉酶又稱(chēng)為液化淀粉酶， 其系統(tǒng)名稱(chēng)為α -1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α -1,4-glucan-4-glucanohydrolaseE. C. 3. 2. 1. 1)，常用名淀粉酶，又名α-1，4糊精酶。α -淀粉酶是一種內(nèi)切酶，能水解淀 粉分子中的α 4糖苷鍵,將其任意切成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精和少量的相對(duì)低分子質(zhì)量 糖類(lèi),直鏈淀粉和支鏈淀粉均以無(wú)規(guī)則的形式進(jìn)行分解,從而使淀粉糊的粘度迅速下降，即 起“液化”作用，故《 -淀粉酶又稱(chēng)為液化淀粉酶。α -淀粉酶是最重要的一類(lèi)酶，也是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)并且迄今為止用途最廣， 產(chǎn)量最大的酶制劑品種。α -淀粉酶作為工業(yè)酶制劑的重要組成部分，占酶制劑市場(chǎng)約 25%的份額。α-淀粉酶已應(yīng)用到很多工業(yè)中如食品，發(fā)酵，紡織，造紙業(yè)，制藥業(yè)和化 學(xué)藥品工業(yè)等，還擴(kuò)展到其他領(lǐng)域，如臨床，醫(yī)學(xué)，分析化學(xué)等。α -淀粉酶廣泛存在于 包括人、動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌等的各種生物中，從1956年首次報(bào)道分離α -淀粉酶開(kāi) 始，目前已經(jīng)分離并鑒定的α-淀粉酶超過(guò)120種，其中微生物來(lái)源的占多數(shù)。微生物 中會(huì)巨產(chǎn)生 0_淀粉晦的屬有:Bacillus, Thermomonospor, Acinetobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus等。目前在工業(yè)上大量使用的α -淀粉酶主要來(lái)源于枯草芽 抱桿菌(Bacillus subtilis)，地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢桿 菌(Baci 1 Iusamylo 1 iquefaciens)，黑曲霉(Aspergi 1 Ius niger)禾口米曲霉(Aspergi 1 Ius oryzae)。長(zhǎng)期以來(lái)用于工業(yè)生產(chǎn)α -淀粉酶的菌株，都是自然突變或人工誘變的高產(chǎn)菌 株。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,人們開(kāi)始用基因工程的方法研究如何提高酶的產(chǎn)量，給選育高產(chǎn) α-淀粉酶菌株開(kāi)創(chuàng)了新途徑。因此,采用基因工程技術(shù)構(gòu)建α-淀粉酶高產(chǎn)菌株已成為基 因工程研究中的重要課題之一。自八十年代以來(lái)，國(guó)外α-淀粉酶基因工程菌的研究進(jìn)展迅速。雖然我國(guó)酶制劑 工業(yè)也在蓬勃發(fā)展，品種和產(chǎn)量也不斷增加，但是同國(guó)外酶制劑行業(yè)比，尚有一定的差距。中溫α -淀粉酶是一類(lèi)最適反應(yīng)溫度處于50-70攝氏度之間的α -淀粉酶。這類(lèi) 淀粉酶的最適反應(yīng)溫度較高，所以其適用范圍非常廣。但是現(xiàn)有表達(dá)中溫淀粉酶的菌 株在發(fā)酵時(shí)的最大酶活都難以令人滿(mǎn)意，亟需研發(fā)出發(fā)酵時(shí)最大酶活很高(即高效表達(dá)) 的表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供高效表達(dá)中溫 淀粉酶的
為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明技術(shù)方案如下一種高效表達(dá)中溫α -淀粉酶的菌株，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB800/pP43XAMYICCTCC NO :M 2010328,具有中溫 α -淀粉酶基因SEQ ID No :1。進(jìn)一步地,含有重組質(zhì)粒PP43XAMY1 ；所述中溫α -淀粉酶基因SEQ ID No :1位于 重組質(zhì)粒PP43XAMY1上；所述重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1還含有amp抗性基因、km抗性基因、P43 啟動(dòng)子序列、枯草芽孢桿菌終止子序列；所述中溫α-淀粉酶基因=SEQ ID No :1位于重組 質(zhì)粒PP43XAMY1的P43啟動(dòng)子序列和枯草芽孢桿菌終止子序列之間。所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubti！is)WB800/pP43XAMYlCCTCCN() :M 2010328， 已于2010年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC,地址為湖北省武漢 市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心)，保藏號(hào)為CCTCC NO :M 2010328。一種高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB800/pUBC19-AMY2CCTCC NO :M 2010329,具有中溫 α -淀粉酶基因:SEQ ID No :2。進(jìn)一步地,含有重組質(zhì)粒pUBC19-AMY2 ；所述中溫α -淀粉酶基因SEQ ID No 2 位于重組質(zhì)粒pUBC19-AMY2上；所述重組質(zhì)粒pUBC19_AMY2還含有amp抗性基因、km抗性 基因、枯草芽孢桿菌終止子序列；所述中溫α-淀粉酶基因SEQ ID No :2位于重組質(zhì)粒 PUBC19-AMY2的km抗性基因和枯草芽孢桿菌終止子序列之間。所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WB800/pUBC19_AMY2CCTCC NO :M 2010329,已于2010年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，地址為湖 北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心)，保藏號(hào)為CCTCC NO :M 2010329。一種采用前述高效表達(dá)中溫α -淀粉酶的菌株獲得中溫α -淀粉酶的方法,其特 征是，包括以下步驟(1)活化所述菌株；(2)按體積比1-15%的接菌量將所述菌株接入第一培養(yǎng)液，培養(yǎng)至OD6cici達(dá)到 1. 0-3. 0,即得種子液；(3)按體積比1-15%的接菌量將上一步得到的種子液接入含第二培養(yǎng)液的搖瓶 中，置搖床上發(fā)酵，獲得中溫α -淀粉酶。進(jìn)一步地,所述第一培養(yǎng)液為L(zhǎng)B、SOB、TB、2XYT、YPD培養(yǎng)液之一；所述LB培養(yǎng) 液的重量比組成為().5 1. 5%的蛋白胨、0. 5-1. 5%的氯化鈉、0. 1-1. 2%的酵母粉、其余為 水，PH值為6. 0-8. 0 ；所述SOB培養(yǎng)液的重量比組成為1-3%的蛋白胨、0. 1% -2. 0%的酵 母提取物、0. 01-0. 50%的氯化鈉、0. 01-0. 50%的氯化鉀、其余為水；所述TB培養(yǎng)液的重量 比組成為0.5% -3.0%的蛋白胨、1.5-3. 5%的酵母提取物、0. 1-2.0%的甘油、0. 1-1.5% 的磷酸二氫鉀、0. 5 3. 0%的磷酸氫二鉀、其余為水；所述2XYT培養(yǎng)液的重量比組成為 0. 5-3. 0%的蛋白胨、0. 5-3. 0%的酵母提取物、0. 01-0. 50%的氯化鈉、其余為水；所述YPD 培養(yǎng)液的重量比組成為1-3%的蛋白胨、1-3%的酵母提取物、1.5-4.0%的葡萄糖、其余為 進(jìn)一步地，所述第二培養(yǎng)液的重量比組成為2-8 %的淀粉、1 -5 %的蛋白胨、 0. 1-2.0%的十二水合磷酸氫二鈉、0. 01-0. 10%的七水合硫酸鎂、0. 01-0. 10%的氯化鈉、 更進(jìn)一步地，所述步驟(3)中，發(fā)酵溫度為36-38°C，發(fā)酵時(shí)間為60—120小時(shí)。)22] 本發(fā)明以八種蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌WB800為宿主,可避免菌株胞外分泌降 α -淀粉酶的蛋白酶，更有利于α -淀粉酶的表達(dá)；本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含有
i α -淀粉酶基因的重組質(zhì)粒，并在枯草芽孢桿菌WB800中實(shí)現(xiàn)
野生型解淀粉芽孢桿菌中 中溫α-淀粉酶的高效表達(dá)。
本發(fā)明菌株具有很高的產(chǎn)中 最大酶活是野生型解淀粉芽孢桿菌最
ι α -淀粉酶能: 酶活的2倍以」
相同條件下發(fā)酵，本發(fā)明菌株


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2重組質(zhì)粒pUBC19-AMY2的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例4的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果圖Α為最適溫度測(cè)定曲線(xiàn)[ 熱性測(cè)定曲線(xiàn)圖；C為最適ρΗ測(cè)定曲線(xiàn)圖；D為ρΗ穩(wěn)定性測(cè)定曲線(xiàn)圖。
；B為耐
具體實(shí)施例方式下面參照附丨 均為常規(guī)方法，，實(shí)施例1高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株
丨并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)-
-枯草芽孢桿菌(Bacillus
subt.i 1 is)WB800/pP43XAMYICCTCC NO :M 2010328 的構(gòu)建。1.重組質(zhì)粒pP43XAMYl (如圖1所示)的構(gòu)建。1. 1中溫α -淀粉酶基因片段的獲得。采用具有GENBANK ACCESSION Number J01542. 1基因的野生型解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyIoliquefaciens)。模板1 提取野生型解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的基因組 DNA,作為模板1 ；上游引物A:5' -AAACTGCAGATGATTCMAAACGAAAGCGGAC-3',下劃線(xiàn)部分為 Pst I 酶切位點(diǎn)；下游引物B : 5 ‘ -GCGCTCTAGATTATTTCTGAACATAAATGGAGACG-3 ‘,下劃線(xiàn)部分為 Xba I酶切位點(diǎn)。采用上述模板1、上游引物A和下游引物B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1545bp的 片段amyl，經(jīng)測(cè)序，該片段序列如SEQ ID No 1所示，與GENBANK ACCESSION Number J01542.1的5'端第250-1794位核苷酸序列100 %相同，包括野生型解淀粉芽孢桿菌 (Baci 1 Iusamyloliquefaciens)中溫α —淀粉酶信號(hào)肽基因和結(jié)構(gòu)基因。將該片段amyl 與質(zhì)粒pMD18-T(市售品，可從寶生物工程(大連)有限公司等處購(gòu)得)相連，構(gòu)建重 組質(zhì)粒PMD18-T-AMY1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜后抽提重組質(zhì)粒 pMD18-Τ-ΑΜΥ1。1. 2表達(dá)載體pP43X的構(gòu)建。(1)模板 2 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)pP43NMK 質(zhì)粒(見(jiàn) Zhang XZ, Cui ZL, Hong Q, Li SP. High-level expressionand secretion of methyl parathion hydrolase in Bacillussubtilis WB800. Appl &Environm Microbiol,2005，71(7)4101-4103 ；又見(jiàn) GenBank ACCESSION Number DQ264732. 1)；上游引物 C:5' -CGCGGATCCTGATAGGTGGTATGTTTTC-3 ‘，下劃線(xiàn)部分為 BamH I 酶 切位點(diǎn)；下游引物D :5 ‘ -CTGCAGGTGTACATTCCTCTCTTACC-3 ‘，下劃線(xiàn)部分為 ht I 酶切位
點(diǎn)ο采用上述模板2、....Ll游引物C和F游引物D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得300bp的片段I，包 括P43啟動(dòng)子序列和RBS序列。(2)采用前述片段I為模板、前述上游引物C、及下游引物E ;CGCAAGCTTAACCTTGA AGAATAGCATTCTTCAAGGTTTTGTCATCTAGACTGCAGGTGTACATTCCTC (下劃線(xiàn)部分分別為 Hindi 11， Xball, Pst I酶切位點(diǎn))，進(jìn)行重疊延伸PCR，獲得365bp的片段II，將片段II與質(zhì)粒 pMD18-T相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18 T-P43，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。37°C培養(yǎng)過(guò) 夜后抽提質(zhì)粒pMD18-Τ-P43。(3)用BamH I/Hindi 11分別雙酶切重組質(zhì)粒pMD18_T_P43和質(zhì)粒pP43NMK,獲得 PP43NMK雙酶切大片段III和片段II，再用T4DNA連接酶連接，獲得表達(dá)載體pP43X，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5 α (采用氯化鈣法)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜 后挑取板上的單菌落接種入含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后抽提表 達(dá)載體pP43X。1. 3重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1的構(gòu)建。用I^st I/Xba I分別雙酶切表達(dá)載體ρΡ4； 和重組質(zhì)粒pMD18 T-AMY1，獲得pP43X 雙酶切大片段IV和片段amyl,再用MDNA連接酶連接,獲得重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1,轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5 α (采用氯化鈣法),轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB平板,37 °C培養(yǎng)過(guò)夜后 挑取板—t的單菌落接種入含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后抽提重組 質(zhì)粒 PP43XAMY1。2.高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株——枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB800/pP43XAMYICCTCC NO :M 2010328 的構(gòu)建。宿主枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB800 (見(jiàn) Wu SC，YeungJC，Duan Y, Ye R, Szarka SJ, Habibi IiR, Wong SL. FunctionalProduction and Characterization of a Fibrin-SpecificSingle-Chain Antibody Fragment from Bacillus subtilis :Ef.fectsof Molecular Chaperones and a Wall-Bound Protease on AntibodvFragment Production. Appl&Environm Microbiol, 2002,68 (7) :3261-3269 ；或者可從美國(guó) ATCC 購(gòu)得，保藏號(hào)為 ATCC 6633)ο采用SP轉(zhuǎn)化法,用重組質(zhì)粒PP43XAMY1轉(zhuǎn)化上述宿主,步驟為(1)挑單菌落WB800至30ml LB培養(yǎng)基中，37°C, 220r/min培養(yǎng)過(guò)夜；(2)取0. 4ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至20ml SPI培養(yǎng)基[49 %的SP-A鹽溶液(0. 4 % (NH4)2S04, 2.8% K2IIPO4 · 31120，1. 2% KH2PO4,0. 2%檸檬酸三鈉 Ig)和 49 % 的 SP-B 鹽溶液 (0. 04% MgSO4 ·7Η20),加入1 %的50%葡萄糖溶液，1 %的100% CAYE(2%水解酪蛋白,10% 酵母提取物)](均為重量比)中，37°C，220r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期；(3)取2ml培養(yǎng)液至20ml SPII培養(yǎng)基(SPI中加入1 %的50mM Cacl2溶液，1 % 250mM Mgcl2 溶液(注單位 “ml” 表示 “mmol/L”，下同))中，37°C , lOOr/min 培養(yǎng) 90min ；
(4)分裝成0. 5ml每管，各加入20 μ 1重組質(zhì)粒(< 1 μ g),再于37°C, 100r/min 培養(yǎng)90分鐘;(5)每管 EP 加入 800 μ 1 LB 培養(yǎng)基，37"C，100r/min 培養(yǎng) 60 分鐘；(6)離心，3500r/min,棄上清,獲得剩余菌液。將剩余菌液涂布含(重量比)卡那霉素的篩選平板,篩選后,將陽(yáng)性菌落和 空宿主點(diǎn)種在含1 % (重量比)可溶淀粉的LB平板上，37Γ培養(yǎng)48小時(shí)后，噴灑碘液 (0. 0433M(注:單位“M”表示“mol/L”，下同))，放置顯色觀(guān)察。取淀粉酶圈大的菌株，提取其基因組作為模板,并采用前述上游引物A和下游引 物B,進(jìn)行PCR鑒定,擴(kuò)增得到1545bp的片段,表明該菌株為正確導(dǎo)入重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1 的陽(yáng)性菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) WB800/pP43XAMYl，該菌株已于 2010年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC,地址為湖北省武漢市武 昌珞珈丨1丨武漢大學(xué)保藏中心)，保藏號(hào)為CCTCC NO :M2010328。本實(shí)施例的高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) WB800/pP43XAMY ICCTCC NO :M 2010328，具有中溫 α-淀粉酶基因:SEQ ID No: 1，該基因位于本菌株所含的重組質(zhì)粒PP43XAMY1上；重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1還含有amp (氨芐 青霉素)抗性基因、km(卡那霉素)抗性基因、P43啟動(dòng)子序列、枯草芽孢桿菌終止子序列； 中溫α -淀粉酶基因SEQ ID No 1位于重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1的P43啟動(dòng)子序列和枯草芽 孢桿菌終止子序列之間。實(shí)施例2高效表達(dá)中溫α -淀粉酶的菌株——枯草芽孢桿菌(Baci 1 Ius subtilis)fB800/pUBC19-AMY2CCTCC NO :M 2010329 的構(gòu)建。1.重組質(zhì)粒pUBC 19-AMY2 (如圖2所示)的構(gòu)建。1. 1中溫α -淀粉酶基因片段的獲得。采用的野生型解淀粉芽孢桿菌(Bacillus timyloliquefaciens)與實(shí)施例1相同。模板1 :即實(shí)施例1的模板1 ；上游引物F 5 ^ -ATAGGATCCGACTGATGATTTGGCTGAAGAAGTG-3 ‘，下劃線(xiàn)部分為 BamH I酶切位點(diǎn)；下游引物G : 5 ‘ -GCGCTCTAGATTATTTCTGAACATAAATGGAGACG-3 ‘,下劃線(xiàn)部分為 Xba I酶切位點(diǎn)；采用上述模板1、上游引物F和下游引物G進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1748bp的 片段amy2，經(jīng)測(cè)序，該片段序列如SEQ ID No 2所示，與GENBANK ACCESSION Number J01542. 1的5 ‘端第47-1794位核苷酸序列99 %相同，包括野生型解淀粉芽孢桿菌 (Baci 1 Iusamylo！ iquefaciens)中溫α -淀粉酶啟動(dòng)子基因、信號(hào)肽基因、及結(jié)構(gòu)基因。將 該片段amy2與質(zhì)粒pMD18_T相連,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T_AMY2,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受 態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后抽提重組質(zhì)粒pMD18-T-AMY2。1. 2表達(dá)載體pP43X的構(gòu)建與實(shí)施例1相同。1. 3重組質(zhì)粒pUBC 19-AMY2的構(gòu)建。用BamH I/Xba I分別雙酶切表達(dá)載體pP43X和重組質(zhì)粒pMD18-T_AMY2,獲得 PP43X雙酶切大片段V和片段amy2,再用T4DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒pUBC19_AMY2，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5 α (采用氯化鈣法)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)
7過(guò)夜后挑取板上的單菌落接種入含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后抽 提重組質(zhì)粒pUBC19-AMY2。2.高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株——枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB800/pUBC19-AMY2CCTCC NO :M 2010329 的構(gòu)建。宿主與實(shí)施例1相同。采用SP轉(zhuǎn)化法，用重組質(zhì)粒PUBC19-AMY2轉(zhuǎn)化上述宿主，步驟與實(shí)施例1相同，并
獲得剩余菌液。將剩余菌液涂布含卡那霉素的篩選平板,篩選后，將陽(yáng)性菌落和空宿主點(diǎn)種在 含1 %可溶淀粉的LB平板上,37°C培養(yǎng)48小時(shí)后，噴灑碘液(0. 0433M),放置顯色觀(guān)察。取淀粉酶圈大的菌株，提取其基因組作為模板，并采用前述上游引物F和下 游引物G，進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增得到1748bp的片段，表明該菌株為正確導(dǎo)入重組質(zhì)粒 pUBC19-AMY2 的陽(yáng)性菌株,命名為枯草芽孢桿菌(Baci Ilus subtilis) WB800/pUBC19-AMY2, 該菌株已于2010年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC,地址為湖北 省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心)，保藏號(hào)為CCTCCNO :M 2010329。本實(shí)施例的高效表達(dá)中溫淀粉酶的菌株，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB800/pUBC19-AMY2CCTCC NO :M 2010329,具有中溫 α-淀粉酶基因SEQ ID No 2,該基因位于本菌株所含的重組質(zhì)粒pUBC19-AMY2上；重組質(zhì)粒pUBC19_AMY2還含有 amp(氨芐青霉素)抗性基因、km(卡那霉素)抗性基因、枯草芽孢桿菌終止子序列；中溫 α -淀粉酶基因SEQ ID No 2位于重組質(zhì)粒pUBC19 AMY2的Iim基因和枯草芽孢桿菌終止 子序列之間。實(shí)施例3獲得中溫α -淀粉酶的方法。采用實(shí)施例1或2的高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株獲得中溫α-淀粉酶的方法， 包括以下步驟(1)活化實(shí)施例1或2的菌株；(2)按體積比1-15% (優(yōu)選5% )的接菌量將前述菌株接入第一培養(yǎng)液,培養(yǎng)至 OD600達(dá)到1. 0-3. 0 (優(yōu)選1. 5-2. 0)，即得種子液；(3)按體積比1 15% (優(yōu)選5% )的接菌量將上一步得到的種子液接入含第二培 養(yǎng)液的搖瓶中，置搖床上發(fā)酵,獲得中溫α-淀粉酶。第一培養(yǎng)液為L(zhǎng)B、S0B、TB、2XYT、YPD培養(yǎng)液之一。LB培養(yǎng)液的重量比組成為0. 5-1. 5% (優(yōu)選1 % )的蛋白胨、0. 5-1. 5% (優(yōu)選 1%)的氯化鈉、0. 1-1.2% (優(yōu)選0.5%)的酵母粉、其余為水，pH值為6. 0-8.0(優(yōu)選7. 0)。SOB培養(yǎng)液的重量比組成為1-3% (優(yōu)選2% )的蛋白胨、0. 1% 2.0% (優(yōu)選 0.5%)的酵母提取物、0. 01-0. 50% (優(yōu)選0. 05% )的氯化鈉、0. 01-0. 50% (優(yōu)選0. 02% ) 的氯化鉀、其余為水。TB培養(yǎng)液的重量比組成為0. 5% -3. 0% (優(yōu)選1. 2% )的蛋白胨、1. 5-3. 5% (優(yōu) 選2. 4% )的酵母提取物、0. 1-2. 0% (優(yōu)選0.6% )的甘油、0. 1-1. 5% (優(yōu)選0. 2% )的磷 酸二氫鉀、0. 5-3. 0% (優(yōu)選1.3%)的磷酸氫二鉀、其余為水。2XYT培養(yǎng)液的重量比組成為0. 5-3. 0% (優(yōu)選1. 6%)的蛋白胨、0. 5-3. 0% (優(yōu) 選1.0% )的酵母提取物、0. 01-0. 50% (優(yōu)選0. 02% )的氯化鈉、其余為水。
YPD培養(yǎng)液的重量比組成為1-3% (優(yōu)選2. 2%)的蛋白胨、1-3% (優(yōu)選1.1%) 的酵母提取物、1.5-4.0% (優(yōu)選2. 2%)的葡萄糖、其余為水。第二培養(yǎng)液的重量比組成為:2 8% (優(yōu)選6% )的淀粉、1 5% (優(yōu)選3% )的蛋白 胨、0. 1-2. 0% (優(yōu)選0. 5% )的十二水合磷酸氫二鈉、0. 01-0. 10% (優(yōu)選0. 01% )的七水 合硫酸鎂、0. 01-0. 10% (優(yōu)選0.01% )的氯化鈉、其余為水，pH值為6. 0-8. 0 (優(yōu)選7. 0)。發(fā)酵溫度為36-380C (優(yōu)選37°C )，時(shí)間為60-120小時(shí)(優(yōu)選96小時(shí))。此外，采用實(shí)施例1、2所用的野生型解淀粉芽孢桿菌 (Baci 1 lusamylol iquefaciens)在相同條件下發(fā)酉孝。發(fā)酵的同時(shí)檢測(cè)中溫α-淀粉酶的酶活,檢測(cè)方法采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 法測(cè)定(QB/T1803-93)。酶活定義1ml液體酶，6(TC，pH = 6. 0，Ih液化Ig可溶性淀粉，即 為1個(gè)酶活力單位(U/ml)。結(jié)果表明，實(shí)施例1的菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB800/ PP43XAMYICCTCC NO =M 2010328最大酶活為848U/'ml,實(shí)施例2的菌株枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) WB800/pUBC19_AMY2CCTCC NO :M 2010329最大酶活為 1041U/ml，而野 生型解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)最大酶活為416U/ml。實(shí)施例1和2菌株的最大酶活均是野生型解淀粉芽孢桿菌最大酶活的2倍以上， 顯著提高了中溫α-淀粉酶的產(chǎn)量。 實(shí)施例4中溫α -淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。測(cè)定實(shí)施例3獲得的中溫α -淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)。取發(fā)酵實(shí)施例1、2菌株的終點(diǎn)發(fā)酵液，SOOOr/rain,離心5rain,取上清液作為用于 測(cè)定的粗酶液。(1)溫度對(duì)酶活力的影響①該酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定分別在不同的溫度C30°c,40°c，5(rc，6(rc，7(rc, 8090°C )下，p:H6. 0的緩沖液中，測(cè)定工程菌酶活,將最高酶活定為100%。②該酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定將重組酶液于分別置于50°c,6(rc,7(rc,8(rc恒溫水浴 中保溫 1. 5 小時(shí)，然后分別在 15min, 30min, 45min, 60min, 75min, 90min,吸取 1. 00ml ....丨二清 液立即置于冰水中冷卻，再于60 下測(cè)定其剩余酶活力。以相同溫度中未保溫的酶活力為 IOO0丄(2) pH對(duì)酶活力的影響①該酶最適反應(yīng)pH的測(cè)定用不同的pH緩沖液(pH = 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0)， 在60°C下測(cè)定重組酶液的活性，設(shè)定最高酶活100%。②該酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定用0. Imo!/ml的HCl和NaOH溶液共同調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液 至不同的PH值(pH = 4. 0,5. 0,6. 0,6. 5,7. 0,8. 0),在室溫下放置60min后，測(cè)定其剩余酶 活力。以相同PH值中未放置的酶活力為100%。上述測(cè)定結(jié)果如圖3A-D所示。(注發(fā)酵實(shí)施例1、2菌株獲得的中溫α -淀粉酶 的酶學(xué)性質(zhì)是相同的，因此上述測(cè)定結(jié)果均只給出了一幅曲線(xiàn)圖。)該結(jié)果表明，發(fā)酵實(shí)施例1、2菌株獲得的中溫α-淀粉酶的最適作用溫度為60°C, 最適反應(yīng)PH為6. 0 ；在pH5. 0-6. 5之間較穩(wěn)定，對(duì)pH較敏感，在70°C溫浴90min后仍有80% 以上的酶活，在80°C溫浴90min后保持20%以上的酶活，說(shuō)明該酶熱穩(wěn)定性很好。
除上述實(shí)施例外,本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)中溫(I-淀粉酶的菌株，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) WB800/pP43XAMY ICCTCC NO :M 2010328,具有中溫 α -淀粉酶基因SEQ ID No :1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株，其特征是，含有重組質(zhì)粒 ΡΡ43ΧΑΜΥ1 ；所述中溫α -淀粉酶基因:SEQID No 1位于重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株,其特征是,所述重組質(zhì)粒 ΡΡ43ΧΑΜΥ1還含有amp抗性基因、kii抗性基因、P43啟動(dòng)子序列、枯草芽孢桿菌終止子序列； 所述中溫α -淀粉酶基因SEQ ID No 1位于重組質(zhì)粒ρΡ43ΧΑΜΥ1的P43啟動(dòng)子序列和枯 草芽孢桿菌終止子序列之間。
4.一種高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) WB800/pUBC19-AMY2CCTCC NO :M 2010329,具有中溫 α -淀粉酶基因:SEQ ID No :2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株，其特征是，含有重組質(zhì)粒 PUBC19-ΑΜΥ2 ；所述中溫α -淀粉酶基因:SEQ ID No 2位于重組質(zhì)粒pUBC19-AMY2上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株，其特征是，所述重組質(zhì) 粒pUBC19-AMY2還含有amp抗性基因、Icm抗性基因、枯草芽孢桿菌終止子序列；所述中溫 α-淀粉酶基因SEQ IDNo :2位于重組質(zhì)粒pUBC19_AMM的fan抗性基因和枯草芽孢桿菌終 止子序列之間。
7.一種采用權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株獲得中溫 α -淀粉酶的方法,其特征是,包括以下步驟(1)活化所述菌株；(2)按體積比1-15%的接菌量將所述菌株接入第一培養(yǎng)液，培養(yǎng)至0D6。。達(dá)到1.(Κ3. 0， 即得種子液；(3)按體積比1-15%的接菌量將上--步得到的種子液接入含第二培養(yǎng)液的搖瓶中，置 搖床—丨:::發(fā)酵，獲得中溫α-淀粉酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的獲得中溫α-淀粉酶的方法，其特征是，所述第一培養(yǎng)液為 LB、SOB、TB、2XYT、YPD培養(yǎng)液之一；所述LB培養(yǎng)液的重量比組成為().5-1. 5%的蛋白 胨、0. 5-1. 5 %的氯化鈉、0. 1-1. 2 %的酵母粉、其余為水，pH值為6. 0-8. 0 ；所述SOB培養(yǎng) 液的重量比組成為1-3%的蛋白胨、0. 1% -2.0%的酵母提取物、0.01-0. 50%的氯化鈉、0.01-0. 50%的氯化鉀、其余為水；所述TB培養(yǎng)液的重量比組成為0. 5% -3. 0%的蛋白胨、1.5-3. 5%的酵母提取物、0. 1-2. 0%的甘油、0. 1-1. 5%的磷酸二氫鉀、0. 5-3. 0%的磷酸氫 二鉀、其余為水；所述2XYT培養(yǎng)液的重量比組成為0. 5-3. 0%的蛋白胨、0. 5-3. 0%的酵 母提取物、0. 01-0. 50%的氯化鈉、其余為水；所述YPD培養(yǎng)液的重量比組成為1-3%的蛋 白胨、1-3%的酵母提取物、1.5-4.0%的葡萄糖、其余為水。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的獲得中溫α-淀粉酶的方法，其特征是，所述第二培養(yǎng) 液的重量比組成為2-8%的淀粉、1-5%的蛋白胨、0. 1-2.0%的十二水合磷酸氫二鈉、 0. 01-0. 10%的七水合硫酸鎂、0. 01-0. 10%的氯化鈉、其余為水，pH值為6. 0-8. 0。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的獲得中溫淀粉酶的方法，其特征是，所述步驟C3)中，發(fā) 酵溫度為36-38°C,發(fā)酵時(shí)間為60-120小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及高效表達(dá)中溫α-淀粉酶的菌株，該菌株是將含中溫α-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中獲得的。本發(fā)明還涉及一種獲得中溫α-淀粉酶的方法。本發(fā)明菌株高產(chǎn)中溫α-淀粉酶，是極具生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的中溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌株。
文檔編號(hào)C12N9/28GK102134560SQ20111000635
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者戴君, 陳建華 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)