專利名稱：梨孢菌PalH蛋白及其編碼基因的功能與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)和真菌基因工程領(lǐng)域中控制真菌菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生與 致病力的基因及其編碼蛋白的功能與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
梨孢菌(Magnaporthe oryzae)是子囊菌亞門的真菌，能侵染水稻、小麥、大麥、粟 以及其它多種禾本科植物，導(dǎo)致瘟病。尤其是該菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各個(gè)栽培 稻區(qū)每年均有發(fā)生，危害廣泛嚴(yán)重。一般情況下，稻瘟病的危害可使水稻減產(chǎn)5-10%，重病 田可導(dǎo)致水稻絕收。稻瘟病在我國曾多次流行，也是我國水稻的主要病害之一。梨孢菌對植物的侵染起始于分生孢子的形成，其過程包括分生孢子附著到植物葉 片上后，經(jīng)過萌發(fā)，附著胞形成與成熟，附著胞內(nèi)膨脹壓的產(chǎn)生與累積，侵染釘產(chǎn)生與植物 表皮的穿透，侵染性菌絲在植物細(xì)胞內(nèi)的形成與分支，侵染性菌絲在植物細(xì)胞間和組織間 的擴(kuò)展等幾個(gè)步驟。梨孢菌侵染感病寄主時(shí)，侵染性菌絲在植物組織間的擴(kuò)展導(dǎo)致形成直 徑2-3毫米以上的梭形灰色或灰褐色病斑，這些病斑中的侵染菌絲穿透植物組織向空中分 化形成分生孢子梗，進(jìn)一步形成分生孢子。分生孢子在風(fēng)、雨的沖刷下釋放、附著，引起植物 的再侵染。梨孢菌從分生孢子附著到分生孢子再產(chǎn)生的周期一般所需時(shí)間為3-5天；在植 物的生長季節(jié)，如果條件適宜，能夠多次侵染，造成危害。稻瘟病的嚴(yán)重度與菌絲擴(kuò)展能力 及形成分生孢子的多少直接相關(guān)，鑒定控制梨孢菌菌絲生長、分生孢子形成及其形態(tài)建成、 侵入釘形成與侵染菌絲擴(kuò)展的基因及其功能不僅對于揭示梨孢菌及相關(guān)絲狀真菌的生長 和發(fā)育機(jī)制具有重要的理論意義，而且對于研發(fā)控制包括稻瘟病在內(nèi)的植物真菌病害的藥 劑具有重要應(yīng)用價(jià)值。在絲狀真菌中，菌絲內(nèi)的細(xì)胞以橫隔為界，菌絲的生長為頂端生長類型，其生長僅 限于菌絲頂端的穹窿區(qū)域，在直徑均勻的后部管狀區(qū)域則幾乎不再伸長，菌絲的生長速率 在頂端最大，而在伸長區(qū)的基部，生長速率幾乎為零。菌絲的頂端生長是通過菌絲頂端細(xì)胞 的向頂性擴(kuò)展來實(shí)現(xiàn)的。菌絲的頂端生長涉及泡囊、肌動(dòng)蛋白、膨壓、細(xì)胞壁等的形成(Gow N.A.R. 1994)， 其中最主要的影響來自于菌絲細(xì)胞壁。當(dāng)菌絲進(jìn)行頂端生長時(shí)，菌絲頂端細(xì)胞壁必須維持 一定可塑性，以便新的壁物質(zhì)加入，使壁不斷向前延伸，但同時(shí)又必須具有一定剛性，以抵 抗胞內(nèi)膨壓，防止原生質(zhì)從菌絲頂端噴出，頂端細(xì)胞壁剛性和可塑性的平衡在菌絲頂端生 長過程中起著重要的作用(竇潔，1997)。菌絲細(xì)胞壁的成分較為復(fù)雜，包含有幾丁質(zhì)、纖維 素、半纖維素、α和β葡聚糖、蛋白及脂類物質(zhì)等成分，另外細(xì)胞壁中也含有不同數(shù)量的無 機(jī)離子，如磷、鈣、鎂離子等，它們相互連接構(gòu)成菌絲外結(jié)構(gòu)。真菌的生長除了需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的環(huán)境條件，如一定的溫 度、濕度、PH值和光照等。每種環(huán)境因子對生長都有最適點(diǎn)、最高限和最低限，超過高限、低 于低限，真菌將停止生長。而且，有少數(shù)真菌對極端環(huán)境有很強(qiáng)的耐受性。大多數(shù)真菌在ρΗ3 9都能生長。植物病原真菌生長的最適ρΗ為5 6. 5，而皮膚真菌在PH4 10都可生長。氫離子濃度對一些金屬離子的利用有一定影響，一些金屬離 子形成的復(fù)合物在一定PH范圍內(nèi)是不溶解的。Mg2+和P043_在酸性條件下呈游離狀態(tài)，pH升 高會(huì)形成不可溶的復(fù)合物，真菌即不能利用。在堿性培養(yǎng)基中鐵離子形成不可溶的復(fù)合物， 造成培養(yǎng)基中鐵離子的缺失。鈣和鋅離子也有相似的現(xiàn)象。PH還能影響細(xì)胞的滲透性。在 酸性條件下，細(xì)胞質(zhì)膜被H+飽和，限制了陽離子的通行。在堿性條件下，細(xì)胞質(zhì)膜被OH—飽 和，限制了陰離子的通行。外界的氫離子濃度也影響細(xì)胞內(nèi)的PH，從而影響酶的活性。酶 在最適PH條件下才有活性，各種酶有不同的pH要求。大多數(shù)酶的最適pH為4 8。在極 端pH環(huán)境中，某些真菌可借助自身的活性來改變環(huán)境中的pH，因此，它能夠在不同的pH環(huán) 境中生長。耐酸菌雖然能生活在低PH的環(huán)境中，但是它們的細(xì)胞內(nèi)含物的pH并不低，否則 ATP、核酸和其他組分將被水解。耐酸菌的基本特征是在它們的細(xì)胞內(nèi)能維持正常的pH環(huán)境。
受環(huán)境pH影響表達(dá)的基因包括那些表達(dá)分泌酶，透性酶和代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 基因，這些基因只在特定的環(huán)境PH下表達(dá)或者與維持細(xì)胞內(nèi)pH平衡相關(guān)。但目前有關(guān)真 菌生長的特異性基因克隆報(bào)道很少。在梨孢菌分生孢子形成及變異方面1993年，Shi和Leung報(bào)道了梨孢菌水 M ^ 離 ^ Guyll 白勺 conl- ^ ^ # (Shi, Ζ. X. ， and Leung, H. Genet ic analysis and rapidmapping of a sporulat ion mutation in Magnaporthe grisea, MPMI，Vol. 7, No. 1,1993, pp. 113-120.)。該突變體與野生型形成分生孢子的形式不同，在每一個(gè)分 生孢子梗上，只產(chǎn)生一個(gè)端生的伸長的三個(gè)細(xì)胞的分生孢子。conl—突變體在培養(yǎng)基上 的生長和分生孢子的形成分別只有野生型的73%和2. 3%，在載玻片或洋蔥表皮上不能 形成正常的附著胞，并且在原來感病的水稻品種上沒有致病性。兩年之后，他們又運(yùn)用 REMI (Restriction Enzyme-mediated Insertion)技術(shù)獲得 了一系列與分生孢子形成有 關(guān)的突變體 con2:con7-(Shi, Ζ. Χ. , and Leung, H. Genetic analysis of sporulationin Magnaporthe grisea by chemical and insertional mutagenesis, MPMI, Vol. 8, No. 6, 1995, pp. 949-959.)。突變體con5_和con6_完全喪失了分生孢子形成能力；conl_、con 2_、 con4-和con 7-作用于con5_和con6_的下游，影響產(chǎn)孢能力和分生孢子的發(fā)育；con4_和 con7-產(chǎn)孢量減少約35%。conl-和con7-不能形成附著胞，因而喪失了對水稻的致病性， con2-和COn4-附著胞形成率明顯減少，因而致病性明顯減弱。通過它們之間的遺傳關(guān)系分 析表明，Conl 和 Con2 連鎖，Con5 和 Con6 連鎖，并且有Con5 > Con6 > Con7 和 Con2 > Conl 的上位關(guān)系。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良研究小組通過插入突變途徑克隆了梨孢菌中一個(gè)控制分 生孢子形成的特異性基因MgCONl，該基因缺失導(dǎo)致不能產(chǎn)生分生孢子并完全喪失致病性； MgCONl為一核蛋白，可能為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(彭友良等，國家發(fā)明專利ZL200510109447. 3)。 該研究小組還鑒定了一個(gè)控制分生孢子形態(tài)建成的基因MgCOMl，該基因的缺失導(dǎo)致分生孢 子形態(tài)變異并喪失致病性。(Yang et al，2009)。從以上研究報(bào)道可以看出，梨孢菌菌絲生長、分生孢子的形成及其形態(tài)構(gòu)建是一 個(gè)很復(fù)雜的過程，需要不少基因的參與。鑒定這些基因，解明它們的分子功能及其對梨孢菌 致病性的影響，有可能從中發(fā)現(xiàn)可以作為殺菌劑靶標(biāo)的蛋白，為開發(fā)控制稻瘟病及其它植 物真菌病害的高效藥劑奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供真菌菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生和致病性必需的一個(gè)蛋白及 其編碼基因。本發(fā)明所提供的真菌菌絲生長、真菌分生孢子產(chǎn)生和致病性所必需的蛋白來源于 梨孢菌，名稱為MoI^alH，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID Na 1 ；其序列由擬9個(gè)氨基酸殘基組成?；脤⑿蛄斜碇蠸EQ ID N2 :1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取 代和/或缺失和/或添加且與真菌菌絲生長或分生孢子產(chǎn)生和致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)。所述 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加。M0I3aIH的編碼基因(MoPalH)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。M0I3aIH基因，可具有下 述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 2的DNA序列；序列表中的SEQ ID Na 2由4887個(gè)堿基 組成，包括基因的啟動(dòng)子區(qū)域和編碼區(qū)。M0I3aIH編碼區(qū)僅一個(gè)外顯子，位于SEQ IDNo :2的 5'端第1474位至3964位堿基之間，5'端第1位至1473位堿基為啟動(dòng)子序列；2)編碼序列表中SEQ ID Na 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID Na 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序 列；4)與序列表中SEQ ID Na 2限定的DNA序列具有80%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA序列。M0I3aIH基因的cDNA也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 3的DNA序列，由M90個(gè)堿基組成；2)編碼序列表中SEQ ID Na 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID Na 3限定的DNA序列雜交的核苷酸序 列；4)與序列表中SEQ ID Na 3限定的DNA序列具有80%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液 中，在65°C下雜交并洗膜。利用Mc^alH基因的啟動(dòng)子、編碼區(qū)序列構(gòu)建的表達(dá)載體以及通過該載體轉(zhuǎn)化獲 得的細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以Mc^alH基因中任一區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，并通過PCR擴(kuò)增用于檢測在化 合物處理狀況下Mc^alH基因的表達(dá)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。以M0I3aIH或與其有40%或以上一致性的同源蛋白中任一區(qū)域的氨基酸序列設(shè)計(jì) 多肽，并制備抗體用于檢測在化合物處理狀況下M#alH蛋白的表達(dá)也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。本發(fā)明證明Mc^alH基因的突變或缺失導(dǎo)致梨孢菌菌絲生長緩慢、分生孢子產(chǎn)生 能力和致病性顯著降低，說明Mc^alH基因是梨孢菌引起水稻稻瘟病所必需的基因。同時(shí)， 該基因缺失后，其對過酸或過堿性環(huán)境更為敏感。因此，篩選能夠阻止該基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄物 的剪切及其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位的化合物，可以有效控制梨孢菌分生孢子的產(chǎn)生和水稻稻瘟病的發(fā)生，可以作為新型殺菌劑的候選新藥物直接利用或改變PH值之后加以利 用。也就是說，本發(fā)明所提供的M#alH的一個(gè)重要用途是，該基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄物的剪切 及其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位可以作為重要候選靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗梨孢 菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。進(jìn)一步，解析該基因參與的分生孢子產(chǎn)生的信號(hào)傳遞途徑，從中 也可以發(fā)現(xiàn)候選靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗梨孢菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。此外， 也可以以該基因核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針或作為PCR引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)在梨孢菌中 再分離該序列，也可以用于篩選、分離其它真菌的與該基因具有一定序列同源性的序列。


附圖1.野生型菌株P(guān)131、與突變體⑶9848、MoPalH基因敲除體及其互補(bǔ)體菌落 生長的比較。各菌株在西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基(每升含150ml西紅柿汁、30-50克燕麥片煮 沸30分鐘過濾取濾液、20克瓊脂)平板上活化后，采用打孔器分別挖取大小一致的菌絲塊， 繼續(xù)轉(zhuǎn)移到西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基板上，28°C培養(yǎng)120小時(shí)，測量菌落直徑并照相，計(jì)三次 試驗(yàn)重復(fù)，每次重復(fù)每個(gè)菌株測量3皿。附圖2.野生型菌株P(guān)131、與突變體⑶9848、MoPalH基因敲除體及其互補(bǔ)體在不 同PH值下菌落生長的比較。采用同上的方法，將大小一致的菌絲塊，繼續(xù)轉(zhuǎn)移到不同PH值 的CM平板上，28°C培養(yǎng)120小時(shí)，測量菌落直徑并照相，計(jì)三次試驗(yàn)重復(fù)，每次重復(fù)每個(gè)菌 株測量3皿。附圖3.野生型菌株P(guān)131、與突變體⑶9848、M0I3aIH基因敲除體及其互補(bǔ)體在不 同PH值下菌落生長的照片。附圖4.野生型菌株P(guān)131、與突變體⑶9848、ΜοΙ^1Η基因敲除體及其互補(bǔ)體產(chǎn)孢量 的比較。將菌絲充分打斷，均勻地涂布到西紅柿汁燕麥片培養(yǎng)基(每升含150ml西紅柿汁、 30-50克燕麥片煮沸30分鐘過濾取濾液、20克瓊脂)平板上，培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見新生菌 絲長出培養(yǎng)基表面時(shí)，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈，蓋上單層紗布，于光 照培養(yǎng)48小時(shí)后，將各菌株在培養(yǎng)皿(直徑6cm)內(nèi)產(chǎn)生的分生孢子用同樣體積水洗下，用 血球記數(shù)板測定單位體積中所含有的分生孢子數(shù)。附圖5.互補(bǔ)載體構(gòu)建示意圖。在PCR正向引物設(shè)計(jì)酶切EcoRI酶切 位點(diǎn)5’ -CCTGAATTCCTGTTCTAGTCCAAC-3’，反向引物設(shè)計(jì)酶切ClaI酶切位點(diǎn) 5，-GGCATCGATCAGTTCTGTATGTTC-3，，從野生菌 P131 中擴(kuò)增出出一條 4. 8kb 的 DNA 片段，該 片段包含ATG前1. 5kb的序列。片段經(jīng)EcoRI、ClaI雙酶切，連接包含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基 因的載體KN (以同樣的雙酶切)，酶切鑒定，并經(jīng)測序驗(yàn)證正確后，得到互補(bǔ)載體PKN06440.附圖6. MoPalH基因的敲除。a，敲除載體構(gòu)建示意圖左臂正向引 物5’ -CGTACTAGTTGCGGTAGACCTCC-3’，其5’帶有SpeI酶切位點(diǎn)，反向引物為 5’ -TAGGAATTCCTTACCCGTATGACAC-3’，其 5’ 端帶有 EcoRI 酶切位點(diǎn)；右臂正向引 物 5，-GCCAAGCTTGCTAACTCTACTTGC-3，其 5，帶有 HindIII 酶切位點(diǎn)，反向引物為 5，-ACGGGTACCTGTCAGCTACAAAG-3，其 5，帶有 KpnI 酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段分別用 Spel+EcoRI 和Hindllll+Kpnl消化，按照上下游順序分別連接到pK0V21載體潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的 兩側(cè)，構(gòu)成基因置換載體PK0V06440。b，敲除轉(zhuǎn)化體的PCR驗(yàn)證按a中標(biāo)識(shí)的Pl和P2分 別組成引物對(PI :5，-CTTGACGCACACAGAGGTTTCC-3，，P2 :5，-GACAGACGTCGCGGTGAGTT-3，)；P3 禾口 P4 分另Ij 組成弓I 物對(P3 :5，-TCTGGACCGATGGCTGTGTAG-3，，P4 5’ -GAGGTAGATGGAGAGAGGTAGCG-3’)，擴(kuò)增敲除轉(zhuǎn)化得到的抗性正確的轉(zhuǎn)化子基因組DNA， 擴(kuò)增片段大小均為2. 01Λ左右。c，敲除轉(zhuǎn)化體的Southern雜交驗(yàn)證將野生型菌株和敲除 轉(zhuǎn)化體的基因組DNA分別經(jīng))(h0I消化后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以a所示的probe為雜交探針 (即敲除載體的左臂)，雜交后野生型的雜交帶為1869bp，敲除轉(zhuǎn)化體的雜交帶為8711bp。附圖7.野生型菌株P(guān)131、與突變體⑶9848、MoPalH基因敲除體及其互補(bǔ)體對大 麥致病性的比較。將各菌株的孢子懸浮液(濃度為IX IO5個(gè)/ml)均勻地噴霧接種于生長 7天左右的大麥葉片正面。在和100%相對濕度下避光培養(yǎng)36h，見光后繼續(xù)保濕培養(yǎng) 3天后，調(diào)查發(fā)病情況并照相。附圖8. MoPalH的亞細(xì)胞定位。aJoI^alH: :GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建；bJoI^alH亞 細(xì)胞定位圖。圖示說明左列為暗視場藍(lán)光下所拍攝，右列為明視場所拍攝。附圖9. MoPalH與其他病原真菌中同源蛋白的聚類分析。圖示說明BcPalH、 FgPalH、FmPalH、FoPalH 和 PnPalH 為分別來源于灰葡萄孢菌(Botrytis cineara)、禾 谷鐮刀菌(Fusarium gramineara)、串珠鐮刀菌(Fusarium minillifomis)、尖胞鐮刀菌 (Fusarium oxysporum)、小麥穎枯菌(Phaeosphaeria nodorum)PalH 同源蛋白。附圖10.禾谷鐮刀菌FgPalH基因互補(bǔ)稻瘟菌M0I3aIH基因敲除體。a，菌絲生 長比較；b，產(chǎn)孢量比較；c，對大麥致病性的比較。圖注說明P131 稻瘟菌野生型菌株； AmopalH_4，稻瘟菌MoI^alH基因敲除菌株；c AFgPalH-Ic, AFgPalH-l，禾谷鐮刀菌 FgPalH基因互補(bǔ)AmopalH-4的菌株。接種時(shí)將各菌株的孢子懸浮液(濃度為1 X IO5個(gè)/ ml)均勻地噴霧接種于生長7天左右的大麥葉片正面。在和100%相對濕度下避光培 養(yǎng)36h，見光后繼續(xù)保濕培養(yǎng)3天后，調(diào)查發(fā)病情況并照相。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，以下通過實(shí)施例予以進(jìn)一步的說明，但并非對本發(fā)明的 限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、MoI^alH基因的分離1)突變體的篩選與遺傳分析通過篩選本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的稻瘟菌P131菌株的ATMT轉(zhuǎn)化體庫，獲得一個(gè)菌落生長 緩慢且菌落形態(tài)異常的突變體⑶9848。將突變體⑶9848與交配型相反的稻瘟菌菌 株進(jìn)行有性雜交，挑取雜交后代進(jìn)行表型和潮霉素抗性分析。結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，所有不抗 潮霉素的后代均為野生型，而在抗潮霉素的后代中有一個(gè)表現(xiàn)為野生型，其余均為突變表 型(生長緩慢)，說明突變表型和T-DNA的插入是共分離的，且T-DNA為多拷貝插入。表1突變表型與潮霉素抗性的共分離分析
突變體號(hào)后代總數(shù)抗潮霉素不抗潮霉素野生型突變型野生型突變型CD984844112310 2) TAIL-PCR與基因序列分析
以突變體CD9848DNA為模板，進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的條帶回收后送樣測序， 將序結(jié)果與稻瘟菌全基因組進(jìn)行BLASTN分析，獲得了 T-DNA的插入位點(diǎn)信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， T-DNA插入在基因MGG_06440. 5啟動(dòng)子區(qū)域，距離ATG948bp，推測可能此基因的破壞導(dǎo)致了 菌落形態(tài)的變化。提取MGG_06440.5基因的預(yù)測蛋白在NCBI上進(jìn)行BLASTP比對，發(fā)現(xiàn)此 基因編碼的蛋白可能是一個(gè)定位于真菌細(xì)胞膜上感應(yīng)外界PH變化的因子。實(shí)施例2、MoPalH基因在菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生中的作用1)敲除載體的構(gòu)建基因敲除的策略采用同源重組的方法將Mc^alH基因的編碼區(qū)用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移 酶基因置換掉。以 P131 基因組 DNA 為模板，用 06440upF(5，-CGTACTAGTTGCGGTAGACCTCC-3 ，),06440upR(5' -TAGGAATTCCTTACCCGTATGACAC-3‘)擴(kuò)增出片段作為左臂，06440dF(5，-GC CAAGCTTGCTAACTCTACTTGC-3，)、06440dR (5，-ACGGGTACCTGTCAGCTACAAAG-3，)擴(kuò)增段作為右 臂，分別用Spel+EcoRI和Hindllll+Kpnl消化，按照上下游順序分別連接到pK0V21載體潮 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的兩側(cè)，構(gòu)成基因置換載體PK0V06440。2)互補(bǔ)載體的構(gòu)建根據(jù)預(yù)測的基因，設(shè)計(jì)了包含酶切位點(diǎn)的PCR引物06440CF(5，-CCTGAATTCCTGTTC TAGTCCAAC-3，，包含 EcoRI 位點(diǎn))、06440CR(5，-GGCATCGATCAGTTCTGTATGTTC-3，，包含 ClaI 位點(diǎn))，以野生菌P131基因組DNA為模板，經(jīng)高保真LA-Taq酶擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條4. 88kb的 DNA片段，該片段包含ATG前1. 5kb的序列。片段經(jīng)EcoRI、ClaI雙酶切，連接包含新霉素 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的載體KN(以同樣的雙酶切)，酶切鑒定，并經(jīng)測序驗(yàn)證正確后，得到互補(bǔ) 載體 PKN06440。3)梨孢菌的轉(zhuǎn)化在本發(fā)明中，梨孢菌的轉(zhuǎn)化選用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體的方法，原生質(zhì)體 的制備和轉(zhuǎn)化方法如下a.原生質(zhì)體的制備500毫升三角瓶裝入150毫升液體CM培養(yǎng)基(酵母提取物0. 1 %，酶水解干酪素 0. 05%,葡萄糖1 %，硝酸鈣0.1%，磷酸二氫鉀0.02%，硫酸鎂0. 025%，氯化鈉0.015%)， 分別接入所需梨孢菌菌株的適量菌絲、孢子混和體，在26-28°C、100轉(zhuǎn)/分條件下?lián)u培 30-32小時(shí)，三層滅菌擦鏡紙過濾收集菌絲體，菌絲體用0. 7M氯化鈉溶液洗滌后轉(zhuǎn)移至滅 菌的50毫升離心管中，每1克菌絲加入1毫升的酶滲透液(含20毫克/毫升崩潰酶，用 0. 7M氯化鈉配制)，26-28°C、100轉(zhuǎn)/分條件下酶解3_4小時(shí)后，用0. 7M氯化鈉洗滌菌絲體， 經(jīng)三層滅菌擦鏡紙過濾，收集原生質(zhì)體，4，000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，先用25毫升STC (1. 2M 山梨醇，IOmMTris-Cl,pH7. 5,50mM氯化鈣)洗滌原生質(zhì)體一次，然后分別用10毫升STC洗 2次，離心沉淀后用STC將原生質(zhì)體濃度調(diào)至0. 5-1 X IO8個(gè)/毫升。b.梨孢菌轉(zhuǎn)化分別將待轉(zhuǎn)化菌株的原生質(zhì)體(在發(fā)明中，敲除轉(zhuǎn)化的菌株為P131，互補(bǔ)轉(zhuǎn)化的 菌株為AmopalH-4)分裝于滅菌的50毫升離心管中，每管150微升，分別加入等體積的線 性化的載體(約2微克)和STC混合液，冰上放置20分鐘，然后逐滴緩慢加入2毫升/管 PTC溶液(60%聚己二醇3350，IOmM Tris-pH7. 5，50mM氯化鈣)，冰上靜止20分鐘，加入25 毫升/管冰冷的STC，緩慢混勻，4，000轉(zhuǎn)/分、4°C離心15分鐘，去上清，然后每管加入3毫升的LR培養(yǎng)基(0. 酵母提取物，0. 酶水解干酪素，IM蔗糖)，室溫靜置培養(yǎng)12-13小 時(shí)后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，加入12毫升冷卻至50°C的SR(LR+1. 6%瓊脂)，混勻，待其凝固吹干后， 上面鋪一層12毫升的0. 7%上層瓊脂(冷卻至50°C，含400微克/毫升的新霉素(互補(bǔ)實(shí) 驗(yàn))或300微克/毫升的潮霉素(美國Roche公司生產(chǎn)，基因置換試驗(yàn))。培養(yǎng)4-6 天，將出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)至固體CM培養(yǎng)基(0.6%酵母提取物，0.3%酶水解干酪素，0.3%酸 水解干酪素，的蔗糖，1. 6%瓊脂)(含400微克/毫升的新霉素(互補(bǔ)實(shí)驗(yàn))或250微 克/毫升的潮霉素(基因置換試驗(yàn))上，二次篩選后將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入燕麥片番茄培養(yǎng)基上 培養(yǎng)，并進(jìn)行單孢分離。4)野生型、敲除體、互補(bǔ)體的菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生的比較分別將野生型P131、敲除體AmopalH、互補(bǔ)體CAmopalH的菌落打孔接種至番茄 燕麥平板上，5天(120h)后測定菌落直徑，比較生長速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除體AmopalH相對 于野生型P131生長速率降低約11. 4%，而互補(bǔ)體的生長速率恢復(fù)到野生型水平。將西紅柿燕麥平板上生長旺盛的野生型P131、敲除體AmopalH、互補(bǔ)體 CAmopalH菌落的菌絲充分打斷后均勻地涂布到新的西紅柿燕麥培養(yǎng)基平板上左右 光照培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見新生菌絲長出培養(yǎng)基表面時(shí)，用棉簽輕輕將菌絲打斷，并用水沖洗干 凈，晾干，單層紗布蓋上于^TC左右光照培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)基表面即可見大量的稻瘟病菌分 生孢子。用30ml滅菌水分若干次沖洗入50ml離心管中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并比較分生孢子形 態(tài)。比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除體AmopalH產(chǎn)孢量約為野生型P131的15%，而互補(bǔ)體C Δ mopalH 產(chǎn)孢量恢復(fù)至野生型水平。5)野生型、敲除體、互補(bǔ)體在不同pH值下的菌絲體生長比較分別將野生型P131、敲除體AmopalH、互補(bǔ)體CAmopalH的菌落打孔接種至不同 PH值(ρΗ5· 5，ρΗ6· 6，ρΗ7· 7)的CM培養(yǎng)基上，5天(120h)后測定菌落直徑，比較生長速率。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在酸性(PH5. 5)條件下三種菌株的生長速率相比中性(PH6.6)條件沒有明顯變 化；但是，在堿性(PH7. 7)條件下，敲除體AmopalH生長速率相比中性(pH6. 6)條件有顯 著的降低，但此時(shí)野生型P131和互補(bǔ)體C Δ mopalH的生長速率與中性pH條件無明顯差異。 以上研究表明，基因AmopalH可能是在堿性pH條件下發(fā)揮功能來使稻瘟菌適應(yīng)堿性環(huán)境。實(shí)施例3、MoPalH基因在稻瘟菌致病性中的作用使用野生型P131和敲除體AmopalH的孢子懸浮液(濃度為1 X IO5個(gè)/ml)均勻 地噴霧接種于生長7天左右的大麥葉片正面。在和100%相對濕度下避光培養(yǎng)36h， 見光后繼續(xù)保濕培養(yǎng)3天后，調(diào)查發(fā)病情況。接種結(jié)果表明，相對于野生型P131，敲除體 AmopalH的致病力顯著降低，而互補(bǔ)體C Δ mopalH致病力恢復(fù)至野生型水平。實(shí)施例4、MoPalH的亞細(xì)胞定位1)GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建利用如下引物Proup(5，-acaCTCGAGGCTGGGATCCCTTTTCGCG_3，)和 Prodown (5，_c acATCGATGACTGGTAGCAGAGGTGGCT-3，)，Gup (5，-ACATGTACAAGATGGATCCCCTCGAGGCCC-3，)和 Gdown (5，-ACAGAATTCTCAAGGCTCCGGCGGTCGAT-3，)，以野生型菌株 P131 的基因組 DNA 為模 版分別擴(kuò)增M0I3aIH啟動(dòng)子區(qū)域2501bp和基因全長0RFM90bp，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后測序確認(rèn)。 利用引物上添加的限制性內(nèi)切酶》ιοΙ和Clal，Bspl407I和FcoRI分別雙切將啟動(dòng)子和基 因分別連入GFP表達(dá)載體KNTG(KS+Neo+TrpC+GFP)載體，即獲得MoI^alH亞細(xì)胞定位載體ProMoPalH::GFP。2)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及M0I3aIH的定位采用不破壞載體內(nèi)基因的限制性內(nèi)切酶BstXI將構(gòu)建好的表達(dá)載體線性化，通過 稻瘟菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(方法見M#alH的敲除轉(zhuǎn)化)，將線性化的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化AmopalH敲 除體菌株。進(jìn)一步利用載體上所攜帶的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因篩選，共獲得16個(gè)抗性正確 的轉(zhuǎn)化子，其中15個(gè)轉(zhuǎn)化子在菌落生長狀態(tài)上恢復(fù)到野生型P131的水平。熒光顯微鏡觀 察GFP融合蛋白在互補(bǔ)體孢子中表達(dá)，結(jié)果表明(見圖8)Mc^alH定位于細(xì)胞膜上。實(shí)施例5、其他植物病原真菌中M0I3aIH同源蛋白的鑒定以梨孢菌Mc^alH蛋白的氨基酸序列對其他植物病原真菌真菌灰葡 萄抱菌(Botrytis cineara)、禾谷鍵刀菌(Fusarium gramineara)、串珠鍵刀 菌(Fusariumminillifomis)> 尖胞鍵刀菌(Fusarium oxysporum)、小麥穎枯菌 (Phaeosphaerianodorum)的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行tBlastn檢索，提取上述基因組中編碼與 MoPalH同源蛋白的基因組序列。對所提取的序列進(jìn)行fGENSH和\或GENSCAN預(yù)測，分別鑒 定出上述真菌中MoI^alH的同源蛋白，將其分別命名為JcI^alH、FgPalH、FmPalH、R^alH和 PnPalH，其序列如序列表中 SEQ ID NO 4、5、6、7 和 8 所示。MoPalH 蛋白與 BcPalH、FgPalH、 FmPalH、R^alH或PrfalH的氨基酸序列一致性達(dá)到40%以上，將上述蛋白進(jìn)行Clastwl比 對分析、Phylodraw 8. 02繪制聚類圖，如附圖9所示。為驗(yàn)證上述基因的功能，我們利用禾谷鐮刀菌(Fusarium gramineara)中 FgPalH基因?qū)mopalH-4菌株進(jìn)行了互補(bǔ)。具體實(shí)施方法如下采用實(shí)施例2中的引 物 06440CF(包含 EcoRI 位點(diǎn))和弓丨物 5，-TATAAGCTTGACTGGTAGCAGAGGTGGCTA-3'(包含 HindIII位點(diǎn))，以野生菌P131基因組DNA為模板，經(jīng)高保真LA-Taq酶擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條 1. 73kb的DNA片段，該片段為M0I3aIH的啟動(dòng)子序列。片段經(jīng)EcoRI、HindIII雙酶切，連 接包含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的載體KN(以同樣的雙酶切)，酶切鑒定，并經(jīng)測序驗(yàn)證正確 后，得到中間載體載體 pKN06440p。然后以引物 5，-TATAAGCTTATGA-CCGCCGCCGGCTTGAT-3，( 含 HindIII 位點(diǎn))和 5，-GGTTATCGATCACATGCTCACTTCAT-TTGC-3，(含 ClaI 位點(diǎn))擴(kuò)增禾谷 鐮刀菌基因組DNA，擴(kuò)增片段長度2. 88Kb，包含F(xiàn)gPalH基因的編碼區(qū)和500bp的終止子區(qū) 域。擴(kuò)增片段經(jīng)Hindlll、ClaI雙酶切，連接到中間載體載體pKN06440p的相同酶切位點(diǎn)， 得到pKN-FgPalH。按實(shí)施例2中所述的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化AmopalH-4菌株。經(jīng)鑒定得到2個(gè) 互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體。測定結(jié)果表明，互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體的菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生和致病性基本回復(fù)到野 生型水平(如圖10)，說明FgPalH基因具有與M0I3aIH基因相似的功能。
權(quán)利要求
1.梨孢菌中控制致病性、菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生的必需蛋白MoI^alH，其具有如序 列表中的SEQID NO 1所示氨基酸殘基序列。
2.權(quán)利要求1所述的梨孢菌致病性、菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生所必需蛋白Mc^alH的 編碼基因MoI^alH，其特征在于具有如序列表中SEQ ID NO 2所示的DNA序列，或者編碼序 列表中SEQ ID NO 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述梨孢菌致病性、分生孢子產(chǎn)生所必需蛋白的編碼基因M#alH的 cDNA，其特征在于具有如序列表中SEQ ID NO 3所示的DNA序列。
4.利用權(quán)利要求1所述的梨孢菌致病性、菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生所必需蛋白的編 碼基因構(gòu)建的表達(dá)載體。
5.利用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所獲得的細(xì)胞系和宿主菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述，通過將梨孢菌菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生所必需蛋白M#alH 進(jìn)行缺失或突變或修飾而使其菌絲生長或/和分生孢子產(chǎn)生或/和致病力發(fā)生缺陷中的應(yīng) 用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述，以梨孢菌致病性、菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生所必需蛋白 Mc^alH作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的利用。
8.權(quán)利要求1所述的梨孢菌控制菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生的必需蛋白Mc^alH在其 他植物病原真菌灰葡萄孢菌(Botrytis cineara)、禾谷鐮刀菌(Fusarium gramineara)、 串珠鍵刀菌(Fusariumminillifomis)、尖胞鍵刀菌(Fusarium oxysporum)、小麥穎枯菌 (Phaeosphaerianodorum)中的同源蛋白 BcPalH、FgPalH、FmPalH、FoPalH 和 PnPalH，其特 征在于分別具有如序列表中SEQ ID N0:4、5、6、7、8所示的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1所述的梨孢菌控制致病性、菌絲體生長和分生孢子產(chǎn)生的必需蛋白 MoPalH在其他植物病原真菌中的同源蛋白BcPalH、FgPalH、FmPalH、FoPalH和PnPalH作為 靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的利用。
全文摘要
本發(fā)明公開了梨孢菌MoPalH基因及其編碼蛋白的功能與用途，該基因控制梨孢菌菌絲體生長、產(chǎn)孢量以及致病力的新基因MoPalH，該基因及其cDNA和編碼的蛋白質(zhì)分別具有序列表中SEQ ID№2、№3和№1的核苷酸或氨基酸序列。MoPalH基因的突變或缺失導(dǎo)致梨孢菌菌絲體生長速率比野生型P131降低11.4％，菌絲體生長速率對過酸或過堿性環(huán)境更為敏感，分生孢子產(chǎn)量降低為野生型P131的15％，和對水稻的侵染能力顯著下降。禾谷鐮刀菌(Fusarium gramineara)中的FgPalH基因能使梨孢菌敲除體ΔmopalH的菌絲生長速率、分生孢子產(chǎn)量和致病性均恢復(fù)到野生型水平，說明FgPalH基因具有與MoPalH基因具有相似的功能。MoPalH編碼的蛋白或/和其在其它病原真菌中的同源蛋白的表達(dá)或修飾均可作為重要候選靶標(biāo)，用于設(shè)計(jì)和篩選抗真菌的新型藥劑。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102060918SQ20101053075
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者張燕, 彭友良, 楊俊 , 王大偉, 趙文生, 陳小林 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)