專利名稱：高純中溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶制劑行業(yè)，即一種高純中溫α -淀粉酶的生產(chǎn)方法。
背景技術：
發(fā)酵法生產(chǎn)中溫α -淀粉酶在我國生產(chǎn)時間較長，中溫α _淀粉酶是經(jīng)枯草芽孢 桿菌經(jīng)液體深層培養(yǎng)，提取工藝精制而成，能在較低溫度條件下隨機水解淀粉、可溶性糊精 及低聚糖中α "I. 4葡萄苷健，使得膠狀淀粉的粘度迅速降低，水解生成糊精及少量葡萄糖 和麥芽糖。該酶廣泛應用于紡織、制革、飼料、造紙、酒精、啤酒、白酒等發(fā)酵領域。但由于目 前的高純中溫α-淀粉酶生產(chǎn)工藝簡單、粗放，產(chǎn)品發(fā)酵活力低，質量低下，嚴重的制約了 本行業(yè)的發(fā)展，妨礙了該酶制劑隨著需求的大幅增長。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服目前中溫α-淀粉酶生產(chǎn)工藝簡單、粗放，產(chǎn)品發(fā)酵活力低，質量低下的 缺點，本發(fā)明通過采取精細的發(fā)酵工藝，使發(fā)酵活力提高近2倍，使發(fā)酵酶活達到1300u/ml 以上，優(yōu)化提取工藝，純度提高了 3倍，并且產(chǎn)品質量穩(wěn)定。這種高純中溫α -淀粉酶的生產(chǎn)方法，包括種子培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶和后處理提純各 階段，其特征在于，步驟如下一、材料準備，購買枯草芽孢桿菌的甘油管菌種，該菌株呈短桿狀、兩端鈍園、單獨 或成鏈狀，在淀粉培養(yǎng)基菌落園形，表面光滑濕潤、有粘性、產(chǎn)孢子較少；發(fā)酵培養(yǎng)基各成分重量比例如下豆餅粉3-5%、玉米漿1-2%、玉米淀粉 16-20 %、磷酸氫二鉀0. 2-0. 4 %、磷酸二氫鉀0. 1-0. 2 %、硫酸鎂0. 05-0. 15 %、硫酸錳 0. 01-0. 03%、消泡劑0. 2-0. 4%，其余為水；種子培養(yǎng)基各成分重量比例如下蛋白胨0. 5-1. 5%，牛肉膏0. 2-0. 4%，酵母膏 0. 1-0. 3%，葡萄糖 0. 05-0. 15%，氯化鈉 0. 05-0. 15%，其余為水；二、種子培養(yǎng)，開始時進行平皿培養(yǎng)，然后進行搖瓶培養(yǎng)，最后在種子罐中培養(yǎng)，種 子罐0. Impa滅菌20-40分鐘，培養(yǎng)條件:ΡΗ6· 3-7. 0，溫度31_35°C，25_30hr，轉速240轉/ 分，通風比1 0.2，種子生長進入對數(shù)期，鏡檢菌絲密集，大部分斷裂成兩聯(lián)菌，無雜菌，PH 上升至高峰向下回落0. 1時即可移入發(fā)酵罐；三、發(fā)酵產(chǎn)酶，工藝條件，發(fā)酵溫度為31-35 °C，PH為6. 6-6. 8，通風比 1 0. 4-0. 6 ；基礎料加補料工藝及脈沖進氨；流加通氨調節(jié)PH至菌絲生長代謝最佳值， 流加補料，在補料中加入含氮源的營養(yǎng)基，發(fā)酵罐轉速160轉/分，發(fā)酵過程中，當PH下降 至6. 5時開始通液氨，DE值下降至20，PH不再下降，有上升趨勢，開始流加補料，每小時 流加補料一次，將DE值控制在10 20之間，發(fā)酵至45-55小時，細胞空胞率達80%以上 時，PH值上升到7. 2，酶活力不再增長，鏡檢菌絲大部分死亡時，即可結束發(fā)酵，發(fā)酵酶可達 1250-1350u/ml，發(fā)酵結束轉入后處理提純；四、后處理提純，即發(fā)酵液一第一次絮凝處理一第二次絮凝處理一板框壓濾一超
3濾一成品加穩(wěn)定劑、防腐劑處理一二次升溫，一次升溫72-78°C、保溫時間30分鐘，二次升 溫62-68°C、保溫時間60分鐘，一成品。本發(fā)明采用連續(xù)流加補料、脈沖加液氨工藝發(fā)酵產(chǎn)酶，采用二次絮凝、二次升溫提 純后處理工藝，有效的解決產(chǎn)品收得率低、易沉淀及微生物指標不合格的問題，使產(chǎn)品質量 抽檢合格率100%，使發(fā)酵活力提高近2倍，發(fā)酵酶活達到1300u/ml以上，純度提高了 3倍， 并且產(chǎn)品質量穩(wěn)定。產(chǎn)品生化指標酶活:5000u/ml，PH值6. 5，比重1. 2g/ml，菌落總數(shù) < 1000個/ml，無大腸菌群。


圖1是本發(fā)明發(fā)酵工藝流程圖。圖2是本發(fā)明提取工藝(之一)流程圖。圖3是本發(fā)明提取工藝(之二)流程圖。
具體實施例方式現(xiàn)通過具體實施例結合圖1和圖2對本發(fā)明詳細說明如下一、材料準備，菌種，購買枯草芽孢桿菌；購自張家港市金源生物化工有限公司，地 址，江蘇省張家港市乘航老宅路18號，郵編215617，電話86-512-58670730。該菌株呈短桿 狀、兩端鈍園、單獨或成鏈狀，在淀粉培養(yǎng)基菌落園形，表面光滑濕潤、有粘性、產(chǎn)孢子較少。發(fā)酵培養(yǎng)基各成分重量比例如下豆餅粉4%、玉米漿1. 5%、玉米淀粉18%、磷 酸氫二鉀0. 3 %、磷酸二氫鉀0. 15 %、硫酸鎂0. 1 %、硫酸錳0. 02 %、消泡劑0. 3 %，其余為 水；種子培養(yǎng)基各成分重量比例如下蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，酵母膏0. 2%，葡萄 糖0. 1%，氯化鈉0. 1%，其余為水；種子培養(yǎng)和發(fā)酵過程如圖1所示二、種子培養(yǎng)，開始時將甘油管菌種進行平皿培養(yǎng)，然后進行搖瓶培養(yǎng)，最后在種 子罐中培養(yǎng)，種子罐0. Impa滅菌30分鐘，培養(yǎng)條件PH6. 6 ；溫度33°C ；27hr,轉速240轉/ 分，通風比1 0.2，種子生長進入對數(shù)期，鏡檢菌絲密集，大部分斷裂成兩聯(lián)菌，無雜菌，PH 上升至高峰向下回落0. 1時即可移入發(fā)酵罐；三、發(fā)酵，工藝條件，發(fā)酵溫度為33°C，PH為6.7，通風比1 0. 6 ；基礎料加補料工 藝及脈沖進氨；流加通氨調節(jié)PH至菌絲生長代謝最佳值，流加補料，在補料中加入含氮源 的營養(yǎng)基，發(fā)酵罐轉速160轉/分，通風比在開始加料的12小時，通風比1 0.4，補料時， 通風比1 0.6，補料結束時通風比1 0.4，發(fā)酵過程中，當PH下降至6. 5時開始通液氨， DE值下降至20，PH不再下降，有上升趨勢，開始疏加補料，每小時流加補料一次，將DE值控 制在10 20之間，發(fā)酵至50小時，細胞空胞率達80%以上時，PH值上升到7. 2，酶活不再 上升，酶活力不再增長，鏡檢菌絲大部分死亡，即可結束發(fā)酵，發(fā)酵酶可達1250u/ml，發(fā)酵結 束即轉入后處理提純；四、后處理提純，即發(fā)酵液一第一次絮凝處理一第二次絮凝處理一板框壓濾一超 濾一成品加穩(wěn)定劑、防腐劑處理一二次升溫，一次升溫72-78°C、保溫時間30分鐘，二次升 溫62-68°C、保溫時間60分鐘，一成品。
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如圖2和圖3所示，首先用氯化鈣溶液進行第一次絮凝處理，用硅藻土、磷酸鹽和 石灰水對發(fā)酵罐進行第二次絮凝處理，然后壓入消毒空氣，形成壓力缸，進行一次板框壓 濾，得濾餅和清液，再進行二次板框壓濾，又得清液，即超濾循環(huán)液，然后進入冷卻器，加冷 卻水，進行超濾，超濾后進行一次理化檢測，然后用鹽、糊精和醋酸鈉進行調配，調配后升溫 至75°C，30分鐘，然后用冷卻水降溫，再用硅藻土過濾，進入二次升溫桶升溫至65°C，60分 鐘，再用冷卻水降溫后，用硅藻土進行成品精過濾，裝入成品儲罐，再進行一次理化檢測，合 格后進行無菌包裝、入庫。一次性投料，由于基礎濃度高，滲透壓大，不利于菌絲大量代謝，中后期營養(yǎng)缺乏， 造成菌絲過早衰退，因而產(chǎn)酶低下，從而造成單罐能耗大，單位生產(chǎn)成本大。由于采用基礎 料加補料(加入含氮源營養(yǎng)基)及脈沖通氨，使基礎濃度低，滲透壓小，溶氧好，適宜菌絲生 長產(chǎn)酶，因而最終放罐活力增加大，降低了單罐能耗，降低了單位生產(chǎn)成本。在發(fā)酵過程中， 菌絲代謝旺盛，PH至下降快，因而產(chǎn)酶快，高。經(jīng)過工藝的改進，使產(chǎn)品的各項技術指標均達到最佳且穩(wěn)定，適合大量生產(chǎn)要求。 通過對發(fā)酵工藝的改進，使產(chǎn)酶活力提高了近2倍，對后處理工藝改進后，產(chǎn)品的質量大幅 提高且穩(wěn)定。收率93%，產(chǎn)品酶活力5632u/ml，細菌總數(shù)< 1 X IO2個/ml，無沉淀，PH6. 5。
權利要求
高純中溫α 淀粉酶的生產(chǎn)方法，包括種子培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶和后處理提純各階段，其特征在于，步驟如下一、材料準備，購買枯草芽孢桿菌的甘油管菌種，該菌株呈短桿狀、兩端鈍園、單獨或成鏈狀，在淀粉培養(yǎng)基菌落園形，表面光滑濕潤、有粘性、產(chǎn)孢子較少；發(fā)酵培養(yǎng)基各成分重量比例如下豆餅粉3 5％、玉米漿1 2％、玉米淀粉16 20％、磷酸氫二鉀0.2 0.4％、磷酸二氫鉀0.1 0.2％、硫酸鎂0.05 0.15％、硫酸錳0.01 0.03％、消泡劑0.2 0.4％，其余為水；種子培養(yǎng)基各成分重量比例如下蛋白胨0.5 1.5％，牛肉膏0.2 0.4％，酵母膏0.1 0.3％，葡萄糖0.05 0.15％，氯化鈉0.05 0.15％，其余為水；二、種子培養(yǎng)，開始時進行平皿培養(yǎng)，然后進行搖瓶培養(yǎng)，最后在種子罐中培養(yǎng)，種子罐0.1mpa滅菌20 40分鐘，培養(yǎng)條件PH6.3 7.0，溫度31 35℃，25 30hr，轉速240轉/分，通風比1∶0.2，種子生長進入對數(shù)期，鏡檢菌絲密集，大部分斷裂成兩聯(lián)菌，無雜菌，PH上升至高峰向下回落0.1時即可移入發(fā)酵罐；三、發(fā)酵產(chǎn)酶，工藝條件，發(fā)酵溫度為31 35℃，PH為6.6 6.8，通風比1∶0.4 0.6；基礎料加補料工藝及脈沖進氨；流加通氨調節(jié)PH至菌絲生長代謝最佳值，流加補料，在補料中加入含氮源的營養(yǎng)基，發(fā)酵罐轉速160轉/分，發(fā)酵過程中，當PH下降至6.5時開始通液氨，DE值下降至20，PH不再下降，有上升趨勢，開始流加補料，每小時流加補料一次，將DE值控制在10～20之間，發(fā)酵至45 55小時，細胞空胞率達80％以上時，PH值上升到7.2，酶活力不再增長，鏡檢菌絲大部分死亡時，即可結束發(fā)酵，發(fā)酵酶可達1250 1350u/ml，發(fā)酵結束轉入后處理提純；四、后處理提純，即發(fā)酵液→第一次絮凝處理→第二次絮凝處理→板框壓濾→超濾→成品加穩(wěn)定劑、防腐劑處理→二次升溫，一次升溫72 78℃、保溫時間30分鐘，二次升溫62 68℃、保溫時間60分鐘，→成品。
2.根據(jù)權利要求1所述的高純中溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，后處理提純步 驟，首先用氯化鈣溶液進行第一次絮凝處理，用硅藻土、磷酸鹽和石灰水對發(fā)酵罐進行第二 次絮凝處理，然后壓入消毒空氣，形成壓力缸，進行一次板框壓濾，得濾餅和清液，再進行二 次板框壓濾，又得清液，即超濾循環(huán)液，然后進入冷卻器，加冷卻水，進行超濾，超濾后進行 一次理化檢測，然后用鹽、糊精和醋酸鈉進行調配，調配后升溫至75°C，30分鐘，然后用冷 卻水降溫，再用硅藻土過濾，進入二次升溫桶升溫至65°C，60分鐘，再用冷卻水降溫后，用 硅藻土進行成品精過濾，裝入成品儲罐，再進行一次理化檢測，合格后進行無菌包裝、入庫。
全文摘要
高純中溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，包括種子培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶和后處理提純各階段，步驟如下一、材料準備，購買枯草芽孢桿菌的甘油管菌種，準備發(fā)酵培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基；二、種子培養(yǎng)，開始時進行平皿培養(yǎng)，然后進行搖瓶培養(yǎng)，最后在種子罐中培養(yǎng)；三、發(fā)酵產(chǎn)酶，發(fā)酵溫度為31-35℃，pH為6.6-6.8，通風比10.4-0.6；基礎料加補料工藝及脈沖進氨；四、后處理提純，即發(fā)酵液→第一次絮凝處理→第二次絮凝處理→板框壓濾→超濾→成品加穩(wěn)定劑、防腐劑處理→二次升溫→成品。本發(fā)明有效的解決產(chǎn)品收得率低、易沉淀及微生物指標不合格的問題，使產(chǎn)品質量抽檢合格率100％，使發(fā)酵活力提高近2倍，發(fā)酵酶活達到1300u/ml以上，純度提高了3倍，并且產(chǎn)品質量穩(wěn)定。
文檔編號C12N9/28GK101974500SQ20101053102
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月24日 優(yōu)先權日2010年10月24日
發(fā)明者唐建, 唐雪峰, 韓少中 申請人:津市市新型發(fā)酵有限責任公司