專利名稱：一種用百草枯篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于百草枯抗性的轉(zhuǎn)基 因植物的規(guī)模化篩選的雙蛋白表達(dá)的表達(dá)盒以及基于該表達(dá)盒的載體、規(guī)?；Y選百草枯 抗性的轉(zhuǎn)基因植物和規(guī)?；Y選百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、多抗、高效、多產(chǎn) 的作物新品種，是緩解資源束縛、保護(hù)環(huán)境安全以及拓展農(nóng)業(yè)功能的重要途徑。發(fā)展和完善 現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。在實(shí)際基因轉(zhuǎn)化操作過程中，只有小部分的植 物細(xì)胞能夠吸收外源DNA并整合到植物基因組上，仍有大部分植物細(xì)胞處于未轉(zhuǎn)化狀態(tài)， 為了從數(shù)目龐大的植物細(xì)胞中篩選得到外源DNA整合的植物細(xì)胞，需要篩選標(biāo)記基因的輔 助?，F(xiàn)在常用的篩選標(biāo)記基因主要有抗生素類和除草劑兩類?？股乜剐曰蛞蚓哂懈咿D(zhuǎn)化效率和方便篩選等優(yōu)點(diǎn)而成為最常用的篩選標(biāo)記。 但是人們擔(dān)心抗生素抗性基因會轉(zhuǎn)移到微生物中，使病原菌帶有抗生素抗性從而導(dǎo)致臨床 上抗生素使用失效。另一方面，抗生素的價格昂貴，作為篩選標(biāo)記成本高。因此，抗生素抗 性基因作為篩選標(biāo)記多用于科學(xué)研究過程中。除草劑抗性基因是近幾年來發(fā)展起來的一種 新型的篩選標(biāo)記與抗生素抗性基因相比，除草劑抗性基因具有價格低的優(yōu)點(diǎn)，也不會產(chǎn)生 臨床抗生素失效等擔(dān)憂，同時除草劑抗性基因不僅是篩選標(biāo)記基因還是一種目的基因，能 使轉(zhuǎn)基因作物具有良好的除草劑抗性性狀。現(xiàn)在主要使用的除草劑抗性基因有草甘膦抗性 基因和草丁膦抗性基因等，因草丁膦價格相對較高使得草丁膦抗性基因作為篩選標(biāo)記基因 主要用于實(shí)驗(yàn)室研究。草甘膦抗性基因是應(yīng)用比較多的一種篩選標(biāo)記基因。雖然除草劑抗 性基因是產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)基因篩選的優(yōu)良選擇標(biāo)記基因，但是其尚未得到大規(guī)模的應(yīng)用。這主要 由除草劑抗性基因單一造成的，目前大多數(shù)的除草劑抗性基因是草甘膦抗性基因，是在已 有的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基因的基礎(chǔ)上修飾得到的，新型的除草劑抗性基因的研究一直 沒有顯著進(jìn)展。研發(fā)一種新型的除草劑抗性基因是一項(xiàng)工作量巨大而且具有很大不確定性 的工作。百草枯( 虹叫11站，1，1-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶，分子量257.2)是繼草甘磷之后的 第二大除草劑，是一種速效觸殺型除草劑，兼有一定內(nèi)吸作用，主要用于果園、桑園、茶園、 林帶等作物的雜草，在農(nóng)業(yè)種植中的廣泛應(yīng)用已近50年，應(yīng)用在世界范圍內(nèi)超過100個國 家，受到廣泛接受與歡迎。百草枯是非選擇性除草劑，植物對其吸收非常迅速，即使噴藥后 短期內(nèi)降雨也不影響藥效的發(fā)揮。百草枯具有接受廣泛、廣譜性、藥效明顯、價格低等優(yōu)點(diǎn)， 將是一種優(yōu)良的植物轉(zhuǎn)基因篩選劑，但是由于百草枯抗性基因的研究一直以來沒有突破性 的進(jìn)展，使得百草枯作為篩選劑也僅僅停留在實(shí)驗(yàn)預(yù)想階段。本發(fā)明人通過漫長而艱苦的篩選實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建出一種雙蛋白表達(dá)盒，這種雙蛋白表 達(dá)盒中所選取的具體調(diào)控序列及其組合，盡管是順序表達(dá)，但是我們發(fā)現(xiàn)，后一個表達(dá)盒也 能高效表達(dá)，可以滿足同時有效表達(dá)兩個蛋白的需要。根據(jù)本發(fā)明人選用的顏色辨識基因，大大方便了規(guī)?；Y選百草枯抗性基因的過程，并最終篩選得到了一個百草枯抗性基因。 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人還發(fā)明了一種利用百草枯篩選轉(zhuǎn)基因植物的新方法，同時獲得具有 百草枯抗性和非百草枯抗性的另一抗性的轉(zhuǎn)基因植物，也方便了規(guī)?；Y選，同時排除了 已經(jīng)被要求或潛在將被要求不能出現(xiàn)在產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的抗抗生素基因的使用，具有很大的實(shí)際 應(yīng)用價值和市場推廣前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物的規(guī)?；Y選的雙蛋白表達(dá)的表達(dá) 盒以及基于該表達(dá)盒的載體、規(guī)?；Y選百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物和規(guī)?；Y選百草枯抗 性和非百草枯抗性的抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法。這些產(chǎn)品和方法大大方便了篩選操作，從 而可以規(guī)?；瘧?yīng)用，并且可以滿足同時有效表達(dá)兩個蛋白的需要，尤其是在順序表達(dá)時后 一個表達(dá)盒也能高效表達(dá)；這些產(chǎn)品和方法還可以排除已經(jīng)被要求或潛在將被要求不能出 現(xiàn)在產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的抗生素基因的使用。另外，本發(fā)明還涉及各種中間產(chǎn)物，如檢測引物對，用 于檢測轉(zhuǎn)基因植物中的異源蛋白。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物的規(guī)模 化篩選的雙蛋白表達(dá)的表達(dá)盒，其依次包括第一啟動子、目標(biāo)基因、第一表達(dá)終止序列、第 二啟動子、潛在的百草枯抗性基因、和第二表達(dá)終止序列。優(yōu)選其中，第一啟動子、目標(biāo)基 因、和第一表達(dá)終止序列之間沒有其他序列；也優(yōu)選其中，第二啟動子、潛在的百草枯抗性 基因、和第二表達(dá)終止序列之間沒有其他序列。第一表達(dá)終止序列和第二啟動子之間可以 有額外的序列，也可以沒有額外的序列。我們發(fā)現(xiàn)，即使在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，第一 表達(dá)終止序列和第二啟動子之間有啟動子這樣的調(diào)控序列而且其方向是與第一啟動子和 第二啟動子相反的，但是也沒有干擾蛋白的表達(dá)，仍舊可以滿足同時有效表達(dá)兩個蛋白的 需要。優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，對于調(diào)控序列，第一啟動子和第二啟動子可以是相 同的，也可以是不同的，優(yōu)選是相同的，例如，可以都是CaMV35S啟動子；第一表達(dá)終止序列 和第二表達(dá)終止序列可以是相同的，也可以是不同的，優(yōu)選是不同的，例如在本發(fā)明的具體 實(shí)施方式中，第一表達(dá)終止序列是T-NOS多聚腺苷酸(簡稱為T-NOS polyA)以及第二表達(dá) 終止序列是CaMV 3’非翻譯區(qū)(簡稱為CaMV 3’ UTR)，如來源于市售的pCAMBIA1303質(zhì)粒 中的CaMV 3'UTR0我們發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選的調(diào)控序列及其組合能夠使目標(biāo)基因和潛在的百草枯抗 性基因同時得到有效表達(dá)，實(shí)現(xiàn)相應(yīng)作用。在本發(fā)明的第一方面中，特別優(yōu)選的技術(shù)方案是，目標(biāo)基因可以是篩選標(biāo)記基因， 如顏色辨識基因。由于植物體或其組織通常呈現(xiàn)綠色，因此優(yōu)選目標(biāo)基因是非綠顏色辨識 基因，這樣可以清晰表現(xiàn)出基因的表達(dá)。進(jìn)一步地，目標(biāo)基因優(yōu)選是熒光蛋白編碼基因，更 優(yōu)選是紅色熒光蛋白編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。由于目標(biāo)基因是篩選標(biāo) 記基因，可以用于輔助百草枯抗性基因的篩選，以顯色的方式方便地從大規(guī)模篩選中辨識 出在含有百草枯的培養(yǎng)基中生長的植物帶有百草枯抗性基因，并根據(jù)顏色的深淺判斷表達(dá) 量。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明人以紅色熒光蛋白編碼基因作為目標(biāo)基因，極大地 方便了辨識，規(guī)模化篩選出特定的百草枯抗性基因。因此，更優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中， 潛在的百草枯抗性基因是百草枯抗性基因，優(yōu)選是pqrK2，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所不。以得到的百草枯抗性基因作為篩選標(biāo)記基因，在本發(fā)明的第一方面中，另外優(yōu)選 的技術(shù)方案是，目標(biāo)基因是非百草枯抗性的抗性基因，優(yōu)選是非百草枯抗性的另一種農(nóng)藥 或除草劑抗性基因，如草丁膦抗性，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。由于本發(fā)明優(yōu)選的 調(diào)控序列及其組合能夠使目標(biāo)基因和潛在的百草枯抗性基因同時得到有效表達(dá)，因此這兩 種抗性基因能夠同時得到有效表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，在多種有代表性的植物 中，采用本發(fā)明的表達(dá)盒導(dǎo)入的兩種抗性基因能使轉(zhuǎn)基因植物有效地獲得這兩種抗性。在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于植物轉(zhuǎn)化的載體，其中包含本發(fā)明第一方面 所述的表達(dá)盒。本文中所采用的術(shù)語“載體”是生物學(xué)領(lǐng)域的常用術(shù)語，其中通常帶有可在 不同宿主中復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)以及抗抗生素基因。本領(lǐng)域常用的用于植物轉(zhuǎn)化研究的載 體有許多，如市售的pCAMBIA系列載體、PBI系列載體、Pbin系列載體、以及Gateway載體， 這些載體基本上需要帶有抗抗生素基因。例如，PCAMBIA1300的篩選標(biāo)記基因?yàn)镠PT，產(chǎn)生 潮霉素抗性；PCAMBIA2300的篩選標(biāo)記基因?yàn)镹PTII，產(chǎn)生卡那霉素抗性?？箍股鼗蛟?產(chǎn)業(yè)化(產(chǎn)品化)的轉(zhuǎn)基因植物中的使用有著很大的技術(shù)爭議，因此已經(jīng)被要求或者潛在 將被要求不能出現(xiàn)在產(chǎn)業(yè)化(產(chǎn)品化)的轉(zhuǎn)基因植物中，不適合用于實(shí)際產(chǎn)業(yè)的植物轉(zhuǎn)化。 因此，優(yōu)選用本發(fā)明第一方面所述的表達(dá)盒或其部分(如，潛在的百草枯抗性基因)替換用 于植物轉(zhuǎn)化研究的載體中的抗抗生素基因，如在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，PCAMBIA1300的 HPT基因被置換成pqrK2基因。因此，優(yōu)選在本發(fā)明的第二方面中，本發(fā)明提供了一種用于 植物轉(zhuǎn)化的載體，其中包含本發(fā)明第一方面所述的表達(dá)盒，而且其中不含有潮霉素抗性基 因；最優(yōu)選所述載體是pCAMKT1300-Asred或pCAMKT1300-bar，其質(zhì)粒圖譜分別如圖1或圖 2所示。在第三方面，本發(fā)明提供了一種規(guī)?；Y選百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其 包括，使用包含本發(fā)明第一方面中特別優(yōu)選的技術(shù)方案所述的表達(dá)盒的用于植物轉(zhuǎn)化的載 體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物愈傷組織或植物體，將該植物愈傷組織或植物體培養(yǎng)于含有百 草枯的環(huán)境中，然后挑選生長呈現(xiàn)非綠色的植物愈傷組織或植物體，其中，所述植物愈傷組 織或植物體本身呈現(xiàn)綠色。百草枯可以施加在培養(yǎng)基中。但是，更優(yōu)選在本發(fā)明第三方面 中，所述環(huán)境中的百草枯是用噴灑或涂抹百草枯的方式引入環(huán)境的，即將百草枯噴灑或涂 抹植物愈傷組織或植物體上，可以噴灑或涂抹在植物愈傷組織或植物體的全部上，也可以 噴灑或涂抹在植物愈傷組織或植物體的部分(如，葉片)上。。在第四方面，本發(fā)明提供了一種規(guī)?；Y選百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的 轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括，使用包含本發(fā)明第一方面中另外優(yōu)選的技術(shù)方案所述的表達(dá) 盒的用于植物轉(zhuǎn)化的載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物愈傷組織或植物體，將所述植物愈傷組 織或植物體培養(yǎng)于含有百草枯的環(huán)境中，然后挑選生長的植物愈傷組織或植物體。其中，優(yōu) 選非百草枯抗性的抗性是草丁膦抗性。百草枯和/或草丁膦可以施加在培養(yǎng)基中。但是， 更優(yōu)選在本發(fā)明第四方面中，所述環(huán)境中的百草枯和/或草丁膦是用噴灑或涂抹百草枯的 方式引入環(huán)境的，即將百草枯和/或草丁膦噴灑或涂抹植物愈傷組織或植物體上，可以噴 灑或涂抹在植物愈傷組織或植物體的全部上，也可以噴灑或涂抹在植物愈傷組織或植物體 的部分(如，葉片)上。優(yōu)選在本發(fā)明的第三和/或第四方面中，所述植物是雙子葉植物或單子葉植物，其中雙子葉植物優(yōu)選是大豆、擬南芥、棉花或油菜，其中單子葉植物優(yōu)選是水稻、小麥、玉 米、高粱或谷子，優(yōu)選所述植物是水稻。優(yōu)選在本發(fā)明的第三和/或第四方面中，所述環(huán)境中用于植物愈傷組織的百草枯 的濃度為0. 2 20uM，優(yōu)選為1 5uM，最優(yōu)選為IuM ；所述環(huán)境中用于植物葉片和/或整個 植株的百草枯的濃度為10 800uM，更優(yōu)選為100 200uM。另外優(yōu)選在本發(fā)明的第三和 /或第四方面中，培養(yǎng)植物愈傷組織或植物體的培養(yǎng)基是用于植物愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基， 優(yōu)選不是用于植物分化和生根階段的培養(yǎng)基，優(yōu)選用于植物分化和生根階段的培養(yǎng)基不含 百草枯。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要 特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改 變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是 為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像它們的全文已 經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復(fù)敘述過一樣。


圖1為pCAMKT1300_Asred載體示意圖譜。圖2為pCAMKT1300_bar載體示意圖譜。圖3為百草枯篩選-Asred水稻愈傷的結(jié)果。圖4為百草枯篩選pCAMKT1300-Asred陽性植株的PCR檢測結(jié)果。其中-是野生 型負(fù)對照，M是分子量標(biāo)記，1 4是檢測的4個株系。圖5為轉(zhuǎn)pCAMKT1300_bar的Tl代擬南芥對百草枯和草丁膦抗性表現(xiàn)。其中A代 表用IOOuM的百草枯噴灑2天后的結(jié)果；B代表擬南芥用百草枯篩選1周后噴灑草丁膦的結(jié)果。圖6為百草枯篩選得到的pCAMKT1300_bar的Tl代擬南芥的PCR檢測。其中-是 野生型負(fù)對照，H20是PCR體系的負(fù)對照；M是分子量標(biāo)記，1 4是檢測的4個株系。圖7為用草丁膦涂抹pCAMKT1300_bar大豆TO代陽性植株的結(jié)果，該陽性植株用 IOOuM百草枯篩選得到。其中用筆標(biāo)注的黑圈為草丁膦涂抹的范圍。圖8為百草枯篩選篩選得到的TO代大豆陽性株系的PCR檢測結(jié)果。其中-是野 生型負(fù)對照，M是分子量標(biāo)記，1 4是檢測的4個株系。圖9為用草丁膦涂抹pCAMKT1300_bar棉花TO代陽性植株的結(jié)果，該陽性植株用 IOOuM百草枯篩選得到。其中用筆標(biāo)注的黑圈為草丁膦涂抹的范圍。圖10為百草枯篩選篩選得到的TO代棉花陽性株系的PCR檢測結(jié)果。其中-是野 生型負(fù)對照，M是分子量標(biāo)記，1 7是檢測的7個株系。圖11為用草丁膦涂抹pCAMKT1300_bar小麥TO代陽性植株的結(jié)果，該陽性植株用 IOOuM百草枯篩選得到。其中用筆標(biāo)注的地方至葉尖為草丁膦涂抹的范圍。圖12為百草枯篩選得到的pCAMKT1300_bar的TO代小麥的PCR檢測。其中-是 野生型負(fù)對照，H20是PCR體系的負(fù)對照；M是分子量標(biāo)記，1 4是檢測的4個株系。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常用分子生物學(xué)、組織培養(yǎng)技術(shù)和農(nóng) 學(xué)手冊所記載的方法。具體步驟可參見《Molecular Cloning =A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell, David W. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限 公司合成。實(shí)施例1 紅色熒光蛋白-抗百草枯植物雙價表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)SEQ ID NO :1命名為pqrK2基因序列，設(shè)計(jì)引物時引入Bio I酶切位點(diǎn)，引物 序列如下引物1和引物2所示引物 1 :5，-CTCGAG ATGAACCCTTATATTTATCTTG-3，引物 2 :5，-CTCGAG TTAATGTGGTGTGCTTCG-3，用引物1和引物2進(jìn)行對pqrK2基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用Bio I酶酶切，得 到插入片段；取PCAMBIA1303 (購自Cambia公司)用Β ο I酶酶切，切掉潮霉素抗性基因， 將酶切過的載體去磷酸化，然后用連接酶連接上述插入片段和去磷酸化的載體，將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的2 X YT培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性 克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測序選擇出正向插入CaMV35S啟動子后的克隆，得具有百草枯抗性的 質(zhì)粒,命名為pCAMKT1300。人工合成兩端分別帶有HindIII和I^st I酶切位點(diǎn)的CaMV35S啟動子序列(參見 SEQ IDNO :3)，用HindIII和Pst I酶分別雙酶切pCAMKT1300載體和人工合成的CaMV35S序 列，將人工合成的CaMV35S片段和酶切處理好的pCAMKT1300載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的2 X YT培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測 序無誤后，命名為pCAMKT 1300-3 。同樣，人工合成兩端帶有EcoR I和Ml I酶切位點(diǎn)的T_N0S ρIoyA序列(參見 SEQ IDNO :4)。用 EcoR I 和 Sal I 分別雙酶切人工合成的 T-N0S polyA 和 pCAMKT1300_3k 載體，將酶切好pCAMKT 1300-3 和T-NOS ρIoyA連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有 50mg/L卡那霉素的2ΧΥΤ培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測序無誤后，命 名為 pCAMKT1300-35s-N0S。根據(jù)熒光蛋白基因AsRED的基因序列(參見SEQ ID NO 2)設(shè)計(jì)引物3和引物4，在 AsRED序列兩端分別引入I3StIjamHI酶切位點(diǎn)，以pAsred載體(購自invitrogen公司)為 模板擴(kuò)增紅色熒光蛋白核苷酸片段，用I3StI和BamHI雙酶切，同時用I^stI和BamHI雙酶切 載體上述的pCAMKT1300-3k-N0S，瓊脂糖凝膠電泳回收Asred片段和pCAMKT1300_3k_N0S 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的2 X YT培養(yǎng)基經(jīng)篩選 后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測序插入無誤后得具有紅色熒光蛋白活性和百草枯抗性的 質(zhì)粒，命名為pCAMKT1300-Asred(pCAMKT1300-Asred圖譜見附圖1)。引物3和引物4的序 列如下引物 3 :5，-CTGCAG ATGGCCTCTTTGCTGAAGAA-3，引物 4 :5，-GGATCC TCAGTTGTGGCCCAGCT-3，實(shí)施例2 用百草枯篩選水稻轉(zhuǎn)化 1，用pCAMKT1300-Asred作為表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL0，具體過程可參見((MolecularCloning -Λ Laboratory Manual)) (Sambrook, J. ,Russell,David W. ,Molecular Cloning =ALaboratory Manual, 3rd edition, 2001,NY, Cold Spring Harbor)手冊。轉(zhuǎn)化了 pCAMKT1300-Asred的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)過程如下初步培養(yǎng)在轉(zhuǎn)化了 pCAMKT1300-Asred的農(nóng)桿菌的單菌落平板上，挑取3 6個 菌落，分別置于YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm/min, 條件下培養(yǎng)16 20小時，使菌液濃度 達(dá)到0D600 = 1.6左右。擴(kuò)大培養(yǎng)取初步培養(yǎng)的菌液，按1 15-1 20的體積比例將初步培養(yǎng)的菌液在 加好卡那霉素的YEB液體中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為200rpm/minJ8°C搖2. 5-3小時左右，當(dāng) 0D600值在0. 3-0. 4即停止培養(yǎng)。4°C下，3000rpm/min離心IOmin離心收集菌體，棄除上清液。菌體重懸于AA液 (AA液的配方為:100ml AA液中加150vl生長素類似物2,4-D(2mg/ml)，IOvl細(xì)胞分裂素 KT(2mg/ml)及Iml乙酰丁香酮AS ^ng/ml))中。該培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌AGLO用于下面的水稻
轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。2.用百草枯為篩選劑進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，其具體步驟請參見《Plant Propagation by TissueCulture)) (Edwin F. George, Michael A. Hall, Geert-Jan De Klerk, Springer 2008)，因我們研究發(fā)現(xiàn)，百草枯影響水稻愈傷組織的分化，因此在具體步驟中的以下兩個 步驟有改動(1)將共培養(yǎng)后的愈傷組織放在含百草枯的篩選培養(yǎng)基中，篩選培養(yǎng)基中百草枯 的使用濃度為luM。(2)在分化和生根階段時，培養(yǎng)基中不添加百草枯。目標(biāo)載體含有pCAMKT1300-Asred目的基因紅色熒光蛋白基因，其高表達(dá)會產(chǎn)生 紅色熒光，使水稻的愈傷變成紅色，在用百草枯篩選水稻愈傷的過程中，經(jīng)我們此后進(jìn)一步 檢測發(fā)現(xiàn)，得到的所有轉(zhuǎn)入pqrK2基因序列(即pqrK2陽性)的愈傷組織全部呈現(xiàn)為紅色 (見附圖1)，這說明百草枯對水稻愈傷轉(zhuǎn)化法具有很好的篩選效果，并且使用紅色熒光蛋 白基因能夠容易地判斷出pqrK2基因是否導(dǎo)入到植物中并判斷是否帶來了百草枯抗性以 及抗性強(qiáng)度，該易辨識性非常適用于大規(guī)模的轉(zhuǎn)化篩選。3.水稻轉(zhuǎn)基因陽性苗的進(jìn)一步檢測對上述篩選得到的TO代水稻轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行PCR檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)基因成 功。根據(jù)Asred基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系的陽性。每株取一 片新葉用CTAB法提取植物基因組DNA。根據(jù)Asred基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物5和6
引物 5 5，-CCAGGAGATGAAGATCGAGG-3，引物 6 5，-GCGGCCTCGTACTGCTTGTA-3，分別利用引物5和引物6，以抗性植株基因組DNA模板，PCR擴(kuò)增Asred基因片段。 反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到大約500bp的目的片 段。我們對100個株系進(jìn)行了 PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果全部呈陽性，部分檢測結(jié)果見附圖2。這進(jìn)一 步證明了我們獲得的抗性植株為轉(zhuǎn)基因陽性株系，用百草枯作為篩選劑并用紅色熒光蛋白 作為標(biāo)記觀察，其轉(zhuǎn)基因陽性篩選率為100%。實(shí)施例3 用百草枯篩選擬南芥轉(zhuǎn)基因苗1.抗草丁膦、抗百草枯植物雙價表達(dá)載體的構(gòu)建
人工合成兩端帶有I3StI和BamHI酶切位點(diǎn)的bar基因序列(參見SEQ ID NO 5)，用Pst I和BamH I酶雙酶切人工合成的bar和pCAMKT1300-3k_N0S載體，將酶切好 pCAMKT1300-35s-N0S和bar連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的 2XYT培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒經(jīng)測序無誤后，命名為pCAMKT1300-bar， 作為表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGLO用于下面的植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。2. pCAMKT1300-bar 載體轉(zhuǎn)化擬南芥挑取轉(zhuǎn)化了 pCAMKT1300-bar的農(nóng)桿菌單菌落接種到裝有3mlYEB的培養(yǎng)基中。 在^°C、200-220rpm速度下振蕩培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0. 6。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液按照 3 1000的比例接種到IL的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0. 7 0. 8。按照如下配方配制懸浮培養(yǎng)基，每IL培養(yǎng)基中加入2. 15g的MS鹽(購自Sigma 公司)，50g的蔗糖，200ul的表面活性劑silwet。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌離心后用配置好的懸 浮培養(yǎng)基重懸。重懸好的菌液待用。轉(zhuǎn)化前一天將需要做轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥苗子澆水澆透，先將澆透水用于轉(zhuǎn)化的 擬南芥苗的果莢全部剪掉，再用寬膠帶把花盆的土封好。將懸浮菌液分裝在50ml的燒杯 中，把待轉(zhuǎn)化擬南芥倒立在燒杯上，使其花序浸在轉(zhuǎn)化液中侵染5分鐘。然后將侵染好的擬 南芥平放，用黑塑料布蓋好，放置18-24小時。轉(zhuǎn)化好的擬南芥收種得到Tl代的轉(zhuǎn)基因種子。3.百草枯篩選Tl代擬南芥轉(zhuǎn)基因苗因pCAMKT1300_bar載體的篩選標(biāo)記基因是百草枯抗性基因pqrK2，使轉(zhuǎn)基因陽性 苗具百草枯抗性，所以我們用百草枯作為篩選劑對Tl代的種子進(jìn)行篩選。將收獲的Tl代 轉(zhuǎn)基因種子種在土中，剛剛長出兩天真葉時，噴灑IOOuM的百草枯。2天后，未轉(zhuǎn)基因的擬南 芥苗枯死，轉(zhuǎn)基因陽性苗生長狀態(tài)良好。因pCAMKT1300-bar載體的目的基因是bar，轉(zhuǎn)基因 陽性苗具草丁膦抗性。為了進(jìn)一步檢測百草枯的篩選效率，我們將篩選得到的Tl代轉(zhuǎn)基因 擬南芥陽性苗培養(yǎng)一周后，按照1 1000的比例噴灑草丁膦，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有百草枯篩選得 到的Tl代轉(zhuǎn)基因陽性苗均具草丁膦抗性，這說明百草枯是一種快速有效的篩選劑。結(jié)果見 附圖3。4.擬南芥Tl代轉(zhuǎn)基因陽性苗的PCR檢測為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述得到的擬南芥Tl代苗，我們進(jìn)行了分子水平上的檢測。根據(jù) bar基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系的陽性。每株取兩片嫩葉，用 CTAB法提取植物基因組DNA。根據(jù)bar基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物序列如下引物 7 (上游)5' CATCAGATCTCGGTGACGG 3'引物 8 (下游)5 ‘ TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3 ‘分別利用引物7和引物8，以抗性植株基因組DNA模板，擴(kuò)增bar基因片段。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到450bp的目的片段(結(jié)果見附圖4)。我 們對11個株系進(jìn)行了 PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果全部呈陽性。這進(jìn)一步證明了我們獲得的抗性植株為 轉(zhuǎn)基因陽性株系，百草枯是一種快速高效的篩選劑。實(shí)施例4 用百草枯篩選大豆轉(zhuǎn)基因苗1. pCAMKT 1300-bar 載體轉(zhuǎn)化大豆挑取轉(zhuǎn)化了 pCAMKT 1300-bar的農(nóng)桿菌單菌落接種到裝有3mlYEB的培養(yǎng)基中。在^°C、200-220rpm速度下振蕩培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0. 6。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液按照 3 1000的比例接種到IL的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0. 7 0. 8。按照如下配方配制懸浮培養(yǎng)基，每IL培養(yǎng)基中加入2. 15g的MS鹽(購自Sigma 公司)，蔗糖(50g)，表面活性劑silwet OOOul)，細(xì)胞分裂素KT (0.2mg)；生長素類似物2， 4-D(Img) ；二硫蘇糖醇DTT(ImM) ；L-半胱氨酸L-Cysteine Q(K) 400mg)。將培養(yǎng)好的農(nóng) 桿菌離心后用配置好的懸浮培養(yǎng)基重懸。重懸好的菌液待用?？v切大豆的幼苗用重懸好的 菌液進(jìn)行轉(zhuǎn)化。2.百草枯篩選TO代大豆轉(zhuǎn)基因苗因pCAMKT1300_bar載體的篩選標(biāo)記基因是百草枯抗性基因pqrK2，使轉(zhuǎn)基因陽性 苗具百草枯抗性，所以我們用百草枯作為篩選劑對TO代的大豆苗進(jìn)行篩選。用50um的百 草枯涂抹大豆苗的新生復(fù)葉，2天后，非轉(zhuǎn)基因大豆葉片涂抹百草枯的部位表現(xiàn)為枯死，而 轉(zhuǎn)基因大豆的葉片生長良好。為了進(jìn)一步檢測百草枯的篩選效果，我們將得到的陽性植株 用草丁膦進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。因pCAMKT1300-bar載體的目的基因是bar，轉(zhuǎn)基因陽性苗具 有草丁膦抗性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有百草枯篩選得到的TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗均具草丁膦抗性，這說 明百草枯是一種快速有效的篩選劑。結(jié)果見附圖5。3.大豆TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗的PCR檢測為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述得到的大豆TO代苗，我們進(jìn)行了分子水平上的檢測。根據(jù) bar基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系的陽性。每株取一片新展開的 葉片采用CTAB法提取植物基因組DNA。根據(jù)bar基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物序列如下引物 7 (上游)5 ‘ CATCAGATCTCGGTGACGG 3 ‘引物 8 (下游)5 ‘ TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3 ‘分別利用引物7和引物8，以抗性植株基因組DNA模板，擴(kuò)增bar基因片段。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到450bp的目的片段(結(jié)果見附圖6)。我 們對株系進(jìn)行了 PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果全部呈陽性。這進(jìn)一步證明了我們獲得的抗性植株為轉(zhuǎn)基 因陽性株系，百草枯是一種快速高效的篩選劑。實(shí)施例5 用百草枯篩選棉花轉(zhuǎn)基因苗1. pCAMKT1300-bar 載體轉(zhuǎn)化棉花挑取轉(zhuǎn)化了 pCAMKT1300-bar的農(nóng)桿菌單菌落接種到裝有3mlYEB的培養(yǎng)基中。 在^°C、200-220rpm速度下振蕩培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0. 6。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液按照 3 1000的比例接種到IL的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0. 7 0. 8。按照如下配方配制懸浮培養(yǎng)基，每IL培養(yǎng)基中加入2. 15g的MS鹽(購自Sigma 公司)，蔗糖(50g)，表面活性劑silwet OOOul)，細(xì)胞分裂素KT (0.2mg)；生長素類似物2， 4-D(Img) ；二硫蘇糖醇DTT(ImM) ；L-半胱氨酸L-Cysteine Q(K) 400mg)。將培養(yǎng)好的農(nóng) 桿菌離心后用配置好的懸浮培養(yǎng)基重懸。重懸好的菌液待用。用重懸好的菌液轉(zhuǎn)化棉花。2.百草枯篩選TO代棉花轉(zhuǎn)基因苗因pCAMKT1300_bar載體的篩選標(biāo)記基因是百草枯抗性基因pqrK2，使轉(zhuǎn)基因陽性 苗具百草枯抗性，所以我們用百草枯作為篩選劑對TO代的棉花苗進(jìn)行篩選。用50um的百 草枯涂抹棉花苗的新葉，2天后，非轉(zhuǎn)基因大棉花葉片涂抹百草枯的部位表現(xiàn)為枯死，而轉(zhuǎn) 基因棉花的葉片生長良好。為了進(jìn)一步檢測百草枯的篩選效果，我們將得到的陽性植株用草丁膦進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。因pCAMKT1300-bar載體的目的基因是bar，轉(zhuǎn)基因陽性苗具有 草丁膦抗性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有百草枯篩選得到的TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗均具草丁膦抗性，這說明 百草枯是一種快速有效的篩選劑。結(jié)果見附圖7。3.棉花TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗的PCR檢測為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述得到的棉花TO代苗，我們進(jìn)行了分子水平上的檢測。根據(jù) bar基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系的陽性。每株取一片新展開的 葉片采用CTAB法提取植物基因組DNA。根據(jù)bar基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物序列如下引物 7 (上游)5 ‘ CATCAGATCTCGGTGACGG 3 ‘引物 8 (下游)5 ‘ TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3 ‘分別利用引物7和引物8，以抗性植株基因組DNA模板，擴(kuò)增bar基因片段。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到450bp的目的片段(結(jié)果見附圖8)。我 們對株系進(jìn)行了 PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果全部呈陽性。這進(jìn)一步證明了我們獲得的抗性植株為轉(zhuǎn)基 因陽性株系，百草枯是一種快速高效的篩選劑。實(shí)施例6 用百草枯篩選小麥轉(zhuǎn)基因苗1. pCAMKT1300-bar 載體轉(zhuǎn)化小麥挑取轉(zhuǎn)化了 pCAMKT1300-bar的農(nóng)桿菌單菌落接種到裝有3mlYEB的培養(yǎng)基中。 在^°C、200-220rpm速度下振蕩培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0. 6。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液按照 3 1000的比例接種到IL的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0. 7 0. 8。按照如下配方配制懸浮培養(yǎng)基，每IL培養(yǎng)基中加入2. 15g的MS鹽(購自Sigma 公司)，蔗糖(50g)，表面活性劑silwet OOOul)，細(xì)胞分裂素KT (0.2mg)；生長素類似物2， 4-D(Img) ；二硫蘇糖醇DTT(ImM) ；L-半胱氨酸L-Cysteine Q(K) 400mg)。將培養(yǎng)好的農(nóng) 桿菌離心后用配置好的懸浮培養(yǎng)基重懸。重懸好的菌液待用?？v切小麥幼苗的葉基座，用 上述的重懸菌液進(jìn)行轉(zhuǎn)化。2.百草枯篩選TO代小麥轉(zhuǎn)基因苗因pCAMKT1300_bar載體的篩選標(biāo)記基因是百草枯抗性基因pqrK2，使轉(zhuǎn)基因陽性 苗具百草枯抗性，所以我們用百草枯作為篩選劑對TO代的小麥苗進(jìn)行篩選。用50um的百 草枯涂抹小麥的新葉，2天后，非轉(zhuǎn)基因大小麥葉片涂抹百草枯的部位表現(xiàn)為枯死，而轉(zhuǎn)基 因小麥的葉片生長良好。為了進(jìn)一步檢測百草枯的篩選效果，我們將得到的陽性植株用草 丁膦進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。因pCAMKT1300-bar載體的目的基因是bar，轉(zhuǎn)基因陽性苗具有草 丁膦抗性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有百草枯篩選得到的TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗均具草丁膦抗性，這說明百 草枯是一種快速有效的篩選劑。結(jié)果見附圖9。3.小麥TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗的PCR檢測為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述得到的小麥TO代苗，我們進(jìn)行了分子水平上的檢測。根據(jù) bar基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系的陽性。每株取一片新展開的 葉片采用CTAB法提取植物基因組DNA。根據(jù)bar基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物序列如下引物 7 (上游)5 ‘ CATCAGATCTCGGTGACGG 3 ‘引物 8 (下游)5 ‘ TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3 ‘分別利用引物7和引物8，以抗性植株基因組DNA模板，擴(kuò)增bar基因片段。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到450bp的目的片段(結(jié)果見附圖10)。我們對株系進(jìn)行了 PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果全部呈陽性。這進(jìn)一步證明了我們獲得的抗性植株為轉(zhuǎn)基 因陽性株系，百草枯是一種快速高效的篩選劑。
權(quán)利要求
1.一種用于百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物的規(guī)?；Y選的雙蛋白表達(dá)的表達(dá)盒，其依次包 括第一啟動子、目標(biāo)基因、第一表達(dá)終止序列、第二啟動子、潛在的百草枯抗性基因、和第二 表達(dá)終止序列。
2.權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中潛在的百草枯抗性基因是百草枯抗性基因，優(yōu)選是 pqrK2，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中目標(biāo)基因是非綠顏色辨識基因，優(yōu)選是熒光蛋白編 碼基因，更優(yōu)選是紅色熒光蛋白編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
4.權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中目標(biāo)基因是非百草枯抗性的抗性基因，優(yōu)選是草丁 膦抗性，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
5.一種用于植物轉(zhuǎn)化的載體，其中包含權(quán)利要求1-4至任一所述的表達(dá)盒，優(yōu)選其中 不含有潮霉素抗性基因。
6.權(quán)利要求5所述的載體，其是pCAMKT1300-Asred或pCAMKT1300_bar。
7.一種規(guī)?；Y選百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括，使用包含權(quán)利要求3所 述的表達(dá)盒的用于植物轉(zhuǎn)化的載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物愈傷組織或植物體，將該植物 愈傷組織或植物體培養(yǎng)于含有百草枯的環(huán)境中，然后挑選生長呈現(xiàn)非綠色的植物愈傷組織 或植物體，其中，所述植物愈傷組織或植物體本身呈現(xiàn)綠色，優(yōu)選所述環(huán)境中的百草枯是用 噴灑或涂抹百草枯的方式引入環(huán)境的。
8.一種規(guī)?；Y選百草枯抗性和非百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括，使用包 含權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒的用于植物轉(zhuǎn)化的載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物愈傷組織或 植物體，將所述植物愈傷組織或植物體培養(yǎng)于含有百草枯的環(huán)境中，然后挑選生長的植物 愈傷組織或植物體，其中，優(yōu)選所述環(huán)境中的百草枯是用噴灑或涂抹百草枯的方式引入環(huán) 境的。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中，所述植物是雙子葉植物或單子葉植物，其中雙子葉植 物優(yōu)選是大豆、擬南芥、棉花或油菜，其中單子葉植物優(yōu)選是水稻、小麥、玉米、高粱或谷子， 優(yōu)選所述植物是水稻。
10.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述環(huán)境中百草枯的濃度為0.2 20uM，優(yōu)選為1 5uM,最優(yōu)選為IuM ；和/或，培養(yǎng)植物愈傷組織或植物體的培養(yǎng)基是用于植物愈傷組織培養(yǎng) 的培養(yǎng)基，優(yōu)選不是用于植物分化和生根階段的培養(yǎng)基，優(yōu)選用于植物分化和生根階段的 培養(yǎng)基不含百草枯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物的規(guī)?；Y選的雙蛋白表達(dá)的表達(dá)盒，其依次包括第一啟動子、目標(biāo)基因、第一表達(dá)終止序列、第二啟動子、潛在的百草枯抗性基因、和第二表達(dá)終止序列。另外，本發(fā)明還提供了基于該表達(dá)盒的載體、規(guī)?；Y選百草枯抗性的轉(zhuǎn)基因植物和規(guī)模化篩選百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
文檔編號C12N15/29GK102061308SQ201010530688
公開日2011年5月18日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者喬琳, 劉軍華, 夏勉, 孔祥鳳, 李毅, 王麗英 申請人:北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司