專利名稱：一種密碼子優(yōu)化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因及其表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及一種密碼子優(yōu)化的葡萄糖苷酶Mbgl基因及其表達。
背景技術：
β-葡萄糖苷酶(i3-gluCOSidaSe，EC3. 2. 1.21)，又稱β _D_葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是纖維素酶的一個關鍵組分，它能夠催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中發(fā)現了葡萄糖苷酶。后來的研究發(fā)現，葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、動物和微生物中，它參與生物體的糖代謝和胞內信號傳導等，對維持生物體正常生理功能起著重要作用。β -葡萄糖苷酶在食品、飼料、醫(yī)療、生物能源等領域具有重要的應用價值。在食品工業(yè)中，葡萄糖苷酶能將水果、蔬菜、茶葉中的風味前體物質轉化為具有濃郁天然風味的香氣物質，用于食品增香；β -葡萄糖苷酶可以幫助多酚葡萄糖昔轉化為游離多酚，以提高多酚的生物活性或者幫助分離分析多酚；水解含有氰醇與葡萄糖形成的糖苷，消除不穩(wěn)定氰醇的毒性等。在飼料工業(yè)中，β-葡萄糖苷酶可以用于對飼料中纖維素的降解，促進豬、雞等非反芻動物影響的吸收；在生物能源領域，葡萄糖苷酶是纖維素轉化生成乙醇的關鍵酶之一，通過水解纖維素分解過程中的纖維二糖，可以有效地減少纖維二糖纖維素酶的抑制作用。此外，β-葡萄糖苷酶在合成低聚龍膽糖等寡糖和相關的糖復合物中有廣泛的應用前景。相對于真表達系統(tǒng)而言，大腸桿菌作為一種非常成熟的原核表達系統(tǒng)有諸多優(yōu)點1)對大腸桿菌的遺傳背景和生理特性研究已相當徹底，已有很多不同抗藥性、不同營養(yǎng)依賴型和不同校正突變型的菌種供選擇應用，可以根據不同的載體而選擇不同的菌種；2)盡管大腸桿菌細胞的空間小，但繁殖能力強，在營養(yǎng)條件充足時，20 30min即可繁殖一代，而且大規(guī)模發(fā)酵成本低，具有巨大的生產潛力；幻表達水平一般較真核系統(tǒng)高，某些外源基因在大腸桿菌中的表達量可達總蛋白的5% 30%，且下游工藝簡單、易于控制。因此，大腸桿菌是生產β -葡萄糖苷酶較為理想的表達系統(tǒng)。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種密碼子優(yōu)化的β -葡萄糖苷酶Mbgl基因及其表達，所述β -葡萄糖苷酶Mbgl基因通過連續(xù)延伸PCR方法合成，并將本發(fā)明合成的葡萄糖苷酶Mbgl基因轉化入大腸桿菌EG50中表達出高比活的葡萄糖苷酶。為達到上述目的，本發(fā)明通過以下技術方案來實現所述β -葡萄糖苷酶Mbgl基因的核苷酸序列SEQ ID NO 1所示。所述β-葡萄糖苷酶Mbgl基因的核苷酸序列編碼的蛋白質序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明按照偏愛密碼子對野生型的Mbgl基因進行改造，改造后的基因序列與野生型序列(GenBank Accession No. CP000749)同源性為80% (參見圖1)，其編碼的蛋白質共447個氨基酸。本發(fā)明的經密碼子優(yōu)化的β -葡萄糖苷酶Mbgl基因合成采用連續(xù)延伸PCR方法。兩側引物分別加入BamHI和McI酶切位點，使用的引物如下Pl :GGA, TCC, ATG，TCT，ATC, ACT, CTT，CCA, TCT，CAC, TCC, AAG，ATG，CTG，ACC, TCC,GAC，TTC，ATC，TTTP2 :TGG, TAG, CAC, CTT，CAA, TCT，GGA, AAG，AGG，CAG，TAG, CAA, CAC, CAA, AGA, TGA,AGT，CGG，AGG，TCAP3 :CCA, GAT，TGA, AGG，TGC, TAC, CAC, TGC, TGA, CAA, CAG，ACT, CCC, ATC, CAT, CTG，GGA，TAC，CTT，CTGP4 :CTC, ACC, ATT，GTC, CAT, ACC, TTT，GAC, CTT，GCC, TGG，AGT，AGC, ACA, GAA, GGT，ATC，CCA，GAT，GGAP5:AAG, GTA, TGG，ACA, ATG，GTG，AGA, TTG，CTT，GTG，ACC,ACT,ATC,ATC,TCT，GGG，AAC，AAG，ACA，TTCP6 :GAG, AGT，CTG，TAG, GCA, TCA, ACA, CCA, AGG，TCT，TTG，ATC, AGC, TGA, ATG，TCT，TGT，TCC，CAG，AGAP7 :GTT, GAT，GCC, TAC, AGA, CTC, TCC, ATT，GCT，TGG，CCA, AGA, GTC, ATG，GAC, AAG，AAA, GGT，GAA，GCTP8 :TCT, TGA, GCA, GGT，TTC, TGT，AGA, AGT，CCA, GAC, CAG，CTT，GGT，TAG, CTT，CAC,CTT，TCT，TGT，CCAP9 :CTA, CAG，AAA, CCT，GCT，CAA, GAA, GCT，CAA, GGC, TGA, AGG，TCT，CAC, TGT，CTT，TGC，TAC，TCT，CTAPlO :ACC, ACC,AGT，AGC，AAA, GAC，AGTPll :ACC, TGG,AGT，TCA，AGA，ACT, ATGP12 :GAG, TCA,TTC，TTG，AAC，TGG，TAGP13 :CTT, GCT,TGT，GCT，GCC，ATC，CTTP14 :GTT, TGG,TGG，CAG，CAC，AGA，ATGP15 :TGC, TCC,CCA，CAT, CTT，GCT，CGCP16 :TGG, AGC,CAA，GAT，GTG，GTG，AGCP17 :TCA, TCA,ACA，TGA，ACA，GAT，CCTP18 :AAG, CAA,CTG，TTC，ATG，TTG，AGA
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TTT，GTC，TTC，CAG，GTG，CTG，TGG，CAG，ATC，CCA，ATG，GTA，GAG，AAG，ACA，AAG，GTG，GTT，GGC，TCA，ACA，GAG，AGA，CTG，CCT，ACC，ACC，CAC，TCA，GCA，AGC，TCT，TTA，GTG，ACC，AGG，TCA，GCA，TAG,GAG，TGG，GTT，GAC，TCT，TGG，GCT，ACC，TTC，AAC，GAA，CCA，TTC，ACA，AAC，CAG，GAG，CAT, GGA，TAC，CCA，GCT，CAT, AGC，CAA，GGA，TGG，TTT，GTC，CAA，ACC，AGC，CTT，TGG，TAG, ACA，AGC，TGC，TCA，GTT，CTT，TCT，GAT，GAC，TGG，AAG，AGC，CAA，GCC，ATG，AGC，GAG，GAA，AGA，ACG，CTC，CAA，AGT，CTC，AAG，TTG，GTA，TCG，TTC，TCA，GCA，AAC，TGG，TCT，TCG，GTC，TTC，TCA，GAG，GCA，GCA，TAG, GAT，
P19 :GAA, GAC, CAG，TTT，GCT，TGC，TTG，ATG，AGA，GAG，ACT, CTC，GAC，AAC，CAG，TTC，TTC，ATC，GAA，CCAP20 :CAA, CAG，TCT，TCA，GCA，ACT, GTG，GGT，ACT, GAC，CCT，TCA，TCA，GTG，GTT，CGA，TGA，AGA，ACT, GGTP21 :ACA, GTT, GCT, GAA, GAC, TGT, TGC, TCC, ACA, GTA, CTT, GCC, AAC, CAT, CCT,TCC，AGG，TGA，CAT, GGAP22 :GAA, GTT, CAT, GCC, AAG, GAA, GTC, GAT, TGG, TTG, AGA, GAT, GAT, GTC, CAT,GTC，ACC，TGG，AAG，GATP23 :ACT, TCC, TTG, GCA, TGA, ACT, TCT, ACA, CTT, GCA, ATC, ACA, ATG, CCT, ACG,ATG，CTG，ATG，ACA，TGTP24 :TCA, GTG，TAC，TCA，ACA，GTC，TGA，GAG, TTC，TGG，ACG，TTC，TTG，AAC，ATG，TCA，TCA，GCA，TCG，TAGP25 :CAG, ACT, GTT, GAG, TAC, ACT, GAC, ATC, GGT, TGG, GAG, ATT, GCT, CCA, CAT,GCC，TTC，ACT, GAA，CTGP26 :AGA, TTG, GTG, GAA, GAG, AGT, ACT, GCT, TGT, GGA, GGT, TGA, CCA, ACA, GTT,CAG，TGA，AGG，CAT, GTGP27 :GTA, CTC, TCT, TCC, ACC, AAT, CTA, CAT, CAC, TGA, GAA, TGG, TGC, TGC, TTG,CGC，TGA，TCA，GAT，CATP28 :CAG, GTA，TCT，GAC，TCT，CTG，TTC，GTC，GTT，GAT，CTC，ACC，ATC，GAT，GAT，CTG，ATC，AGC，GCA，AGCP29 :AAC, AGA, GAG, TCA, GAT, ACC, TGG, ATG, GTC, ACA, TCA, ACG, CTG, TCA, ATC,AGG，CTA，TTG，AGT，CTGP30 :TCC, ATC，AGA，GAC，CAA，GCG，AAG，TAA，CCT，CTG，ATG，TCA，ACA，CCA，GAC，TCA，ATA，GCC，TGA，TTGP31 :TTC, GCT，TGG，TCT，CTG，ATG，GAC，AAC，TTC，GAA，TGG，GCT，GAA，GGT，TAC，TCC，AAG，AGA，TTC，GGTP32 :TGA, TGG, TCC, TCT, CTT, GAG, TCT, GAT, AGT, CAA, CGT, AGG, TGA, GAC, CGA,ATC，TCT，TGG，AGT，AACP33 :GAC, TCA, AGA, GAG, GAC, CAT, CAA, GAG, AAG, TGG, TCA, TGC, TTA, CCA, GAC,TCT，TCT，CTC，TTC，CAGP34 :GAGCTCTTA, ATG，GTG，ATG，GTG，ATG，ATG，ACC，CTT，TCT，GGA，AGA，GAG, AAG，AGT，CTG回收PCR擴增產物，使其與pMD18-T載體相連(Takara)，4°C連接過夜，高效轉化DH5a感受態(tài)中，獲得陽性克隆。抽取該陽性克隆質粒，經BamHI和McI雙酶切后，通過T4DNA連接酶與大腸桿菌表達載體PYPG251連接，酶切鑒定和序列測定獲得了含有目的基因的重組質粒pYMbgl。包括所述β -葡萄糖苷酶Mbgl基因的pYMbgl載體，用于大腸桿菌表達中。利用電擊法將上述pYMbgl質粒轉入大腸桿菌EG50中，在含有X-Gal的2YT板上有藍色菌落出現，表明β-葡萄糖苷酶Mbgl基因有降解X-Gal的活性(參見圖4)。
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以鄰硝基苯- β -D-吡喃葡萄糖苷(ONPG)為底物，Mbgl表達產物的比活可達到232umg_1min_1 以上。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明按大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化合成的葡萄糖苷酶Mbgl基因與野生型Mbgl基因的同源性高達80 %，并且包含本發(fā)明所述β -葡萄糖苷酶Mbgl基因的pYMbgl載體可在大腸桿菌中表達出高比活的β-葡萄糖苷酶，且Mbgl表達產物的比活可達到232umg^min-1以上，在食品、醫(yī)藥、生物能源等領域有廣泛的應用潛力。


圖1為本發(fā)明采用連續(xù)延伸PCR方法合成密碼子優(yōu)化的β -葡萄糖苷酶Mbgl基因的步驟。圖2為本發(fā)明密碼子優(yōu)化的β-葡萄糖苷酶Mbgl基因和野生型β-葡萄糖苷酶Mbgl基因序列比對圖，其中，上行為野生型葡萄糖苷酶Mbgl基因；下行為本發(fā)明密碼子優(yōu)化的β-葡萄糖苷酶Mbgl基因，兩者同源性=80%。圖3為本發(fā)明的用于大腸桿菌表達的pYMbgl載體。圖4為本發(fā)明密碼子優(yōu)化的β -葡萄糖苷酶Mbgl基因在大腸桿菌中表達的功能性驗證。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案。本發(fā)明實施中未注明的實驗方法，如連接、轉化、相關培養(yǎng)基的配制等參照《分子克隆實驗指南》第三版(黃培堂等譯，中國，科學出版社，2002)中的方法進行。未注明的化學藥品為分析純級，購自上海國藥集團有限公司。相關的DNA回收試劑盒、載體、連接酶、核酸內切酶均購自Takara公司，DH5 α感受態(tài)、大腸桿菌EG50由上海市農業(yè)科學院生物技術研究所植物基因工程研究室保存。實施例1密碼子優(yōu)化β -葡萄糖苷酶基因的合成本發(fā)明根據來源于海洋單胞菌(Marinomonas MWYL1)的Mbgl序列(GenBankAccessionNo. CP000749)，采取連續(xù)延伸PCR方法合成密碼子優(yōu)化的β -葡萄糖苷酶Mbgl基因。由上海生物工程有限公司合成34條引物，用于β-葡萄糖苷酶Mbgl基因的合成。合成方法如圖1所示，合成使用的Taq DNA聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司日本)，在50 μ L反應體系中進行。50 μ L反應體系為ddH20 11 μ L ;2XPCR緩沖液25 μ L ;2mM dNTPs10 μ L ；KOD FXl μ L ；兩側引物各IOOng,內側引物各10ng，補足無菌水至50 μ L。擴增條件為94°C預熱 IOmin ；94°C, 30s, 54°C, 30s, 72°C, 40s, 30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0 第一步，分別以P1、P12，P13、P24，P25、P34為兩側引物合成片段1、片段2、片段3 ；第二步，各取1 μ L片段1、片段2、片段3為模板，用引物PI、Ρ34擴增得到目的基因Mbgl。使用的引物如下P1 GGA，TCC，ATG，TCT，ATC，ACT，CTT，CCA，TCT，CAC,TCC,AAG,ATG，CTG,ACC,TCC,GAC，TTC，ATC，TTTP2 TGG，TAG，CAC，CTT，CAA，TCT，GGA，AAG，AGG，CAG，TAG，CAA，CAC，CAA，AGA，TGA，AGT，CGG，AGG，TCAP3 :CCA,GAT，TGA，AGG，TGC，TAC，CAC，TGC，TGA，CAA，CAG，ACT,CCC，ATC，CAT,CTG，GGA，TAC，CTT，CTGP4 CTC，ACC，ATT，GTC，CAT，ACC，TTT，GAC，CTT，GCC，TGG，AGT，AGC，ACA，GAA，GGT，ATC，CCA，GAT，GGAP5 :AAG, GTA, TGG, ACA, ATG, GTG, AGA, TTG, CTT，GTG, ACC, ACT, ATC, ATC, TCT，GGG,AAC，AAG，ACA，TTCP6 :GAG,AGT，CTG，TAG,GCA，TCA，ACA，CCA，AGG，TCT，TTG，ATC，AGC，TGA，ATG，TCT，TGT，TCC，CAG，AGAP7 :GTT,GAT，GCC，TAC，AGA，CTC，TCC，ATT，GCT，TGG，CCA，AGA，GTC，ATG，GAC，AAG，AAA, GGT，GAA，GCTP8 :TCT, TGA, GCA, GGT，TTC, TGT，AGA, AGT，CCA, GAC, CAG, CTT，GGT，TAG, CTT，CAC,CTT，TCT，TGT，CCAP9:CTA, CAG，AAA,CCT，GCT，CAA，GAA，GCT，CAA，GGC，TGA，AGG，TCT，CAC，TGT，CTT，TGC，TAC，TCT，CTAPlO :ACC, ACC, TTT, GTC, TTC, CAG, GTG, CTG, TGG, CAG, ATC, CCA, ATG, GTA, GAG,AGT，AGC，AAA, GAC，AGTPll :ACC, TGG, AAG, ACA, AAG, GTG, GTT, GGC, TCA, ACA, GAG, AGA, CTG, CCT, ACC,AGT，TCA，AGA，ACT, ATGP12 :GAG, TCA, ACC, CAC, TCA, GCA, AGC, TCT, TTA, GTG, ACC, AGG, TCA, GCA, TAG,TTC，TTG，AAC，TGG，TAGP13 :CTT, GCT, GAG, TGG，GTT，GAC，TCT，TGG，GCT，ACC，TTC，AAC，GAA，CCA，TTC，TGT，GCT，GCC，ATC，CTTP14 :GTT, TGG, ACA，AAC，CAG，GAG，CAT, GGA，TAC，CCA，GCT，CAT, AGC，CAA，GGA，TGG，CAG，CAC，AGA，ATGP15 :TGC, TCC, TGG，TTT，GTC，CAA，ACC，AGC，CTT，TGG，TAG, ACA，AGC，TGC，TCA，CCA，CAT, CTT，GCT，CGCP16 :TGG, AGC, GTT，CTT，TCT，GAT，GAC，TGG，AAG，AGC，CAA，GCC，ATG，AGC，GAG，CAA，GAT，GTG，GTG，AGCP17 :TCA, TCA, GAA，AGA，ACG，CTC，CAA，AGT，CTC，AAG，TTG，GTA，TCG，TTC，TCA，ACA，TGA，ACA，GAT，CCTP18 :AAG, CAA, GCA, AAC, TGG, TCT, TCG, GTC, TTC, TCA, GAG, GCA, GCA, TAG, GAT,CTG，TTC，ATG，TTG，AGAP19 :GAA, GAC, CAG，TTT，GCT，TGC，TTG，ATG，AGA，GAG，ACT, CTC，GAC，AAC，CAG，TTC，TTC，ATC，GAA，CCAP20 :CAA, CAG，TCT，TCA，GCA，ACT, GTG，GGT，ACT, GAC，CCT，TCA，TCA，GTG，GTT，CGA，TGA，AGA，ACT, GGTP21 :ACA, GTT, GCT, GAA, GAC, TGT, TGC, TCC, ACA, GTA, CTT, GCC, AAC, CAT, CCT,TCC，AGG，TGA，CAT, GGA
P22 :GAA, GTT, CAT, GCC, AAG, GAA, GTC, GAT, TGG, TTG, AGA, GAT, GAT, GTC, CAT,GTC，ACC，TGG，AAG，GATP23 :ACT, TCC, TTG, GCA, TGA, ACT, TCT, ACA, CTT, GCA, ATC, ACA, ATG, CCT, ACG,ATG，CTG，ATG，ACA，TGTP24 :TCA, GTG，TAC，TCA，ACA，GTC，TGA，GAG, TTC，TGG，ACG，TTC，TTG，AAC，ATG，TCA，TCA，GCA，TCG，TAGP25 :CAG, ACT, GTT, GAG, TAC, ACT, GAC, ATC, GGT, TGG, GAG, ATT, GCT, CCA, CAT,GCC，TTC，ACT, GAA，CTGP26 :AGA, TTG, GTG, GAA, GAG, AGT, ACT, GCT, TGT, GGA, GGT, TGA, CCA, ACA, GTT,CAG，TGA，AGG，CAT, GTGP27 :GTA, CTC, TCT, TCC, ACC, AAT, CTA, CAT, CAC, TGA, GAA, TGG, TGC, TGC, TTG,CGC，TGA，TCA，GAT，CATP28 :CAG, GTA，TCT，GAC，TCT，CTG，TTC，GTC，GTT，GAT，CTC，ACC，ATC，GAT，GAT，CTG，ATC，AGC，GCA，AGCP29 :AAC, AGA, GAG, TCA, GAT, ACC, TGG, ATG, GTC, ACA, TCA, ACG, CTG, TCT, ATC,AGG，CTA，TTG，AGT，CTGP30 :TCC, ATC，AGA，GAC，CAA，GCG，AAG，TAA，CCT，CTG，ATG，TCA，ACA，CCA，GAC，TCA，ATA，GCC，TGA，TTGP31 :TTC, GCT，TGG，TCT，CTG，ATG，GAC，AAC，TTC，GAA，TGG，GCT，GAA，GGT，TAC，TCC，AAG，AGA，TTC，GGTP32 :TGA, TGG, TCC, TCT, CTT, GAG, TCT, GAT, AGT, CAA, CGT, AGG, TGA, GAC, CGA,ATC，TCT，TGG，AGT，AACP33 :GAC, TCA, AGA, GAG, GAC, CAT, CAA, GAG, AAG, TGG, TCA, TGC, TTA, CCA, GAC,TCT，TCT，CTC，TTC，CAGP34 :GAGCTCTTA, ATG，GTG，ATG，GTG，ATG，ATG，ACC，CTT，TCT，GGA，AGA，GAG, AAG，AGT，CTG按密碼子優(yōu)化合成的β -葡萄糖苷酶Mbgl基因開放閱讀框為1344bp，不包含酶切位點。PCR反應得到1344bp的片段即為本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶Mbgl基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的蛋白質序列如SEQ ID NO 2所示。通過DNAMAN軟件進行同源性比對，結果發(fā)現本發(fā)明合成基因序列與原基因序列同源性為80% (參見圖2)，其編碼的蛋白質共447個氨基酸。實施例2Mbgl基因在大腸桿菌中的表達和純化2. 1大腸桿菌表達載體的構建1. 5%瓊脂糖膠回收實例1中的PCR擴增產物，取10μ L回收產物與pMD18_T載體相連。4°C連接過夜，高效轉化DH5 α感受態(tài)中，獲得陽性克隆。抽取陽性克隆質粒，經BamHI和Mel雙酶切后，以正確的閱讀框插入到大腸桿菌表達載體PYPG251中，測序驗證，得到重組質粒pYMbgl(參見圖3)。2. 2Mbgl基因的功能性表達利用電擊法將pYMbgl質粒轉入大腸桿菌EG50中，涂布于含有Ap (氨芐青霉素，100 μ g/ml)和x-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖甘，100 μ g/ml)的2YT固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜至長出藍色菌落(參見圖4)。挑取新鮮轉化的含有重組質粒PYMbgl的單克隆，接入50ml含有Ap (100 μ g/ml)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，用250ml搖瓶，37°C震搖培養(yǎng)至OD6tltl值達到0. 6-1. 0。將搖瓶置于冰上5分鐘，5000rpm 4°C離心5分鐘收集菌體。重懸細胞于5ml預冷的破碎緩沖液(50mM磷酸緩沖液，0. 3M NaCl，0. 5mg/ml溶菌酶，ImM PMSF, ImM MgCl2)中。把混合菌體在冰水中用超聲破碎儀破碎，破碎好的菌液經12000rpm，4°C離心30分鐘后，上清用0. 45 μ m的濾膜過濾后，收集濾液。相關培養(yǎng)基的配制2YT固體培養(yǎng)基胰化蛋白胨8g ；酵母提取物5g ；NaCl 2. 5g ；瓊脂粉12g，用蒸餾水定容至1L。LB液體培養(yǎng)基胰化蛋白胨5g ；酵母提取物IOg ；NaCl 10g，用蒸餾水定容至1L。2. 3表達產物的純化表達產物的純化采用Sigma公司的Ni2+-NTA親和層吸柱，具體純化步驟為1)用6ml緩沖液A平衡親和柱；2)取實施例2. 2所得的濾液進行上樣；3)用IOml緩沖液B洗去層析柱中未結合蛋白；4)每次用Iml緩沖液C洗脫，收集含有目的蛋白的洗脫液。其中，緩沖液A :50mM磷酸緩沖液，500mM NaCl，IOmM咪唑，1 %甘油，1 %吐溫，1 %triton,l% β-巰基乙醇，pH 值 8.0。緩沖液B :50mM磷酸緩沖液，500mM NaCl, 50mM咪唑，1 %甘油，1 %吐溫，1 %triton,l% β-巰基乙醇，pH 值 8.0。緩沖液C :50mM磷酸緩沖液，500mM NaCl，250mM咪唑，1 %甘油，1 %吐溫，1 %triton,l% β-巰基乙醇，pH 值 8.0。實施例3Mbgl基因在大腸桿菌表達產物的酶活測定3. 1鄰硝基苯酚標準曲線的繪制準確吸取0. 5mM 鄰硝基苯酚溶液 20 μ L、30 μ L、40 μ L、50 μ L、60 μ L、70 μ L，用 Zm緩沖液補足到200 μ L，分別加入60 μ L IM Na2CO3終止顯色，反應完成后測定420nm的光吸收值。以鄰硝基苯酚濃度為Y軸，光吸收值為X軸，繪制標準曲線。3.2Mbgli3-葡萄糖苷酶酶活力測定酶活測定采用分光光度法，具體實施方法為取實施例2純化所得的濃度為0. 01 μ g/ μ L的酶液20 μ L，20mM鄰硝基苯-β -D-吡喃葡萄糖苷(ONPG) 20 μ L，Zm緩沖液(pH 7. 0)16(^1^，充分混勻后置371水浴保溫101^11，然后加入6(^1^ IM Na2CO3終止顯色，使用infiniteM200多功能酶標儀(TECAN)測定420nm處比色測定光吸收值的變化。根據鄰硝基苯酚標準曲線計算β-葡萄糖苷酶的活力。其中，酶活力單位(U)的定義在該反應條件下，以每分鐘產生1 μ mol鄰硝基苯酚所需的酶量定義為1個單位。經過測定，Mbgl表達產物在以20mM鄰硝基苯- β -D-吡喃葡萄糖苷(ONPG)為底物時，比活達到232u mg-W-1。相關試劑的配制
Zm 緩沖液(50mL) :0. 80g Na2HPO4 · 7H20 (0. 06M) ；0. 28g NaH2PO4 · H2O (0. 04M)；0. 5mLlM KCl (0· 01M) ；0. 05mL IM MgSO4 (0. 001M) ；0. 135mL β -巰基乙醇(BME) (0· 05Μ)；溶解到40mL蒸餾水中，調節(jié)pH到7. 0，最后定容到50mL，4°C保存。最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。
權利要求
1.一種密碼子優(yōu)化的葡萄糖苷酶Mbgl基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1 所示。
2.根據權利要求1所述的葡萄糖苷酶Mbgl基因，其特征在于，其編碼的蛋白質序列如SEQ ID No 2所示。
3.根據權利要求1或2所述的葡萄糖苷酶Mbgl基因，其特征在于，所述基因采用連續(xù)延伸PCR方法合成。
4.根據權利要求3所述的葡萄糖苷酶Mbgl基因，其特征在于，所述連續(xù)延伸PCR方法中所用的引物具體如下Pl :GGA, TCC, ATG, TCT，ATC, ACT, CTT，CCA, TCT，CAC, TCC, AAG, ATG, CTG, ACC, TCC, GAC,TTC, ATC, TTTP2 :TGG, TAG, CAC，CTT，CAA，TCT，GGA，AAG，AGG，CAG，TAG, CAA，CAC，CAA，AGA，TGA，AGT，CGG，AGG，TCAP3 :CCA, GAT，TGA，AGG，TGC，TAC，CAC，TGC，TGA，CAA，CAG，ACT, CCC，ATC，CAT, CTG，GGA，TAC，CTT，CTGP4 :CTC, ACC，ATT，GTC，CAT, ACC，TTT，GAC，CTT，GCC，TGG，AGT，AGC，ACA，GAA，GGT，ATC，CCA，GAT，GGAP5 :AAG, GTA, TGG, ACA, ATG, GTG, AGA, TTG, CTT，GTG, ACC, ACT, ATC, ATC, TCT，GGG, AAC,AAG，ACA，TTCP6 :GAG, AGT，CTG，TAG, GCA，TCA，ACA，CCA，AGG，TCT，TTG，ATC，AGC，TGA，ATG，TCT，TGT，TCC，CAG，AGAP7 :GTT, GAT，GCC，TAC，AGA，CTC，TCC，ATT，GCT，TGG，CCA，AGA，GTC，ATG，GAC，AAG，AAA,GGT，GAA，GCTP8 :TCT, TGA，GCA，GGT，TTC，TGT，AGA，AGT，CCA，GAC，CAG，CTT，GGT，TAG, CTT，CAC，CTT，TCT, TGT, CCAP9 :CTA, CAG，AAA, CCT，GCT，CAA，GAA，GCT，CAA，GGC，TGA，AGG，TCT，CAC，TGT，CTT，TGC，TAC，TCT，CTAPlO :ACC, ACC, TTT, GTC, TTC, CAG, GTG, CTG, TGG, CAG, ATC, CCA, ATG, GTA, GAG, AGT,AGC，AAA, GAC，AGTPll :ACC, TGG, AAG, ACA, AAG, GTG, GTT, GGC, TCA, ACA, GAG, AGA, CTG, CCT, ACC, AGT,TCA，AGA，ACT, ATGP12 :GAG, TCA, ACC, CAC, TCA, GCA, AGC, TCT, TTA, GTG, ACC, AGG, TCA, GCA, TAG, TTC,TTG，AAC，TGG，TAGP13 :CTT, GCT, GAG, TGG, GTT, GAC, TCT, TGG, GCT, ACC, TTC, AAC, GAA, CCA, TTC, TGT,GCT，GCC，ATC，CTTP14 :GTT, TGG, ACA, AAC, CAG, GAG, CAT, GGA, TAC, CCA, GCT, CAT, AGC, CAA, GGA, TGG,CAG，CAC，AGA，ATGP15 :TGC, TCC, TGG, TTT, GTC, CAA, ACC, AGC, CTT, TGG, TAG, ACA, AGC, TGC, TCA, CCA,CAT, CTT，GCT，CGCP16 :TGG, AGC, GTT, CTT, TCT, GAT, GAC, TGG, AAG, AGC, CAA, GCC, ATG, AGC, GAG, CAA,
5.包括權利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶Mbgl基因的pYMbgl載體。
6.權利要求5所述的pYMbgl載體在大腸桿菌表達中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種密碼子優(yōu)化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因及其表達，所述β-葡萄糖苷酶Mbg1基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1，其編碼的蛋白質序列如SEQ ID No 2。本發(fā)明采用連續(xù)延伸PCR方法合成所述β-葡萄糖苷酶Mbg1基因，通過將所述基因構建到大腸桿菌表達載體并轉化入大腸桿菌EG50中表達出高比活的β-葡萄糖苷酶，其比活達到232umg-1min-1以上，可用于β-葡萄糖苷酶的工業(yè)生產中。
文檔編號C12N15/70GK102586296SQ201110005958
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月12日 優(yōu)先權日2011年1月12日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 薛永, 趙偉, 金曉芬 申請人:上海市農業(yè)科學院