專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是以質(zhì)粒形式或以基因組整合方式構(gòu)建的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌及其制備方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌K-12株系因清晰的遺傳背景、擁有眾多高效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和基因組的易操作性而被廣泛應(yīng)用在代謝工程領(lǐng)域，以生產(chǎn)各式各樣的高附加值產(chǎn)品。目前尚未發(fā)現(xiàn)天然的大腸桿菌菌株有生產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力。透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, HA)最早從牛眼中分離得到的一種具有高黏度氨基多糖。透明質(zhì)酸廣泛存在人和動(dòng)物組織內(nèi)，其分子量在5X IO4到8X IO6道爾頓之間， 是由β-1，4-糖苷鍵連接的葡萄糖醛酸及β-1，3-糖苷鍵連接的氮乙酰葡萄糖胺(β 1-4 D-Glucuronic acid, GlcA ， β 1-3 D-N-acetylglucosamine ， GlcNAc)交替連接而成的直鏈聚合物。研究證實(shí)，該多糖作為結(jié)構(gòu)與信號(hào)分子參與了哺乳動(dòng)物的受精、胚胎發(fā)育、血管再生和關(guān)節(jié)潤(rùn)滑等眾多生理活動(dòng)；同時(shí)在炎癥與損傷修復(fù)、維持皮膚的水分與彈性方面也有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，特定長(zhǎng)度的HA寡糖鏈在抗腫瘤免疫異常修復(fù)等方面發(fā)揮著重要功能。 由于透明質(zhì)酸獨(dú)特的化學(xué)特性與生理功能，HA及源于HA的寡糖鏈被廣泛應(yīng)用于眼科手術(shù)、關(guān)節(jié)炎治療、抗腫瘤、給藥方式、化妝品工業(yè)等諸多方面，僅2008年HA做為原料，在全球市場(chǎng)的交易金額約為10億美元并有逐年增加的趨勢(shì)。自然界中HA廣泛存在，如動(dòng)物組織、哺乳動(dòng)物病原菌的細(xì)胞被膜及病毒PBCV-I浸染的小球藻等。目前商用HA主要從動(dòng)物組織(如雞冠，臍帶、牛眼、關(guān)節(jié)滑液)，和培養(yǎng)人與高等哺乳動(dòng)物的病原菌(如鏈鎖狀球菌，Str印tococci )中提取。出于資源限制、成本問(wèn)題及藥物安全等諸方面的考慮，上述生產(chǎn)絕非理想方式，國(guó)際社會(huì)極力探索更為經(jīng)濟(jì)、安全和持續(xù)的生產(chǎn)HA的方法。分子生物學(xué)及生物技術(shù)的發(fā)展，為上述問(wèn)題的解決提供了重要的手段。對(duì)HA 在動(dòng)物與微生物中合成機(jī)理，諸多HA的合成過(guò)程必需基因的克隆等研究，都為通過(guò)代謝工程的手段，在安全的宿主生物中重建或改造合成途徑來(lái)生產(chǎn)HA奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2004年日本學(xué)者柴谷滋郎等(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00480022328.8)通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)從人類(lèi)和草履蟲(chóng)病毒(PBCV-I)中得到的HA合成基因(Has)來(lái)嘗試HA在植物組織中的合成。Widner B 等(Bill Widner et al . , Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtil is Appl. Environ. Microbiol. 2005，71 (7) : 3747 - 3752)在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)從革蘭氏陽(yáng)性的鏈鎖狀球菌中得到的HA合成基因，工程芽孢桿菌在普通的三角瓶中發(fā)酵獲0.5-0. 6g / L HA含量。然而在植物中生產(chǎn)透明質(zhì)酸，因植物的轉(zhuǎn)化難，生長(zhǎng)周期受季節(jié)限制，許多保守環(huán)保人士反對(duì)轉(zhuǎn)基因植物，及轉(zhuǎn)基因植物本身存在對(duì)環(huán)境安全的潛在危害等而受到應(yīng)用限制。對(duì)于枯草芽孢桿菌，因該菌有產(chǎn)生內(nèi)毒素，各種大環(huán)脂類(lèi)和脂肽類(lèi)抗生素的報(bào)道，而會(huì)導(dǎo)致經(jīng)發(fā)酵、用于醫(yī)藥領(lǐng)域HA的分離純化成本增高，產(chǎn)率降低等系列問(wèn)題。許多來(lái)源于人體腸道的大腸桿菌是維護(hù)腸道微生物平衡及人體健康的有益細(xì)菌。 加之大腸桿菌K12株系具清晰的遺傳背景、擁有眾多高效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和基因組可操作性，而被廣泛應(yīng)用在代謝工程領(lǐng)域以生產(chǎn)高附加值的生物產(chǎn)品。對(duì)于用大腸桿菌為宿主進(jìn)行工程改造生產(chǎn)透明質(zhì)酸的首次報(bào)道是美國(guó)麻省理工學(xué)院的M^hanopoulos G研究組。 2008該研究組通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)革蘭氏陽(yáng)性鏈鎖狀球菌HA合成基因印Zfes和全新合成，優(yōu)化過(guò)密碼子并用于大腸桿菌表達(dá)的m/^s基因，該研究獲得最高約0.2g/L的HA產(chǎn)量。該工程大腸桿菌因HA合成產(chǎn)率低而難以獲得產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌及其制備方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的資源短缺、安全性問(wèn)題以及在工程大腸桿菌中較低透明質(zhì)酸合成的問(wèn)題。本發(fā)明是用表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因(hyaluronic acid synthase Has)和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因(UDP-glucose Dehydrogenase)高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌。本發(fā)明的含有透明質(zhì)酸合成酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌是通過(guò)以下方法構(gòu)建獲得的
(1)構(gòu)建表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因Has的載體，具體是將PCR克隆的Has連接入大腸桿菌的表達(dá)載體(如PQE801)中；
(2)構(gòu)建表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的載體，將PCR克隆的尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因連接入大腸桿菌的表達(dá)載體(如PQE801)中；
(3)構(gòu)建含有透明質(zhì)酸合成酶基因Has^和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因，在大腸桿菌中共同表達(dá)的重組載體；以( 中構(gòu)建的含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因表達(dá)載體為PCR的模板，擴(kuò)增含驅(qū)動(dòng)子(如T5)驅(qū)動(dòng)kfi\)表達(dá)的PCR產(chǎn)物，并連入(1)中構(gòu)建的表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因Zfes的表達(dá)載體中而獲得含有透明質(zhì)酸合成酶基因Zfes和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因，且能在大腸桿菌中共同表達(dá)的重組載體。(4)將(3)中獲得含有透明質(zhì)酸合成酶基因Zfes和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(如JM109菌株)，經(jīng)篩選而獲高效產(chǎn)透明質(zhì)酸的工程大腸桿菌。本發(fā)明的產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌是PHK/JM109，分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌 {Escherichia co/i)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3926，于2010年6月17日在中國(guó)北京市的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)保藏，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。本發(fā)明的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌(pHK/五coliMim具體按以下方法制備
(1)構(gòu)建含有透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)載體PQEpmHas,用PCR擴(kuò)增方法克隆源自 ^ ^sWiMM (.Pasteurella multoeida subsp. ifo/iocii/a)中的透明質(zhì)酸合成酶基因 {Pasteurella muliociVahyaluronic acid synthase PmHas),其 PCR 擴(kuò)±曾克隆所用弓 |物設(shè)計(jì)如下
上游引物pmHas Pl 為 5' -TAgfi^r<XATGAACACATTATCACAAGCAAT~3',(序列表中 SEQ ID No:3)含漢H I位點(diǎn)GGATCC和起始密碼子ATG ；
下游引物為/Mzfes P2 為 5' -TA6^g67TTTATAGAGTTATACTATTAATMT-3’ (序列表中 SEQ ID No 4)，含Sac I位點(diǎn)GAGCTC和終止密碼子TAA ；
PCR的模版為多殺巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)漢a H I和 I雙酶切后，連接入商用載體PQE80L中的相同酶切位點(diǎn)，插入片段經(jīng)DNA測(cè)序確證無(wú)突變后，將所獲載體命名為PQEpmHas，基因?yàn)?M^ks (序列表中SEQ ID No: 1)
(2)構(gòu)建含尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的表達(dá)載體pQEkfiD，用PCR擴(kuò)增方法克隆源自源于大腸桿菌(fecAericAiaco/i)菌株k5 iE. coli K5)中鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因(K5 capsule gene D，i/iD)，擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)如下
上游引物IfiD Pl: 5' - TGGAGArmTGTTCGGAACACTAAAAATAACT G-3，(序列表中 SEQ ID No:5)，含Bgl II位點(diǎn)AGATCT，和起始密碼子ATG)；
下游引物IfiD P2 5' -TT^TT^gTTAGTCACATTTAAA CMATCGCGAC-3'(序列表中 SEQ ID No 6)，含Xho I位點(diǎn)CTCGAG和終止密碼子TAA ；
PCR的模版為大腸桿菌菌k5菌株ATCC 23500的基因組D N A，成功擴(kuò)增并純化的產(chǎn)物，給B gl II和損ο I雙酶切后，連接入Qiagen公司的商用載體pQE80L的漢警H I和 Sal I位點(diǎn)，所得載體經(jīng)DNA測(cè)序分析確證插入片段無(wú)突變后，所獲載體命名為pQEkfiD， 相應(yīng)基因命名為A/iD基因(序列表中SEQ ID No:2)；
(3)構(gòu)建大腸桿菌中共同表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體
根據(jù)構(gòu)建好的pQEkfiD載體的DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增T5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)i/iD表達(dá)的片段T5:kfiD，具體引物序列設(shè)計(jì)如下
上游引物 T5kfiD Pl 5' -TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCACrTCGAGA-3'(序列表中 SEQ ID No:7)，該引物含有Sac I位點(diǎn)，GAGCTC，其中下標(biāo)G表示將原始pQESOL載體中C突變?yōu)?G,以消除其損ol位點(diǎn)，CTCGAG ；
下游引物 T5kfiD P2 5' -TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT-3'(序列表中 SEQ ID No:8)，該引物含損ο I site, CTCGAG ；
PCR的模版用pQEkfiD載體，純化的T5 kfiD擴(kuò)增產(chǎn)物，首先連接入pGEM-T-Vector (Promega產(chǎn)品，www. promega. com)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，獲中間載體pT_T5KfiD， 該載體中T5:kfiD (序列表中SEQ ID No:9)片段，經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)核苷酸順序無(wú)突變后， 該插入T5: kfiD片段經(jīng)fee I和損ο I雙酶切后，連接入表達(dá)載體pQEpmHas的fee I和 sal I位點(diǎn)而獲和A/iD基因在大腸桿菌中共表達(dá)的重組載體pQHK ；
(4)pHK的構(gòu)建
根據(jù)德國(guó)MoBiTec公司的革蘭氏陰性菌宿主廣譜質(zhì)粒pBBR122的DNA序列(GenBank No. Y14439)設(shè)計(jì)引物:
上游引物 PBBR Pl 5' -TTTGGTGTCGACCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGG-3'(序列表中 SEQ ID NO 10)；含有fe/I酶切位點(diǎn)，GTCGAC
下游引物 PBBR Pl 5' -TTAGGTGTCGACTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG-3'(序列表中 SEQID NO: 11)，含有5^1酶切位點(diǎn)，61^^0 ；
用上述引物擴(kuò)增質(zhì)粒PBBR122中包含其復(fù)制位點(diǎn)及卡那霉素抗性基因在內(nèi)的片段， PCR 擴(kuò)增的參數(shù)為95°C、2min，1 個(gè)循環(huán)；94°C，30s，55°C >30s, 72°C、3min，25 個(gè)循環(huán)；72°C、IOmin 1個(gè)循環(huán)，純化約3. 2 1Λ擴(kuò)增產(chǎn)物，用5 / I酶解后，加入連接酶讓其自連，自身連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，并用卡那霉素篩選獲質(zhì)粒pRP (序列表中SEQ ID NO :1 ，提取質(zhì)粒pRP，經(jīng)fe/I酶解后，連接入上述能在大腸桿菌中共表達(dá)pmHas和 kfi\)基因的pQHK的Xho I位點(diǎn)，而獲在革蘭氏陰性菌中共表達(dá)pmHas和k·來(lái)合成透明質(zhì)酸的表達(dá)載體pHK;
(5)將該重組載體pHK轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中獲得所述的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸的工程大腸桿菌 PHK/JM109 (CGMCC NO: 3926)。以上所述的大腸桿菌菌株pHK/JM109為高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌，其中pHK 為表達(dá)載體JM109為表達(dá)載體的宿主菌株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
1、本發(fā)明的工程大腸桿菌能產(chǎn)透明質(zhì)酸2g/L 2. 5g/L,比現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)大腸桿菌中表達(dá)革蘭氏陽(yáng)性鏈鎖狀球菌HA合成基因spHas和全新合成，優(yōu)化過(guò)密碼子并用于大腸桿菌表達(dá)的seHas基因獲得的最高約0. 2g/L的透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高近10倍。2、本發(fā)明第一次用在革蘭氏陰性菌來(lái)源的透明質(zhì)酸合成酶基因pmHas和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因i/iD在革蘭氏陰性宿主中表達(dá)來(lái)生產(chǎn)透明質(zhì)酸。3、本發(fā)明所構(gòu)建的重組表達(dá)載體pHK，含有廣譜的能在革蘭氏陰性細(xì)菌中復(fù)制的必需片段，且驅(qū)動(dòng)透明質(zhì)酸合成酶基因PmHas和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因i/iD表達(dá)的啟動(dòng)子，在大部分革蘭氏陰性細(xì)菌中有較好的活性，而使本發(fā)明的重組表達(dá)載體PHK， 可用于(其他非大腸桿菌)革蘭氏陰性細(xì)菌中生產(chǎn)透明質(zhì)酸。


圖1是本發(fā)明中透明質(zhì)酸合成酶催化鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖酸和鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖胺聚合形成透明質(zhì)酸的過(guò)程圖。圖2是本發(fā)明的共表達(dá)/7^/ s和Zfii 載體圖，其中A :pQHK僅用于在大腸桿菌中表達(dá)；B :pHK既可以用于在大腸桿菌中表達(dá)，還可以用于在其他革蘭氏陰性菌中表達(dá)；
圖3是本發(fā)明的顯示透明質(zhì)酸合成酶基因—Has)和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因ikfW在大腸桿菌JM109菌株中的表達(dá)圖，其中A :pQEpmHAS/JM109菌株中pmHAS表達(dá)檢測(cè)，B :pHK/JM109菌株中pmHAS和kfiD共表達(dá)檢測(cè).Al, Bl分別為pQEpmHAS/JM109菌株和pHK/JM109菌株，經(jīng)Ni-NTA-Agrose純化的電泳，顯示pmHas分子量約為llOkD，kfiD 分子量約為45kD，A2，B2為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(從上到下分子量分別為225 150 100 75 50 35 25 15 (KDa)，A3, B3 分別為pQE80L/JM109和pBQ/JM109 (空載體轉(zhuǎn)化)的總可溶性蛋白電泳，A4，B4分別為pQEpmHas/M109和pHK/JM109的總可溶性蛋白電泳。本發(fā)明所涉及的DNA序列說(shuō)明
序列表中SEQ ID NO :1所示的是源自多殺巴斯德菌(/^sieareWa SM^iocit/a subsp. Multocida中的透明質(zhì)酸合成酶基因編碼區(qū)核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO :2所示的是源自大腸桿菌k5菌株(中鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因kfiD的編碼區(qū)核苷酸序列。 序列表中SEQ ID NO :3所示的是克隆源自多殺巴斯德菌(Fasteurella multocida subsp. Multocida)中的透明質(zhì)酸合成酶基因fffi^ks的上游引物的堿基序列。序列表中SEQ ID NO :4所示的是克隆源自多殺巴斯德菌(/^asteure^a multocida subsp. Multocida)中的透明質(zhì)酸合成酶基因/^Hfes的下游引物的堿基序列。序列表中SEQ ID NO 5所示的是克隆源于大腸桿菌k5菌株中鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因i/iD的上游引物的堿基序列。序列表中SEQ ID NO 6所示的是克隆源于大腸桿菌k5菌株中鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因A/iD的下游引物的堿基序列。序列表中SEQ ID NO 7所示的是克隆T5:kfiD片段的上游引物的堿基序列。序列表中SEQ ID NO 8所示的是克隆T5:kfiD片段的下游引物的堿基序列。序列表中SEQ ID NO 9所示的是T5:kfiD片段的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO 10所示的是克隆PBRR122卡那霉素抗性基因及復(fù)制必需片段的上游引物的堿基序列。序列表中SEQ ID NO=Il所示的是克隆PBRR122卡那霉素抗性基因及復(fù)制必需片段的下游引物的堿基序列。序列表中SEQ ID NO 12所示的是質(zhì)粒pRP的核苷酸序列。本發(fā)明涉及的遺傳資源
1Pasteurella multocida subsp. multocida (Lehmann
and Neumann) Rosenbusch and Merchant)；遺傳資源取自美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心 (ATCC)；獲取方式購(gòu)買(mǎi)，價(jià)格225美金；獲取時(shí)間2008年1月；原始來(lái)源美國(guó)科學(xué)家KL Heddleston從火雞心臟中分離，獲取時(shí)間1962年4月
2:大腸桿菌 K5 菌株 ATCC23500 (fecAericAia coli (Migula) Castellani and Chalmers，serotype 02a，2b:K5 (L) :H4 ；遺傳資源取自美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(ATCC) 獲取方式購(gòu)買(mǎi)，價(jià)格225美金，獲取時(shí)間2008年9月原始來(lái)源美國(guó)疾病控制中心 (⑶C)科學(xué)家Kauffmarm從人尿中分離，及獲取時(shí)間1943年7月。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例作更詳細(xì)的描述，但本發(fā)明并不僅限于此。 實(shí)施例源自多殺巴斯德菌(/^1StetfreWasubsp. Jfo/iocit/a)中的透明質(zhì)酸合成酶基因的克隆和含有透明質(zhì)酸合成酶基因^fflfe1S的表達(dá)載體pQEpmHas的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株。具體步驟如下
(1)構(gòu)建含有透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)載體PQEpmHas，用PCR擴(kuò)增方法克隆源自 ^ ^ E^ (.Pasteurella mul tocida subsp. ifo/iocit/a)中的透明質(zhì)酸合成酶基因 {Pasteurella muliociVahyaluronic acid synthase PmHas),其 PCR 擴(kuò)±曾克隆所用弓 |物設(shè)計(jì)如下
上游引物pmHas Pl 為 5' -TAgfi^r<XATGAACACATTATCACAAGCAAT~3'，(序列表中 SEQ IDNo:3)含漢H I位點(diǎn)GGATCC和起始密碼子ATG ；
下游引物為為 5' -TA6^g67TTTATAGAGTTATACTATTAATAAT-3’ (序列表中 SEQ ID No 4)，含Sac I位點(diǎn)GAGCTC和終止密碼子TAA ；
PCR的模版為多殺巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)漢a H I和 I雙酶切后，連接入商用載體PQE80L中的相同酶切位點(diǎn)，插入片段經(jīng)DNA測(cè)序確證無(wú)突變后，將所獲載體命名為pQEpmHas，基因?yàn)?Mzfe1S如序列表中SEQ ID NO 1所示。大腸桿菌中pmHas表達(dá)，純化及活性測(cè)定
將含pQEpmHas大腸桿菌JM109菌株，在含100ug/L Amp (氨卞青霉素)LB (瓊脂固體)培養(yǎng)基，10g/L Tryptone (胰化蛋白胨)，5g/L Yeast extract (酵母提取物)，10g/L NaCl, pH 7.0，15g/L瓊脂平板上劃線以產(chǎn)生單菌落，挑取單菌落置于5ml含100u/L Amp 的LB在37°C、250 rpm培養(yǎng)14-16小時(shí)獲種子液；將種子液按100倍(V/V)培養(yǎng)在新的含 100u/L Amp的LB中生長(zhǎng)至培養(yǎng)物600nm光吸收約0. 5-0. 6 ；這時(shí)立刻加入終濃度為ImM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG),并在30°C培養(yǎng)6-8小時(shí)。培養(yǎng)物經(jīng)12000 rpm離心5min收集細(xì)菌，菌體用等體積50 mM (pH8. 0)磷酸鈉緩沖液洗滌后，再次離心收集，菌體以約0.2g鮮重/ml濃度懸浮于pH8.0，含50 mM 磷酸鈉，300mM NaCl, IOmM咪唑(imidazole)，ImM溶菌酶，2mM的蛋白酶抑制劑(DMSF)的混合液中后，低溫下(0-4°C)超聲波破碎為勻漿，細(xì)胞裂解物經(jīng)12000 RPM離心20 min,取上清液得風(fēng)辦浙粗提液。該粗提液加入到含Ni-NTA-Agrose (Sigma公司產(chǎn)品)的層析柱中，用pH 8. 0，含50mM磷酸鈉，300mM NaCl，20 mM咪唑(imidazole)溶液洗滌，和用pH 8.0，含50 mM磷酸鈉，300mM NaCl，250 mM咪唑(imidazole)溶液洗脫，收集洗脫液。該洗脫溶液經(jīng)IOmM pH7. 0 Tris- HCl透析過(guò)夜，得純化的透明質(zhì)酸合成酶(/ ^),從圖3 可見(jiàn)透明質(zhì)酸合成酶(ZMfes)在大腸桿菌JM109菌株中獲得高效表達(dá)，且被純化為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的單一條帶。透明質(zhì)酸合成酶的活性分析采用體外透明質(zhì)酸的積累來(lái)測(cè)定，酶促反應(yīng)是在 50ul 體系中進(jìn)行，該體系含 IOOmM Tris HCl (pH7. 0), 40mM MgS04, 0. 5mM 乙二醇二乙醚四乙酸(EGTA)，2mM，巰基乙醇0.1%牛血清白蛋白，(BSA)，2mM尿苷二磷酸6-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)，2mM尿苷二磷酸氮乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc^P IOul不同稀釋、不同純化過(guò)程中和不同階段的PmHas酶液。反應(yīng)物混合均勻后，在37°C條件下反應(yīng)60min后，用 900C 5min使酶失活終止反應(yīng)，離心反應(yīng)混合溶液，取上清測(cè)定透明質(zhì)酸含量。透明質(zhì)酸含量測(cè)定采用透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(Hyaluronic Acid Binding Protein, HABP)來(lái)測(cè)定，本發(fā)明采用透明質(zhì)酸放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，http://WWW. bnibt. com,)來(lái)分析，該分析試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法，即標(biāo)準(zhǔn)或待測(cè)樣品中的HA和125I-HA共同與限量的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(HABP)在適宜的條件下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。一部分125I-HA與HABP結(jié)合形成復(fù)合物，而另一部分呈游離狀態(tài)。 125I-HA與HABP結(jié)合的比例取決于標(biāo)準(zhǔn)或待測(cè)樣品中非標(biāo)記HA的含量，非標(biāo)記HA的含量越高，125I-HA與HABP形成的復(fù)合物越少。HA-HABP復(fù)合物與HABP抗體和第二抗體形成交聯(lián)的聚合物沉淀下來(lái)，測(cè)定沉淀物的放射性計(jì)數(shù)。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理后可獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出被測(cè)樣品的HA含量。1酶活性單位(U)定義為1小時(shí)催化形成Iug 透明質(zhì)酸分子數(shù)。酶液中蛋白含量采用伯樂(lè)(Bio-Rad)公司蛋白測(cè)定試劑盒(www. biorad.com)并用牛血清白蛋白(BSA)為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，以計(jì)算酶的比活。表1數(shù)據(jù)表明基因在大腸桿菌中獲得活性表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌，其特征在于其分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌 (.Escherichia co/i )，保藏號(hào)為 CGMCC No. 3926。
2.權(quán)利要求1所述的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)構(gòu)建含有透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)載體PQEpmHas,用PCR擴(kuò)增方法克隆源自 ^ ^sWiMM (.Pasteurella multoeida subsp. ifo/iocit/a)中的透明質(zhì)酸合成酶基因 {Pasteurella muliociVahyaluronic acid synthase PmHas),其 PCR 擴(kuò)±曾克隆所用弓 |物設(shè)計(jì)如下上游引物 pmHas Pl 為 5' -TAgfi^r<XATGAACACATTATCACAAGCAAT~3'(序列表中 SEQ ID No 3)，含漢H I位點(diǎn)GGATCC和起始密碼子ATG ；下游引物為風(fēng) 湯計(jì)2 為 5' -TA6^g67TTTATAGAGTTATACTATTAATAAT-3’ (序列表中 SEQ ID No 4)，含Sac I位點(diǎn)GAGCTC和終止密碼子TAA ；PCR的模版為多殺巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)漢a H I和 I雙酶切后，連接入商用載體PQE80L中的相同酶切位點(diǎn)，插入片段經(jīng)DNA測(cè)序確證無(wú)突變后，將所獲載體命名為PQEpmHas，基因?yàn)?序列表中SEQ ID No:l)；(2)構(gòu)建含尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的表達(dá)載體pQEkfiD，用PCR擴(kuò)增方法克隆源自源于大腸桿菌(fecAericAia ColirE. cWi)菌株k5中鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因(K5 capsule gene D，i/iD)，擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)如下上游引物IfiD Pl: 5' - TGGAGArmTGTTCGGAACACTAAAAATAACT G-3，(序列表中 SEQ ID No:5)，含Bgl II位點(diǎn)AGATCT，和起始密碼子ATG)；下游引物IfiD P2 5' -TT^TT^gTTAGTCACATTTAAA CMATCGCGAC-3'(序列表中 SEQ ID No 6)，含Xho I位點(diǎn)CTCGAG和終止密碼子TAA ；PCR的模版為大腸桿菌菌k5菌株ATCC 23500的基因組D N A，成功擴(kuò)增并純化的產(chǎn)物，給B gl II和損ο I雙酶切后，連接入Qiagen公司的商用載體pQE80L的漢警H I和 Sal I位點(diǎn)，所得載體經(jīng)DNA測(cè)序分析確證插入片段無(wú)突變后，所獲載體命名為pQEkfiD， 相應(yīng)基因命名為A/iD基因(序列表中SEQ ID No:2)；(3)構(gòu)建大腸桿菌中共同表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體根據(jù)構(gòu)建好的pQEkfiD載體的DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增T5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)i/iD表達(dá)的片段T5:kfiD，引物序列設(shè)計(jì)如下上游引物 T5kfiD Pl 5' -TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCACrTCGAGA-3'(序列表中 SEQ ID No: 7)，該引物含有fee I位點(diǎn)，GAGCTC，其中下標(biāo)G表示將原始pQESOL載體中C突變?yōu)?G,以消除其損ol位點(diǎn)，CTCGAG ；下游引物 T5kfiD P2 5' -TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT-3'(序列表中 SEQ ID No:8)，該引物含損ο I site, CTCGAG ；PCR的模版用pQEkfiD載體，純化的T5 kfiD擴(kuò)增產(chǎn)物，首先連接入pGEM-T-Vector 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，獲中間載體pT-T5KfiD，該載體中T5 kfiD (序列表中SEQ ID No 9)片段，經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)核苷酸順序無(wú)突變后，該插入pT-T5KfiD片段經(jīng)Sac I和Xho I雙酶切后，連接入表達(dá)載體pQEpmHas的fee I和I位點(diǎn)而獲pfflfes和A/iD基因在大腸桿菌中共表達(dá)的重組載體PQHK ；(4)表達(dá)載體pHK的構(gòu)建用德國(guó)MoBiTec公司的革蘭氏陰性菌宿主廣譜質(zhì)粒pBBR122的DNA序列(GenBank No. Y14439)設(shè)計(jì)引物上游引物 PBBR Pl 5' -TTTGGTGTCGACCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGG-3'(序列表中 SEQ ID NO 10)；含有fe/I酶切位點(diǎn)，GTCGAC ；下游引物 PBBR Pl 5' -TTAGGTGTCGACTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG-3'(序列表中 SEQ ID NO 11)，含有 SalI 酶切位點(diǎn)，GTCGAC ；用上述引物擴(kuò)增質(zhì)粒PBBR122中包含其復(fù)制位點(diǎn)及卡那霉素抗性基因在內(nèi)的片段， PCR 擴(kuò)增的參數(shù)為95°C、2 min，1 個(gè)循環(huán)；94°C、30s，55°C>30s, 72°C、3min，25 個(gè)循環(huán)；72°C、10 min 1個(gè)循環(huán)，純化3. 2 kb擴(kuò)增產(chǎn)物，用fe/ I酶解后，加入連接酶讓其自連， 自身連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，并用卡那霉素篩選獲質(zhì)粒pRP (序列表中SEQ ID NO 12)，提取質(zhì)粒pRP，經(jīng)SalI 酶解后，連接入上述能在大腸桿菌中共表達(dá)pmHas和i/iD 基因的PQHK的損ol位點(diǎn)，獲得在革蘭氏陰性菌中共表達(dá)^ffife1S和i/iD來(lái)合成透明質(zhì)酸的表達(dá)載體PHK ；(5)將該重組載體pHK轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中獲得所述的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸的工程大腸桿菌 PHK/JM109 CGMCC NO: 3926。
全文摘要
本發(fā)明是高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌及其制備方法。該工程大腸桿菌通過(guò)構(gòu)建含有透明質(zhì)酸合成酶基因Has和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因在大腸桿菌中共同表達(dá)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌而獲得。本發(fā)明所提供的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌是pHK/JM109 CGMCC No.3926。用本發(fā)明的工程大腸桿菌能產(chǎn)透明質(zhì)酸2g～2.5g/L,比現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)大腸桿菌中表達(dá)革蘭氏陽(yáng)性鏈鎖狀球菌HA合成基因spHas獲得的最高HA產(chǎn)量提高近10倍多。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102154190SQ20111000621
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者尚海麗, 楊發(fā)祥, 毛自朝, 程倩 申請(qǐng)人:云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司