專利名稱：一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編碼產(chǎn)物的 體外功能檢測(cè)的方法，屬于植物保護(hù)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
稻瘟病菌是研究較多植物致病真菌，其侵染過程始于分生孢子著落到 寄主表面，分生孢子依靠頂端的膠狀物緊緊粘著在植物組織表面，在有水 滴的條件下很快萌發(fā)形成發(fā)芽管，并分化出附著胞。形成強(qiáng)大的壓力使侵 入栓能夠直接穿透寄主組織的角質(zhì)層。成功侵入后，侵染菌絲就大量生長(zhǎng)， 分化出多胞有分枝的菌絲體，在植物細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間延伸，最后形成病斑， 產(chǎn)生分生孢子，開始新的侵染。在侵染過程中，水稻和稻瘟病菌都有大量的基因參與。僅病菌方面， 就包括大類基因第一類是與侵染有關(guān)的形態(tài)分化過程信號(hào)識(shí)別基因；第 二類是與毒性相關(guān)的毒性決定因子和無(wú)毒基因，第三類是與病菌侵染水稻 組織后定殖擴(kuò)展相關(guān)的基因。關(guān)于侵染早期的基因研究得較多，識(shí)別疏水信號(hào)的M戶G7 、P77W/基因，進(jìn)行信號(hào)傳遞的CPiC4， M4C7 、M4GB，尸MW ， MST7和MS777等基因，參與黑色素合成的^LBA萬(wàn)L^7和i Sn基因， 附著胞膨壓形成的PTH2基因，侵入栓形成的尸LS7、MS7V2， M尸57、 0457、p/)五/、 cr尸7等基因，此外還有一些無(wú)毒基因，包括p『l入^ray-cow,^Fi -巧to, ^CE等。對(duì)于稻瘟病菌感染建立后在寄主組織內(nèi)定殖發(fā)展階段 的基因調(diào)控則研究得還不多。僅有P型ATP酶基因尸D五/和MgJP"基因， Miff/與Woronin體形成的HEXl，而且其與病原菌在寄主體內(nèi)擴(kuò)展的機(jī) 制還不不清楚。我們從含有信號(hào)肽的小蛋白中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)表達(dá)產(chǎn)物能夠 在水稻葉片上引起壞死斑的基因，通過RT-PCR檢測(cè)，表明其在感染的第 四天達(dá)到最高，其表達(dá)量變化的特征表明該基因主要在侵染的后期大量表 達(dá)，可以作為稻瘟病病斑的形成和致病基因的研究的候選基因。目前，參與稻瘟病菌侵染早期的相關(guān)基因的研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的發(fā) 展，而對(duì)稻瘟病菌侵染后期表達(dá)的基因卻研究得較少。而且以往采用傳統(tǒng) 的將稻瘟病菌株噴霧接種水稻葉片，10天后觀察葉片表型變化的致病性測(cè) 定方法，這種方法容易受到氣候、以及人為條件等環(huán)境因子的影響，現(xiàn)在 還沒有一種直接用基因的原核表達(dá)產(chǎn)物接種致傷水稻葉片，以快速測(cè)定基 因是否是致病基因的方法。 發(fā)明內(nèi)容.-本發(fā)明的主要目的是克服現(xiàn)有傳統(tǒng)稻瘟病菌致病性測(cè)定方法的不足， 提供一種快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的測(cè)定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是保持目前基因克隆與表達(dá)的方法，包括引物設(shè) 計(jì)、PCR擴(kuò)增、real-time PCR、連接、轉(zhuǎn)化、蛋白表達(dá)方法均與常規(guī)相同， 其特征在于該基因的編碼產(chǎn)物是小蛋白，由88個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子 量為8.8kDa，其編碼基因的核酸序列和氨基酸序列如下WSKSSQGG腿TNIATIQANCQAECNTIFEIGQ該基因的體外表達(dá)產(chǎn)物按照0.5mg/ml 2.5mg/ml濃度直接接種到致傷 的麗江新團(tuán)黑谷水稻葉片后能引起水稻葉片產(chǎn)生病斑，這種測(cè)定方法比傳 統(tǒng)瘟病菌致病性測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速。 PCR擴(kuò)增的引物序列為P04-F: 5'畫CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3' P04-R: 5，- CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3' real-time PCR擴(kuò)增的引物序列為 NIP04畫F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3， NIP04-R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3，本發(fā)明的有益效果是該基因?yàn)榈疚敛【秩舅竞笃诟叨缺磉_(dá)的基 因。采用其表達(dá)產(chǎn)物直接接種到致傷水稻葉片上，可直接定性地獲得水稻 的抗感和與蛋白互作的情況，克服了傳統(tǒng)致病性測(cè)定方法周期長(zhǎng)、環(huán)境因 子影響大等弊端，最終達(dá)到為今后稻瘟病菌致病性測(cè)定提供簡(jiǎn)便有效的方法的目的。具體表現(xiàn)在以下兩點(diǎn)l.該基因?yàn)榈疚敛【秩舅竞笃诟叨缺磉_(dá)的基因，與前人研究的稻瘟病菌基因多為稻瘟病菌侵染早期高度表達(dá) 的基因有區(qū)別。2.體外表達(dá)產(chǎn)物直接接種到水稻葉片上，兩天后能直接觀 察到水稻葉片的表型變化，定性獲得蛋白與水稻互作的情況，克服了傳統(tǒng) 致病性測(cè)定周期長(zhǎng)、環(huán)境因子影響大等弊端。 具體實(shí)施方案實(shí)施例一基因的編碼產(chǎn)物是小蛋白，由88個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為8.8kDa， 其編碼基因的核酸序列和氨基酸序列如下-WSKSSQGGRMTNIATIQANCQAECNTIFEIGQPCR擴(kuò)增的引物序列為P04-F: 5 ，-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3'P04畫R: 5，- CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG國(guó)3' real-time PCR擴(kuò)增的弓I物序列為 NIP04-F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3， NIP04-R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3，將該基因的表達(dá)產(chǎn)物于4。C離心機(jī)離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖 液(20mM Tris-HCl， pH7.4; 200mM NaCl; lmM EDTA; 10mM e -巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進(jìn)行超生破碎細(xì)胞后離心收集上清。處理是 將該基因的原核表達(dá)產(chǎn)物按照0.5mg/ml的濃度接種到水稻品種麗江新團(tuán) 黑谷的致傷葉片上。對(duì)照是將空載體的原核表達(dá)產(chǎn)物按照0.5mg/ml的濃度 接種到致傷的水稻葉片上，兩天后觀察水稻葉片表型變化，結(jié)果見表l表1基因原核表達(dá)產(chǎn)物接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種致傷葉片48小時(shí)表型變化類別蛋白濃度(mg/ml)48小時(shí)葉片表型變化處理0.50葉片致傷點(diǎn)周圍出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)對(duì)照0.50葉片致傷點(diǎn)周圍沒有出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)實(shí)施例二.-基因的編碼產(chǎn)物是小蛋白，由88個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為8.8kDa， 其編碼基因的核酸序列和氨基酸序列如下WSKSSQGG腹TNIATIQANCQAECNTIFEIGQPCR擴(kuò)增的引物序列為P04-F: 5'-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3' P04扁R: 5，- CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3' real-time PCR擴(kuò)增的引物序列為 NIP04-F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3' NIP04-R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3，將該基因的表達(dá)產(chǎn)物于4"C離心機(jī)離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖 液(20mMTris-HCl, pH7.4; 200mMNaCl; lmMEDTA; 10mM P-巰基 乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進(jìn)行超生破碎細(xì)胞后離心收集上清。處理是 將該基因的原核表達(dá)產(chǎn)物按照2.5mg/ml的濃度接種到水稻品種合系24的 致傷葉片上。對(duì)照是將空載體的表達(dá)產(chǎn)物按照2.5mg/ml的濃度接種到致傷 的水稻葉片上，兩天后觀察水稻葉片表型變化，結(jié)果見表2。表2基因原核表達(dá)產(chǎn)物接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種致傷葉片48小時(shí)表型變化類別蛋白濃度(mg/ml)48小時(shí)葉片表型變化處理2.50葉片致傷點(diǎn)周圍出現(xiàn)連成片的褐色斑塊對(duì)照2.50葉片致傷點(diǎn)周圍沒有出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)實(shí)施例三基因的編碼產(chǎn)物是小蛋白，由88個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為8.8kDa， 其編碼基因的核酸序列和氨基酸序列如下WSKSSQGG脂TNIATIQANCQAECNTIFEIGQPCR擴(kuò)增的引物序列為P04-F: 5'-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3'P04-R: 5，- CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3' real-time PCR擴(kuò)增的弓|物序列為 NIP04-F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3， MP04-R:5'誦ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3,將該基因的表達(dá)產(chǎn)物于4'C離心機(jī)離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖 液(20mMTris-HC1， pH7.4; 200mMNaCl; lmMEDTA; 10mM P-巰基 乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進(jìn)行超生破碎細(xì)胞后離心收集上清。處理是 將該基因的原核表達(dá)產(chǎn)物按照Ulmg/ml的濃度接種到水稻品種汕優(yōu)63的 致傷葉片上。對(duì)照是將空載體的表達(dá)產(chǎn)物按照l(shuí).llmg/ml的濃度接種到致 傷的水稻葉片上，兩天后觀察水稻葉片表型變化，結(jié)果見表3。表3基因原核表達(dá)產(chǎn)物接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種致傷葉片48小時(shí)表型變化類別蛋白濃度(mg/ml)48小時(shí)葉片表型變化處理Ul葉片致傷點(diǎn)周圍出現(xiàn)較多褐色斑點(diǎn)對(duì)照Ul葉片致傷點(diǎn)周圍沒有出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)實(shí)施例四:基因的編碼產(chǎn)物是小蛋白，由88個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為8.8kDa， 其編碼基因的核酸序列和氨基酸序列如下WSKSSQGG腿TNIATIQANCQAECNTIFEIGQPCR擴(kuò)增的引物序列為P04腸F: 5，-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3'P04-R: 5,扁CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG扁3' real-time PCR擴(kuò)增的引物序列為 NIP04-F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3' NIP04-R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3'將該基因的表達(dá)產(chǎn)物于4'C離心機(jī)離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖 液(20mMTris-HCl， pH7.4; 200mMNaCl; lmMEDTA; 10mM P-巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進(jìn)行超生破碎細(xì)胞后離心收集上清。處理是 將該基因的原核表達(dá)產(chǎn)物按照1.51mg/ml的濃度接種到水稻品種汕優(yōu)22的 致傷葉片上。對(duì)照是將空載體的表達(dá)產(chǎn)物按照1.51mg/ml的濃度接種到致 傷的水稻葉片上，兩天后觀察水稻葉片表型變化，結(jié)果見表4。表4基因原核表達(dá)產(chǎn)物接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種致傷葉片48小時(shí)表型變化類別蛋白濃度(mg/ml)48小時(shí)葉片表型變化處理1.51葉片致傷點(diǎn)周圍出現(xiàn)很多明顯的褐色斑點(diǎn)對(duì)照1,51葉片致傷點(diǎn)周圍沒有出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)實(shí)施例五基因的編碼產(chǎn)物是小蛋白，由88個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為8.8kDa， 其編碼基因的核酸序列和氨基酸序列如下WSKSSQGGRMTNIATIQANCQAECNTIFEIGQPCR擴(kuò)增的引物序列為P04-F: 5'-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3'P04-R: 5，- CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3' real-time PCR擴(kuò)增的引物序列為 NIP04-F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC畫3， NIP04-R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG國(guó)3，將該基因的表達(dá)產(chǎn)物于4x:離心機(jī)離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液(20mMTris-HCl， pH7.4; 200mM NaCl; lmMEDTA; lOmM P-巰基
乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進(jìn)行超生破碎細(xì)胞后離心收集上清。處理是 將該基因的原核表達(dá)產(chǎn)物按照2.02mg/ml的濃度接種到水稻品種紫糯的致 傷葉片上。對(duì)照是將空載體的表達(dá)產(chǎn)物按照2.02mg/ml的濃度接種到致傷 的水稻葉片上，兩天后觀察水稻葉片表型變化，結(jié)果見表5。
表5基因原核表達(dá)產(chǎn)物接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種致傷葉片48小時(shí)表型變化
類別蛋白濃度(mg/ml)48小時(shí)葉片表型變化
處理2.02葉片致傷點(diǎn)周圍出現(xiàn)大量明顯褐色斑點(diǎn)
對(duì)照2.02葉片致傷點(diǎn)周圍沒有出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)
1權(quán)利要求
1、一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，保持目前基因克隆與表達(dá)的方法，包括引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、real-time PCR、連接、轉(zhuǎn)化、蛋白表達(dá)方法均與常規(guī)相同，其特征在于該基因的編碼產(chǎn)物是小蛋白，由88個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為8.8kDa，其編碼基因的核酸序列和氨基酸序列如下ATGAAGTTCTCTGCCGCCCTTTTGACCACCATCACCGCCACCGGCGCCAACGCTCTCTGGTTCGTGCCGCCTCAATATACGACCAATCAACACCTCCAGACTTATTTCCGAGCCTATCCCGGGTGTGTTGCGCATTGCGAGACATGGTCTAAGTCCTCACAAGGCGGTAGAATGACAAACATCGCCACCATTCAAGCCAATTGCCAAGCCGAGTGCAACACAATCTTTGAAATTGGTCAATAAMKFSAALLTTITATGANALWFVPPQYTTNQHLQTYFRAYPGCVAHCETWSKSSQGGRMTNIATIQANCQAECNTIFEIGQ該基因的體外表達(dá)產(chǎn)物按照0.5mg/ml～2.5mg/ml濃度直接接種到致傷的水稻葉片后引起水稻葉片致傷點(diǎn)周圍產(chǎn)生褐色斑點(diǎn)。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編 碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，其特征是進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物序列 為P04-F: 5'-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3' P04-R: 5'畫CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3'
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，其特征是real-time PCR擴(kuò)增的引物 序列為NIP04-F: 5'-GTGCCGCCTC AATATACGAC-3'; NIP04畫R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3'。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編 碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，其特征是體外表達(dá)產(chǎn)物按照0.50mg/ml的濃度接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種的致傷葉片。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編 碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，其特征是體外表達(dá)產(chǎn)物按照 1.1 lmg/ml的濃度接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種的致傷葉片。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編 碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，其特征是體外表達(dá)產(chǎn)物按照 1.51 mg/ml的濃度接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種的致傷葉片。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編 碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，其特征是體外表達(dá)產(chǎn)物按照 2.02mg/ml的濃度接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種的致傷葉片。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編 碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，其特征是:體外表達(dá)產(chǎn)物按照2.5mg/ml 的濃度接種麗江新團(tuán)黑谷水稻品種的致傷葉片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種稻瘟病菌侵染后期高度表達(dá)的基因及其編碼產(chǎn)物的體外功能檢測(cè)的方法，屬于植物保護(hù)和生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案是保持目前基因克隆與表達(dá)的方法，如引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、real-time PCR、連接、轉(zhuǎn)化、蛋白表達(dá)均與常規(guī)相同，不同的是該基因?yàn)榈疚敛【秩舅竞笃诟叨缺磉_(dá)的基因，與前人研究的稻瘟病菌基因多為稻瘟病菌侵染早期高度表達(dá)的基因有區(qū)別，其編碼產(chǎn)物是小蛋白，由88個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為8.8kDa，其體外表達(dá)產(chǎn)物按照0.5mg/ml～2.5mg/ml的濃度直接接種到致傷的麗江新團(tuán)黑谷水稻葉片后能引起水稻葉片產(chǎn)生病斑。本發(fā)明比傳統(tǒng)稻瘟病菌致病性測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101580872SQ20081023364
公開日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日
發(fā)明者于欽亮, 林 劉, 孔垂思, 青 常, 悅 張, 朱有勇, 李成云, 靜 楊, 王云月, 源 蘇 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)