專利名稱：稻瘟菌MoPPF3基因及其編碼蛋白的功能與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物基因工程和植物保護(hù)領(lǐng)域中控制真菌侵染釘?shù)男纬膳c致病性 的基因及其編碼蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
稻瘟菌(Magnaportheoryzae)屬子囊菌亞門(mén)真菌，能侵染水稻、小麥、大麥等多種禾本科植物，導(dǎo)致瘟病。尤其是該菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各個(gè)栽培稻區(qū)每年 均有發(fā)生，危害廣泛嚴(yán)重。一般情況下，稻瘟病的危害可使水稻減產(chǎn)5-10%，重病田可 導(dǎo)致水稻絕收。稻瘟病在我國(guó)曾多次流行，也是我國(guó)水稻的主要病害之一。
稻瘟菌對(duì)植物的侵染起始于分生孢子。附著在植物葉片的分生孢子萌發(fā)形成芽 管，芽管的頂端依次分化形成附著胞和侵染釘，侵染釘憑借成熟附著胞積累的巨大膨壓 刺透植物表皮細(xì)胞，在植物細(xì)胞內(nèi)形成侵染菌絲，侵染菌絲在植物細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間擴(kuò)展 和定殖，最終在葉片上形成直徑為2-3毫米的灰色或灰褐色病斑，病斑中的侵染性菌絲 穿透植物組織向空中分化形成分生孢子梗，進(jìn)一步形成分生孢子。分生孢子在風(fēng)、雨的 作用下釋放和附著，引起對(duì)植物的再侵染。稻瘟菌從分生孢子附著到分生孢子再產(chǎn)生的 周期一般為3-5天，在植物的生長(zhǎng)季節(jié)，如果條件適宜，能夠多次侵染，對(duì)植物造成嚴(yán) 重危害。侵染釘?shù)男纬稍诘疚辆那秩具^(guò)程中必不可少，侵染釘?shù)挠袩o(wú)決定稻瘟菌能否 侵入植物內(nèi)部組織細(xì)胞，進(jìn)而完成侵染循環(huán)并造成危害；而侵染釘形成率的高低，決定 稻瘟病的危害程度。如果能阻斷侵染釘?shù)男纬?，就可以控制稻瘟病的發(fā)生或者減小稻瘟 病的危害程度。因此，研究稻瘟菌侵染釘形成的分子機(jī)理不僅有助于揭示稻瘟菌及相關(guān) 絲狀真菌致病性的分子機(jī)制，而且對(duì)于研發(fā)控制包括稻瘟病在內(nèi)的植物真菌病害的藥劑 具有重要應(yīng)用價(jià)值。
從附著胞的形成、成熟到侵染釘?shù)男纬墒且粋€(gè)精細(xì)調(diào)節(jié)的過(guò)程，該過(guò)程由細(xì)胞 循環(huán)調(diào)控，且與分生孢子的自噬死亡相關(guān)聯(lián)，需要不少基因的參與。但是目前有關(guān)此方 面的基因克隆與分子機(jī)理的報(bào)道比較少。鑒定這些基因，解析它們的分子功能及其對(duì)稻 瘟菌致病性的影響，有可能從中發(fā)現(xiàn)可以作為殺菌劑靶標(biāo)的蛋白，為開(kāi)發(fā)控制稻瘟病及 其它植物真菌病害的高效藥劑奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供真菌侵染釘形成與致病性的必需的一個(gè)新基因及其編碼 的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所提供的真菌侵染釘形成與致病性必需的基因來(lái)源于稻瘟菌，名稱為 MoPPF3,可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列；序列表中的SEQ ID Na 1由3118個(gè) 堿基組成，包括基因的啟動(dòng)子區(qū)域和編碼區(qū)。MoPPF3編碼區(qū)有2個(gè)外顯子，分別位于 SEQID Na 1的5'端第1501位至1867位堿基之間、和第1958位至2628位堿基之間；5'端第1位至1500位堿基為啟動(dòng)子序列。
2)序列表中SEQ IDNo 3蛋白質(zhì)氨基酸序列的多核苷酸編碼序列；
3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID N2 1限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列；
4)與序列表中SEQ IDNo 1限定的DNA序列具有80%以上同源性，且編碼相 同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
MoPPF3基因的eDNA也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，可具有下述核苷酸序列之
1)序列表中SEQ IDNa 2的DNA序列，由1038個(gè)堿基組成，
2)編碼序列表中SEQ IDNo 3蛋白質(zhì)氨基酸序列的多核苷酸序列；
3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID N2 2限定的DNA序列雜交的多核苷 酸序列；
4)與序列表中SEQ IDNo 2限定的DNA序列具有80%以上同源性，且編碼相 同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)，0.1% SDS的溶液中，在65°C 下雜交并洗膜。
利用MOPPF3基因的啟動(dòng)子、編碼區(qū)序列構(gòu)建的表達(dá)載體以及通過(guò)該載體轉(zhuǎn)化 獲得的細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
以MOPPF3基因中任一區(qū)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)PCR擴(kuò)增用于檢測(cè) 在化合物處理狀況下MoPPF3基因的表達(dá)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
MoPPF3基因編碼的蛋白質(zhì)ΜαΡρβ也屬于該發(fā)明的保護(hù)范圍，是具有下述氨基 酸序列之一的蛋白質(zhì)
1)序列表中的SEQ IDNo 3 ；其序列由345個(gè)氨基酸組成。
2)將序列表中SEQ IDNo 3的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加且與真菌菌絲生長(zhǎng)或分生孢子產(chǎn)生和致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)。所述一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加。
以ΜαΡρβ或與其有40%或以上一致性的同源蛋白中任一區(qū)域的氨基酸序列設(shè)計(jì) 多肽，并制備抗體用于檢測(cè)在化合物處理狀況下ΜαΡρβ蛋白的表達(dá)也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。
本發(fā)明證明了 MoPPF3基因的突變或缺失導(dǎo)致稻瘟菌侵染釘形成率和致病性顯 著降低。說(shuō)明MoPPF3基因是稻瘟菌引起水稻稻瘟病所必需的基因。因此，篩選能夠阻 止該基因表達(dá)與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與定位的化合物，可以有效控制稻瘟菌分生孢子 的產(chǎn)生和水稻稻瘟病的發(fā)生，可以作為新型殺菌劑的候選新藥物直接利用。也就是說(shuō)， 本發(fā)明所提供的MoPPF3的一個(gè)重要用途是，該基因的表達(dá)與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與 定位可以作為重要候選靶位點(diǎn)用于抗真菌藥劑(特別是抗稻瘟菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。 進(jìn)一步解析該基因參與的侵染釘形成的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從中也可以發(fā)現(xiàn)候選靶位點(diǎn)用于 抗真菌藥劑(特別是抗稻瘟菌藥劑)的篩選和設(shè)計(jì)中。此外，也可以以該基因核苷酸序 列的某一區(qū)段作為探針或作為PCR引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)在稻瘟菌中再分離該序列，也可以用于篩選、分離其它真菌的與該基因具有一定序列同源性的序列。



附圖1.野生型菌株P(guān)131與突變體^ 5087侵染釘形成情況的比較。野生型菌株 P131和突變體MS5087的分生孢子分別接種洋蔥表皮細(xì)胞，黑暗保濕培養(yǎng)M小時(shí)，顯微 鏡下觀察并比較侵染釘?shù)男纬蔂顩r。圖中白色箭頭所指為侵染釘，標(biāo)尺為25微米。
附圖2.突變體λ 5087中外援插入標(biāo)記潮霉素抗性基因在MoPPF3基因中插入位 置示意圖。倒三角所指為外援插入標(biāo)記潮霉素抗性基因的插入位點(diǎn)。
附圖3.基因MoPPF3的敲除。A)敲除策略示意圖。左臂正、反向引物分別為u pf(5，-CACTAGTCGTCATCGTATCGAC-3，，5，端含 SpeI 酶切位點(diǎn))和 upr (5，-CGA ATTCAATGGGTATTTGATC-3，，5，端含:EcoRI酶切位點(diǎn))，右臂正、反向引物分別為d ownf(5' -ACTCGAGCATTCATCAGTCCAC-3，，5，端含 XhoI 酶切位點(diǎn))和 downr (5， -AGGTACCGGACAGTTCAAGGTC-3‘，5，端含 KpnI 酶切位點(diǎn))；左、右兩臂的 PCR 擴(kuò)增片段分別用Spe I+EcoR I和Xho Ι+Κρη I消化，按照上下游順序分別連接到pKOV21 載體中潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)的兩側(cè)，構(gòu)成基因置換敲除載體。引物out和hphup 用于PCR正篩選敲除體，引物tef和inr用來(lái)負(fù)篩選敲除體。S代表SacI。B)MoPPF3 敲除體的驗(yàn)證。左圖為MoPPF3敲除體的Southern雜交驗(yàn)證。野生型菌株P(guān)131和敲除 體CD5的基因組DNA分別經(jīng)SacI消化，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以A)中所示的probel為雜 交探針(即敲除載體的右臂)進(jìn)行雜交，野生型P131的雜交帶為2745bp，敲除體CD5的 雜交帶為6534bp。右圖為MoPPF3敲除體的RT-PCR驗(yàn)證。其中P131為野生型，CD5 為MoPPF3的敲除體，CX6為互補(bǔ)體。ACTIN作為內(nèi)參照物。
附圖4.野生型菌株與MoPPF3基因的敲除體侵染釘形成率的比較。野生型菌株 P131和MoPPF3的敲除體CD5的分生孢子分別接種洋蔥表皮細(xì)胞，黑暗保濕培養(yǎng)M小 時(shí)，顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)、比較侵染釘形成情況。左圖為侵染狀況比較，右圖為侵染釘 形成率比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；標(biāo)尺為25微米。
附圖5.野生型菌株與MoPPF3基因的敲除體對(duì)水稻、大麥致病性的比較。左圖 和中圖分別為稻瘟菌的分生孢子懸浮液(濃度為5X104個(gè)/毫升)噴霧接種水稻和大麥 葉片5天后的典型照片；右圖為稻瘟菌的菌絲塊接種劃傷的水稻葉片5天后的典型照片。 P131和CD5分別代表野生型和敲除體。
附圖6.野生型菌株與MoPPF3基因的敲除體的附著胞對(duì)滲透壓的感應(yīng)比較。形 成滲透壓的試劑是30% PEG-8000.實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；P131和CD5分別代表野生型和敲除 體。
附圖7.野生型菌株與MoPPF3基因的敲除體在不同營(yíng)養(yǎng)條件下菌落形態(tài)的比 較。野生型菌株P(guān)131與MoPPF3的敲除體CD5在含有50mM葡萄糖(Glucose)，或50mM 醋酸鈉(Sodium acetate)，或50mM橄欖油(Oliveoil)的基本培養(yǎng)基(MM)上于25°C光照 培養(yǎng)7天后的菌落形態(tài)比較。
附圖8.ΜαΡρβ與其同源蛋白的聚類分析。圖示說(shuō)明FG09633、 NCU07263、AnAcuH> ScCrcl、UM05869、DmColt、HsCactl 禾Π AtBou 為分別 來(lái)源于禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearam)，粗糙脈胞酶(Neurospora crassa)，構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)，釀酒酵母 Maccharomyces cerevisiae)，玉米黑穗病菌 (Ustilagomaydis)，果 Ife黽(Drosophila melanogas ter),人類(Homo sapiens)禾口 擬南芥 (Arabidopsis thalanian)中的ΜοΡρβ同源蛋白。蛋白聚類分析是使用NJplot和MEGA軟件完成的。
附圖9.ΜοΡρβ在稻瘟菌中的表達(dá)動(dòng)態(tài)與亞細(xì)胞定位。將含MoPPF3_GFP融合 載體的轉(zhuǎn)化子CGll的分生孢子懸浮液(濃度為2Χ105個(gè)/毫升)點(diǎn)接到新鮮洋蔥內(nèi)表皮 的正面，接種后O小時(shí)，12小時(shí)，M小時(shí)分別在顯微鏡下觀察分生孢子、附著胞及侵染 菌絲中MoPPF3-GFP的表達(dá)情況。圖示說(shuō)明左列照片為明視場(chǎng)下拍攝，右列照片為暗 視場(chǎng)下拍攝。上排為分生孢子；中排分生孢子接種洋蔥表皮12小時(shí)后形成的附著胞；下 排為分生孢子接種洋蔥表皮M小時(shí)后形成的侵染菌絲。標(biāo)尺為20微米。
具體實(shí)施方式
為了更好的理解本發(fā)明，以下通過(guò)實(shí)施例予以進(jìn)一步地說(shuō)明，但并非對(duì)本發(fā)明 的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、基因MoPPF3的的分離與鑒定
1)侵染釘形成率減少突變體的篩選。將野生型稻瘟菌菌株Ρ131的REMI轉(zhuǎn)化 體庫(kù)中每個(gè)轉(zhuǎn)化體的分生孢子OXlO5)分別接種到洋蔥表皮細(xì)胞，于25°C黑暗保濕對(duì)小 時(shí)后，在放大倍數(shù)為10X40的顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)形成的侵染釘，篩選到一個(gè)侵染釘形 成率減少(約為27% )的突變體MS5087。該突變體與野生型P131在洋蔥表皮上形成侵 染釘?shù)牟町惐容^見(jiàn)圖1。
幻突變體MS5087的遺傳分析。將突變體MS5087與不具有潮霉素抗性的、交 配型相反的野生型菌株進(jìn)行有性雜交，挑取雜交后代子囊孢子進(jìn)行潮霉素抗性和 侵染釘形成率分析，發(fā)現(xiàn)在所測(cè)定的35個(gè)子囊孢子中，18個(gè)感潮霉素的子囊孢子均表現(xiàn) 為野生表型，17個(gè)抗潮霉素的子囊孢子均表現(xiàn)為突變表型(侵染釘形成率降低)，表明突 變體λ 5087的突變表型與外援插入標(biāo)記潮霉素抗性基因共分離，且潮霉素抗性基因在突 變體基因組DNA中單位點(diǎn)插入。
3)突變體MS5087中功能受影響基因的鑒定。選取插入質(zhì)粒pUCATPH中pUC18 部分沒(méi)有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶HindIII完全消解突變體的基因組，乙醇沉淀后用 T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞。提取轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，并 進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒中除含有pUCATPH中pUC18部分的序列外，還含 有部分插入位點(diǎn)側(cè)端的基因組的序列。將其與稻瘟病菌基因組(http://www.broadinstitute. org/annotation/genome/magnaporthe grisea/)進(jìn)行比對(duì)、預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)突變體 MS5087 中外 源質(zhì)粒的插入位點(diǎn)位于MGG_10492.5的第一個(gè)外顯子中，位于ATG下游116bp(圖2)， 命名為MoPPF3。該插入位點(diǎn)的位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID Na 1的第1616位。提取MoPPF3 基因編碼的預(yù)測(cè)氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLASTP比對(duì)，發(fā)現(xiàn)此基因編碼的蛋白可能是 一個(gè)定位于真菌線粒體的?；鈮A載體。
4)基因MoPPF3 cDNA的克隆。用Trizol法提取野生型稻瘟病菌P131菌 絲中的總RNA，并用DNasI消解其中的DNA。 以O(shè)ligo (dT)為引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄，得到MoPPF3cDNA的第一條鏈。根據(jù)國(guó)際稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(kù)中假定MoPPF3的 cDNA 序列設(shè)計(jì) RT-PCR 弓丨物 rtf(5，-ATGTCAGCATCTTCGCAAC-3，)和 rtr(5，-TCAGTCAAACACCTTGTTC-3‘)。以 cDNA 的第一條鏈為模板，擴(kuò)增 MoPPF3 基因的cDNA。所得PCR產(chǎn)物連接到T-載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，獲得了基因MoPPF3 的cDNA序列，其核苷酸序列包含SEQ IDNo 2所示的第1位到第1038位的堿基。
實(shí)施例2、基因MoPPF3在稻瘟病菌侵染釘形成過(guò)程中的作用
1) MoPPF3基因互補(bǔ)突變體MS5087
a.互補(bǔ)載體的構(gòu)建
用XbaI從質(zhì)粒pSM331中切下新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，將其與XbaI酶切的 pBlueScriptKS(+)連接，得到質(zhì)粒pKN。根據(jù)基因MoPPF3的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)了 正向引物 hbup (5，-AGGTACCTGACAGCAGTCCGTG-3，，KpnI)和反向引物 hbdown ( 5，-ACTCGAGAGTTTGTGGCGTCTG-3，，XhoI)。以野生型菌株 P131 的基因組 DNA 為模板，用保真LA-Taq酶擴(kuò)增出一條3118bp的DNA片段，該片段包含MoPPF3基因及 其上游1.5 的啟動(dòng)子序列，其序列對(duì)應(yīng)于序列表中SEQ IDN2 : 1中的l_3118bp。該片 段用KpnI和XhoI酶切后，連接到用相同酶切的載體pKN上。酶切鑒定，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證 正確后，得到包含有預(yù)測(cè)的MoPPF3基因和選擇標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的互補(bǔ)質(zhì)粒 載體 pCPPF3。
b.稻瘟菌的轉(zhuǎn)化
采用CaCl2/PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體的方法，將互補(bǔ)載體pCPPF3隨機(jī)整合 到突變體MS5087的基因組中。具體操作如下(均為無(wú)菌操作)
用突變體λ 5087的菌絲、孢子混合體接種500毫升三角瓶中的150毫升液體 CM培養(yǎng)基(酵母提取物0.1%，酶水解干酪素0.05%，酸水解干酪素0.05%，，葡萄糖 1%,硝酸鈣0.1%，磷酸二氫鉀0.02%，硫酸鎂0.025%，氯化鈉0.015%)，在沈°〇、 100轉(zhuǎn)/分條件下?lián)u培36小時(shí)。三層滅菌擦鏡紙過(guò)濾并收集菌絲體，菌絲體用0.7Μ氯化 鈉溶液洗滌后轉(zhuǎn)移至50毫升離心管中，每1克菌絲加入1毫升的酶滲透液(含20毫克/ 毫升崩潰酶，用0.7Μ氯化鈉配制)，26-28100轉(zhuǎn)/分條件下酶解3_4時(shí)后，用0.7Μ 氯化鈉洗滌菌絲體，經(jīng)三層滅菌擦鏡紙過(guò)濾，收集原生質(zhì)體，4,000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘， 先用25毫升STC (1.2Μ山梨醇，IOmM Tris-Cl, ρΗ 7.5，50mM氯化鈣)洗滌原生質(zhì)體一 次，然后分別用10毫升STC洗2次，離心沉淀后用STC將原生質(zhì)體濃度調(diào)至IX IO8個(gè) /毫升。
將突變體MS5087的原生質(zhì)體分裝于50毫升離心管中，每管150微升，加入等 體積的線性化的互補(bǔ)載體pCPPF3 (約2微克)和STC混合液，冰上放置20分鐘，然后 逐滴緩慢加入2毫升/管PTC溶液(60%聚已二醇3350，IOmM Tris-pH 7.5，50mM氯化 鈣)，冰上靜止20分鐘，加入25毫升/管冰冷的STC，緩慢混勻，4,000轉(zhuǎn)/分、4°C離 心15分鐘，去上清，然后每管加入3毫升的LR培養(yǎng)基(0.1%酵母提取物，0.1%酶水解 干酪素，IM蔗糖)，室溫靜置培養(yǎng)12小時(shí)后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，加入約12升冷卻至50°C左 右的SR(LR+1.6%瓊脂)，混勻，待其凝固吹干后，上面鋪一層12毫升的0.7%瓊脂(冷 卻至50°C左右，含400微克/毫升的新霉素)。^TC培養(yǎng)4 6天，將出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn) 至含400微克/毫升新霉素的CM固體培養(yǎng)基上，二次篩選后將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入燕麥片番茄 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并進(jìn)行單孢分離。7
c.互補(bǔ)體與野生型P131侵染釘形成率的比較
將互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的分生孢子QX IO5)接種到洋蔥表皮細(xì)胞，25°C黑暗保濕M小時(shí) 后，在放大倍數(shù)為10X40的顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)形成的侵染釘。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子 的侵染釘形成率約為84%，達(dá)到了野生型菌株侵染釘形成率(約為86%)的水平。這說(shuō) 明突變體^ 5087中的突變表型是由于基因MoPPF3的正常功能受到影響而引起的，且基 因MoPPF3ATG上游1.5kb片段已包含了功能性的啟動(dòng)子。其中MoPPF3基因的功能性 啟動(dòng)子序列如序列表中SEQID Na 1中的l-1500bp。
2) MoPPF3基因的敲除分析
a.敲除載體的構(gòu)建
基因敲除采用同源重組的方法，用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因替換野生型P131中 MoPPF3基因的編碼區(qū)，具體策略見(jiàn)附圖3。將從載體質(zhì)粒pCB1004中切下潮霉素磷酸 轉(zhuǎn)移酶基因連接到用相同限制性內(nèi)切酶切的pBlueScriptKS(+)連接，得到新的質(zhì)粒載體 ρΚΝΗ。以野生型Ρ131的基因組DNA為模板，用引物upf(5’ -CACTAGTCGTCATCGT ATCGAC-3，，5，端含 SpeI 酶切位點(diǎn))和 upr(5，-CGAATTCAATGGGTATTTGATC-3 ，，5，端含EcoRI酶切位點(diǎn))擴(kuò)增出的片段作為左臂，用引物doWnf(5’ -ACTCGAGCA TTCATCAGTCCAC-3，5，端含 XhoI 酶切位點(diǎn))和 downr (5，-AGGTACCGGACAGTTC AAGGTC-3’，5’端含KpnI酶切位點(diǎn))擴(kuò)增出的片段作為右臂。左臂用SpeI和FcoRI 雙酶切，右臂用XhoI和KpnI雙酶切，按照上下游順序分別連接到載體ρΚΝΗ中潮霉素磷 酸轉(zhuǎn)移酶基因的兩側(cè)，得到基因MoPPF3的敲除載體pKOC5。
b.稻瘟菌的轉(zhuǎn)化與敲除體的獲得
采用上述CaCl/PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將敲除載體pKOC5轉(zhuǎn)化到野生型菌株 P131中，最終獲得基因MoPPF3的敲除體CD5，該敲除體分別用Southern雜交方法和 RT-PCR方法進(jìn)行了驗(yàn)證(圖3)。Southern雜交結(jié)果表明，以圖3A中所示的probel為 雜交探針(即敲除載體的右臂)進(jìn)行雜交，野生型P131顯示2.7kb的雜交帶，敲除體CD5 顯示6.5 的雜交帶。RT-PCR結(jié)果表明，野生型P131中能擴(kuò)增出MoPPF3基因的大量 轉(zhuǎn)錄物，而在敲除體CD5中沒(méi)有任何擴(kuò)增條帶。所以，CD5是MoPPF3基因的敲除體。
c.敲除體與野生型P131侵染釘形成率的比較
將分生孢子的懸浮液QXlO5)點(diǎn)接到新鮮洋蔥內(nèi)表皮的正面，M小時(shí)后于顯微 鏡下觀察并拍照記錄侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程及侵染釘?shù)男纬陕?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MoPPF3的敲除 體CD5的侵染釘形成率為沈％，而野生型P131的侵染釘形成率86% (圖4)。MoPPF3 的敲除體CD5與本發(fā)明中的突變體λ 5087在侵染釘形成率上有相似的缺陷，均比野生 型Ρ131的侵染釘形成率顯著降低。這說(shuō)明MoPPF3基因?yàn)榈疚辆秩踞數(shù)男纬伤匦琛?br> 實(shí)施例3、MoPPF3基因在稻瘟菌致病性中的作用
將野生型Ρ131和MoPPF3的敲除體CD5的分生孢子懸浮液(濃度為5 X IO4個(gè) /毫升)均勻地噴霧接種于四葉一心期水稻葉片正面，或一葉一心期大麥葉片正面，或?qū)?菌絲塊點(diǎn)接到四葉一心期水稻葉片正面，和100%相對(duì)濕度下避光培養(yǎng)36小時(shí)，見(jiàn) 光后繼續(xù)保濕培養(yǎng)3天，觀察發(fā)病情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MoPPF3基因的敲除體CD5在寄主 植物水稻和大麥上均不能形成病斑，在劃傷的水稻葉片上也不能形成病斑，而相同條件 下，野生型P131在水稻和大麥葉片上均能形成典型的稻瘟病病斑(圖幻。這說(shuō)明，相對(duì)于野生型P131，MoPPF3的敲除體CD5的致病力顯著降低，MoPPF3是稻瘟菌致病性 所必需的基因。
實(shí)施例4、MoPPF3基因在稻瘟菌耐滲透壓能力與脂肪酸代謝中的作用
1)野生型與敲除體耐滲透壓能力的比較
將野生型P131與MoPPF3基因的敲除體CD5的分生孢子的懸浮液(濃度為 2X IO5個(gè)/毫升)點(diǎn)接到蓋玻片上，黑暗保濕培養(yǎng)M小時(shí)。然后將蓋玻片浸泡在30% 的PEG-8000 (w/v)溶液中15分鐘，于放大倍數(shù)為10X40的顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)變形的 附著胞個(gè)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MoPPF3的敲除體CD5變形附著胞的比例約為52%，而野生菌 P131變形附著胞的比例約為27% (圖8)。這說(shuō)明MoPPF3的敲除使稻瘟病菌耐受滲透 壓的能力顯著下降。
2)野生型與敲除體在不同營(yíng)養(yǎng)條件下菌落形態(tài)的比較
將野生型P131與MoPPF3基因的敲除體CD5在分別含有50mM葡萄糖、50mM醋酸鈉和50mM橄欖油的基本培養(yǎng)基上25°C光照培養(yǎng)7天后比較菌落形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， MoPPF3的敲除體CD5在含有醋酸鈉的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)極其緩慢，在含有橄欖油的基 本培養(yǎng)基上，不能生長(zhǎng)，這都與野生菌P131有顯著差異(圖7)。這說(shuō)明基因MoPPF3是 脂肪酸代謝所必需的。
實(shí)施例5、ΜοΡρβ的系統(tǒng)進(jìn)化分析
用稻瘟菌ΜοΡρβ 的氨基酸序列在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastp檢索，得到ΜοΡρβ的同源蛋白F609633、NCU07263、AnAcuH> ScCrcl、UM05869、DmColt、HsCactl 和 AtBou，分別來(lái)源于禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearam),粗糙脈胞酶(Neurospora crassa)，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)， 釀酒酵母 Maccharomyces cerevisiae)，玉米黑穗病菌(Ustihgo maydis)，果蠅 (Drosophilamelanogaster),人類(Homo sapiens)禾口擬南芥(Arabidopsis thalanian)。 除擬 南芥中的AtBou外，其它同源蛋白的氨基酸序列與ΜοΡρβ的氨基酸序列的一致性均在 40%以上。其中，NCU07263、FG09633和UM05869的氨基酸序列分別如序列表中SEQ IDNo 4、5和6所示。用NJplot對(duì)上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，用MEGA4 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖8)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ΜοΡρβ類蛋白普遍存在于真菌、植物和動(dòng)物中，是 一個(gè)保守的蛋白。通過(guò)比對(duì)蛋白ΜοΡρβ及其類似物，還發(fā)現(xiàn)MoPPF3基因預(yù)測(cè)編碼一 個(gè)肉堿-?；鈮A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它含有三個(gè)假定的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu) 域可能參與線粒體內(nèi)膜能量的轉(zhuǎn)移或其它真核細(xì)胞器(例如過(guò)氧化物酶體)膜的整合。
實(shí)施例6、ΜοΡρβ的表達(dá)動(dòng)態(tài)分析與亞細(xì)胞定位
1) MoPPF3-GFP融合載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
用NcoI從質(zhì)粒載體pCam35s-GFP中切下GFP基因，將其連入用NcoI酶切的 pKN,得到質(zhì)粒 pKNTG。用引物 crclgfPf(5，-ATTAGGTACCTGCATATCCGATGTAGC TTG-3，)和 crclgfpr(5，-ATATCTCGAGGTCAAACACCTTGTTCATG-3‘)，以野生型 P131的基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到包含M17bp的DNA片段((含基因MoPPF3啟動(dòng) 子區(qū)域1292bp及編碼區(qū)的基因組序列)，用KpnI和XhoI酶切后，連入用相同酶切的載 體pKNTG上，得到含有融合基因MoPPF3-GFP和選擇標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì) 粒載體pKGPPF3。用上述CaCl2/PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將pKGPPF3轉(zhuǎn)化到基因MoPPF3的敲除體CD5中，獲得MoPPF3-GFP融合載體的轉(zhuǎn)化子CG11，該轉(zhuǎn)化子的侵染釘形成 率(84.5士2.4%)與野生型菌株P(guān)131沒(méi)有顯著的差異，說(shuō)明MaPPF3_GFP能行使基因 MoPPF3的功能。
2)基因MoPPF3_GFP的表達(dá)動(dòng)態(tài)分析
將含MoPPF3-GFP融合載體的轉(zhuǎn)化子CGll的分生孢子懸浮液(濃度為2 X IO5 個(gè)/毫升)點(diǎn)接到新鮮洋蔥內(nèi)表皮的正面。分別在接種后0小時(shí)，12小時(shí)，對(duì)小時(shí)顯微 鏡下觀察并拍照記錄分生孢子、附著胞及侵染菌絲中MaPPF3-GFP的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，在CGll的分生孢子、附著胞和侵染菌絲中均能觀測(cè)到GFP的綠色熒光，說(shuō)明基因 MoPPF3-GFP在稻瘟菌的整個(gè)侵染過(guò)程中均有表達(dá)(圖9)。
3)MoPpf3的亞細(xì)胞定位
熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化子CGll中MaPPF3-GFP在分生孢子內(nèi)的分布，結(jié)果表 明該融合蛋白可能定位在線粒體(圖9)。
權(quán)利要求
1.稻瘟菌中控制致病性和侵染釘形成的必需基因MOPPF3，其特征在于具有序列表中 SEQID No 1的DNA序列，或者編碼序列表中SEQ ID N2 : 3的蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序 列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟菌致病性和侵染釘形成的必需基因MoPPF3編碼的蛋白 質(zhì)ΜαΡρβ具有序列表中的SEQ ID N2 : 3所示的氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稻瘟菌致病性和侵染釘形成的必需基因MoPPF3的cDNA， 其特征在于具有序列表中SEQ IDNo 2所示的DNA序列。
4.利用權(quán)利要求1所述的稻瘟菌致病性和侵染釘形成的必需基因MoPPF3構(gòu)建的表達(dá) 載體。
5.利用權(quán)利4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所得的細(xì)胞系和宿主菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述，通過(guò)將稻瘟菌致病性和侵染釘形成的必需蛋白MgPpfi進(jìn)行 缺失或突變或修飾而使其侵染釘形成率或/和致病力發(fā)生缺陷中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述，以稻瘟菌致病性和侵染釘形成的必需蛋白MgPpfi作為靶標(biāo) 在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物中的利用。
8.權(quán)利要求2所述的稻瘟菌中控制侵染釘形成的必需蛋白ΜαΡρβ，在其它植物病原 真菌禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearam)和玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)中的同源蛋白分 別為FG09633和UM05869，其特征分別具有序列表中SEQ ID N2 5，6所示的氨基酸序 列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述，稻瘟菌中控控制致病性和侵染釘形成的必需蛋白ΜαΡρβ在 其他植物病原真菌中的同源蛋白FG09633和UM05869作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥物 中的利用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了稻瘟菌MoPPF3基因及其編碼蛋白的功能與用途，該基因控制稻瘟菌侵染釘?shù)男纬珊椭虏×?，該基因及其cDNA和編碼的蛋白質(zhì)分別具有序列表中SEQ ID№1、№2和№3的核苷酸或氨基酸序列。該基因在稻瘟菌的分生孢子、附著胞和侵染菌絲中均有表達(dá)，且為脂肪酸代謝所必需。MoPPF3基因的敲除導(dǎo)致稻瘟菌的侵染釘形成率降低為野生型的1/3，耐受滲透壓的能力明顯減弱，且完全喪失對(duì)水稻葉片的侵染能力。MoPPF3編碼蛋白的表達(dá)或修飾或/和其在其它病原真菌中的同源蛋白均可作為重要候選靶標(biāo)，用于設(shè)計(jì)和篩選抗真菌的新型藥劑。本發(fā)明公開(kāi)了稻瘟菌MoPPF3基因及其編碼蛋白的功能與用途，該基因控制稻瘟菌侵染釘?shù)男纬珊椭虏×Α?br> 文檔編號(hào)C12N15/31GK102021186SQ20101053074
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者孔令安, 張燕, 彭友良, 戚琳璐, 楊俊 , 王大偉, 趙文生, 陳小林 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)