專(zhuān)利名稱(chēng)：一種透明質(zhì)酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是以質(zhì)粒形式或以基因組整合方式構(gòu)建的工程大腸桿菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸的制備方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌K12株系因清晰的遺傳背景、擁有眾多高效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和基因組的易操作性而被廣泛應(yīng)用在代謝工程領(lǐng)域，以生產(chǎn)各式各樣的高附加值產(chǎn)品。目前尚未發(fā)現(xiàn)天然的大腸桿菌菌株有生產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力。透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, HA)最早從牛眼中分離得到的一種具有高黏度氨基多糖。透明質(zhì)酸廣泛存在人和動(dòng)物組織內(nèi)，其分子量在5X104到8X IO6道爾頓之間，是由β-1，4-糖苷鍵連接的葡萄糖醛酸及β-1，3-糖苷鍵連接的氮乙?；咸烟前?β 1-4 D-Glucuronic acid, GlcA ， β 1-3 D-N-acetylglucosamine ， GlcNAc)交替連接而成的直鏈聚合物。研究證實(shí)，該多糖作為結(jié)構(gòu)與信號(hào)分子參與了哺乳動(dòng)物的受精、胚胎發(fā)育、血管再生和關(guān)節(jié)潤(rùn)滑等眾多生理活動(dòng)；同時(shí)在炎癥與損傷修復(fù)、維持皮膚的水分與彈性方面也有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，特定長(zhǎng)度的HA寡糖鏈在抗腫瘤免疫異常修復(fù)等方面發(fā)揮著重要功能。 由于透明質(zhì)酸獨(dú)特的化學(xué)特性與生理功能，HA及源于HA的寡糖鏈被廣泛應(yīng)用于眼科手術(shù)、關(guān)節(jié)炎治療、抗腫瘤、給藥方式、化妝品工業(yè)等諸多方面，僅2008年HA做為原料，在全球市場(chǎng)的交易金額約為10億美元并有逐年增加的趨勢(shì)。自然界中HA廣泛存在，如動(dòng)物組織哺乳動(dòng)物病原菌的細(xì)胞被膜及病毒PBCV-I浸染的小球藻等。目前商用HA主要從動(dòng)物組織(如雞冠，臍帶、牛眼、關(guān)節(jié)滑液)，和培養(yǎng)人與高等哺乳動(dòng)物的病原菌(如鏈鎖狀球菌，Str印tococci )中提取。出于資源限制、成本問(wèn)題及藥物安全等諸方面的考慮，上述生產(chǎn)絕非理想方式，國(guó)際社會(huì)極力探索更為經(jīng)濟(jì)、安全和持續(xù)的生產(chǎn)HA的方法。分子生物學(xué)及生物技術(shù)的發(fā)展，為上述問(wèn)題的解決提供了重要的手段。對(duì)HA 在動(dòng)物與微生物中合成機(jī)理，諸多HA的合成過(guò)程必需基因的克隆等研究，都為通過(guò)代謝工程的手段，在安全的宿主生物中重建或改造合成途徑來(lái)生產(chǎn)HA奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2004年日本學(xué)者柴谷滋郎等(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00480022328. 8)通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)從人類(lèi)和草履蟲(chóng)病毒(PBCV-I)中得到的HA合成基因(Has)來(lái)嘗試HA在植物組織中的合成。Widner B 等(Bill Widner et al . , Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtil is Appl. Environ. Microbiol. 2005，71 (7) : 3747 - 3752)在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)從革蘭氏陽(yáng)性的鏈鎖狀球菌中得到的HA合成基因，工程芽孢桿菌在普通的三角瓶中發(fā)酵獲0.5-0. 6g / L HA含量。然而在植物中生產(chǎn)透明質(zhì)酸，因植物的轉(zhuǎn)化難，生長(zhǎng)周期受季節(jié)限制，許多保守環(huán)保人士反對(duì)轉(zhuǎn)基因植物，及轉(zhuǎn)基因植物本身存在對(duì)環(huán)境安全的潛在危害等而受到應(yīng)用限制。對(duì)于枯草芽孢桿菌，因該菌有產(chǎn)生內(nèi)毒素，各種大環(huán)脂類(lèi)和脂肽類(lèi)抗生素的報(bào)道，而會(huì)導(dǎo)致經(jīng)發(fā)酵、用于醫(yī)藥領(lǐng)域HA的分離純化成本增高，產(chǎn)率降低等系列問(wèn)題。許多來(lái)源于人體腸道的大腸桿菌是維護(hù)腸道微生物平衡及人體健康的有益細(xì)菌。 加之大腸桿菌K12株系具清晰的遺傳背景、擁有眾多高效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和基因組可操作性，而被廣泛應(yīng)用在代謝工程領(lǐng)域以生產(chǎn)高附加值的生物產(chǎn)品。對(duì)于用大腸桿菌為宿主進(jìn)行工程改造生產(chǎn)透明質(zhì)酸的首次報(bào)道是美國(guó)麻省理工學(xué)院的M^hanopoulos G研究組。 2008該研究組通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)革蘭氏陽(yáng)性鏈鎖狀球菌HA合成基因印Zfes和全新合成，優(yōu)化過(guò)密碼子并用于大腸桿菌表達(dá)的m/^s基因，該研究獲得最高約0.2g/L的HA產(chǎn)量。該工程大腸桿菌因HA合成產(chǎn)率低而難以獲得產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的制備方法。克服現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的資源短缺、安全性問(wèn)題以及在工程大腸桿菌中較低透明質(zhì)酸合成的問(wèn)題。本發(fā)明用一種表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因(hyaluronic acid synthase Has)和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因(UDP-glucose Dehydrogenase)的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌來(lái)生產(chǎn)透明質(zhì)酸。含有透明質(zhì)酸合成酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌是通過(guò)以下方法構(gòu)建獲得的
(1)構(gòu)建表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因Has的載體，具體是將PCR克隆的Has連接入大腸桿菌的表達(dá)載體(如PQE801)中；
(2)構(gòu)建表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的載體，將PCR克隆的尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因連接入大腸桿菌的表達(dá)載體(如PQE801)中；
(3)構(gòu)建含有透明質(zhì)酸合成酶基因Has^和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因，在大腸桿菌中共同表達(dá)的重組載體；以( 中構(gòu)建的含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因表達(dá)載體為PCR的模板，擴(kuò)增含驅(qū)動(dòng)子(如T5)驅(qū)動(dòng)kfi\)表達(dá)的PCR產(chǎn)物，并連入(1)中構(gòu)建的表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因Zfes的表達(dá)載體中而獲得含有透明質(zhì)酸合成酶基因Zfes和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因，且能在大腸桿菌中共同表達(dá)的重組載體。(4)將(3)中獲得含有透明質(zhì)酸合成酶基因Zfes和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(如JM109菌株)，經(jīng)篩選而獲高效產(chǎn)透明質(zhì)酸的工程大腸桿菌。本發(fā)明中所用的含有透明質(zhì)酸合成酶基因Has和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸的工程大腸桿菌是PHK/JM109，分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌(federicAia cWi )，保藏號(hào)為CGMCC No. 3擬6，于2010年6月17日在中國(guó)北京市的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)保藏。所述的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸的工程大腸桿菌CGMCC NO: 3擬6中所述的透明質(zhì)酸合成酶基因湯S來(lái)源于多殺巴斯德菌(/^sieareWa multocida subsp. Jfo/iocit/a)中的透明質(zhì)酸合成酶基因Pmhas ；所述的尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因來(lái)源于大腸桿菌k5菌株中鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因kfiD0所述的表達(dá)載體宿主菌株，大腸桿菌JM109購(gòu)于Promega公司。通過(guò)共 表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的工程大腸桿菌PHK/JM109，并使其利用簡(jiǎn)單糖類(lèi)(如葡萄糖)合成透明質(zhì)酸。為進(jìn)一步提高本發(fā)明工程大腸桿菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，通過(guò)改變發(fā)酵培養(yǎng)的通氣條件，培養(yǎng)基中添加氮乙酰葡萄胺、檸檬酸等發(fā)酵底物而使得透明質(zhì)酸的產(chǎn)量得到了大
量提高。用工程大腸桿菌pHK/JM109生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法如下 (1)搖瓶培養(yǎng)合成
搖瓶培養(yǎng)合成
在 500ml 三角瓶中，以總體積 100ml-500ml 含 25-50 mM K2HPO4*3Η20, ρΗ6· 5-7. 2， 2-4mM g/L MgS04*7H20, 20-40 mM/L 檸檬酸，1-2 mM MnCl2, 300-400 mM 葡萄糖 50-75 mM氮乙酰葡萄糖胺，5-10 mM乳糖、10-30 g/L甘油、3_5g/L Casamino acid(酪蛋白酸水解物)的體系中加入已表達(dá)和i/iD的PHK/JM109，使菌體細(xì)胞濃度達(dá)4-5% (W/V)， 發(fā)酵條件為30-33 250 rpm，并用28% V/V (以下同)的氨水調(diào)節(jié)pH至中性，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間為30-36小時(shí)。經(jīng)測(cè)定HA含量可達(dá)0.75-1 g/L左右(圖1)。因HA的合成需氧及較穩(wěn)定的pH，為進(jìn)一步提高工程菌的產(chǎn)量，本發(fā)明進(jìn)行了發(fā)酵罐HA合成的培養(yǎng)。(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)合成
從(氨芐青霉素)Amp50-100ug/ml+Km (卡納霉素)25-100ug/ml的LB平板上挑起3-5 經(jīng)劃線并過(guò)夜培養(yǎng)的PHK/JM109單菌落，置于100ml TB培養(yǎng)基(Terrific Broth 12 g/ L 蛋白胨(Tryptone)，24 g/L 酵母提取物(Yeast extract), 9. 4 g/L K2HPO4 和 2· 2 g/ L KH2PO4, pH6. 8)過(guò)夜培養(yǎng)；該培養(yǎng)物經(jīng)離心收集菌體，菌體用20_50ml TB懸浮，全部轉(zhuǎn)入 1-5L的發(fā)酵罐，發(fā)酵罐培養(yǎng)基為T(mén)B培養(yǎng)基并含Amp50- 100 ug/ml+Kmn25-100 ug/ml，總體積為600-3000 ml，控制溫度37 °C，轉(zhuǎn)速1200 rpm,通入流量為60 ml/min的混合氣體 (氧氣空氣1 :10 v/v)，即氧氣空氣1 :10 v/v，并用8% V/V氨水及4 mol/L HCl調(diào)節(jié) PH至6. 8-7. 2，培養(yǎng)4小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)物OD6tltl達(dá)到5時(shí)，加入IPTG使其終濃度達(dá)0. 5-1 mM, 同時(shí)將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)至30-33 °C培養(yǎng)2小時(shí)，此時(shí)加入50% W/V葡萄糖和10% W/V磷酸銨 PH6.8，使發(fā)酵液中葡萄糖和磷酸銨含量分別為50 g/L和1 g/L，30 °C培養(yǎng)10小時(shí)后， 再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸銨使其濃度分別為0.5 mM、50 g/L和1 g/L，混合液30 ！培養(yǎng)14 一 30小時(shí)后完成發(fā)酵，得到2-2. 5 g/L濃度的透明質(zhì)酸。在發(fā)酵罐中進(jìn)行HA的生產(chǎn)，細(xì)胞濃度得到極大的提高，OD6tltl可達(dá)25-30，HA含量獲2-3g/L，大大提高了合成能力，為規(guī)?；a(chǎn)準(zhǔn)備了條件(見(jiàn)圖1)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
1、本發(fā)明的工程大腸桿菌能產(chǎn)透明質(zhì)酸2g/L 2.5g/L,比現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)大腸桿菌中表達(dá)革蘭氏陽(yáng)性鏈鎖狀球菌HA合成基因spHas和全新合成，優(yōu)化過(guò)密碼子并用于大腸桿菌表達(dá)的seHas基因獲得的最高約0. 2g/L的透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高近10倍。)
2、本發(fā)明第一次用在革蘭氏陰性菌來(lái)源的透明質(zhì)酸合成 酶基因pmHas和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因i/iD在革蘭氏陰性宿主中表達(dá)來(lái)生產(chǎn)透明質(zhì)酸。


圖1是本發(fā)明的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸大腸桿菌ρ H K / J M 1 O 9合成透明質(zhì)酸后的形態(tài)變化圖，其中A，C: pQESOl /JM109 (對(duì)照菌株)分別用普通顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡 (ESEM)的觀測(cè)；B，D: pHK/JM109分別用普通顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡(ESEM)的觀測(cè)；B中 a,b, c,d:顯示透明質(zhì)酸合成后，菌體變大，兩細(xì)菌個(gè)體間相互粘聯(lián)的狀況。圖2是本發(fā)明的通過(guò)三角瓶培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程中HA積累變化圖；圖中顯示pHK/JM109 產(chǎn)透明質(zhì)酸能力大于PQHK/JM109，而空載體菌株無(wú)透明質(zhì)酸的產(chǎn)生。圖3是本發(fā)明菌株P(guān)HK/JM109發(fā)酵純化過(guò)程中透明質(zhì)酸(HA)在上清中的富積圖， A:pHK/JM109,B:對(duì)照(pQE801/JM109)無(wú)透明質(zhì)酸生成。圖4是本發(fā)明中經(jīng)搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)最佳透明質(zhì)酸工程菌株pHK/JM109，在發(fā)酵罐中發(fā)酵后細(xì)胞濃度、透明質(zhì)酸的積累及底物的消耗變化圖。圖中顯示細(xì)胞濃度得到極大的提高，OD6tltl可達(dá)25-30，HA含量獲2_2. 5g/L，大大提了合成能力，為規(guī)模化生產(chǎn)準(zhǔn)備了條件。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
PHK/JM109中透明質(zhì)酸的搖瓶培養(yǎng)合成
在 500ml 三角瓶中，以總體積 IOOml 含 50 mM K2HPO4·3Η20, (ρΗ7· 0) 4mM g/ L MgS04'7H20, 20mM/L檸檬酸，ImM MnC12, 300mM葡萄糖50 mM氮乙酰葡萄糖胺 (GlcNAc) , IOmM乳糖、10g/L甘油、5g/LCasamino acid (水解酪蛋白氨基酸)的體系中加入已表達(dá)pmHas和kfH)的pHK/JM109，使菌體細(xì)胞濃度達(dá)5% (W/V)，發(fā)酵條件為30°C， 250rpm，并用28% (V/V)的氨水調(diào)節(jié)pH至中性，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間為36小時(shí)。經(jīng)測(cè)定HA含量可達(dá)0.75-1 g/L左右(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例2
在 25001 三角瓶中，以總體積 500ml 含 25 mM K2HPO4·3Η20, (ρΗ6· 5) 2mM g/ L MgS04'7H20, 40mM/L檸檬酸，2mM MnC12, 400mM葡萄糖75 mM氮乙酰葡萄糖胺 (GlcNAc)，5mM乳糖、30g/L甘油、3g/L水解酪蛋白氨基酸(Casamino acid)的體系中加入已mkpniHas和i/iD的pHK/JM109，使菌體細(xì)胞濃度達(dá)4%(W/V)，發(fā)酵條件為33°C，250rpm ，并用28% (V/V)的氨水調(diào)節(jié)pH至中性，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間為30小時(shí)。經(jīng)測(cè)定HA含量可達(dá)0. 7-8. 5 g/L左右。因HA的合成需氧及較穩(wěn)定的pH，為進(jìn)一步提高工程菌的產(chǎn)量，本發(fā)明進(jìn)行了發(fā)酵罐HA合成的培養(yǎng)。
實(shí)施例3
PHK/JM109中透明質(zhì)酸的發(fā)酵罐培養(yǎng)合成
從Ampl00ug/ml+Kml00 ug/ml的LB平板上挑起3-5個(gè)經(jīng)劃線并過(guò)夜培養(yǎng)的pHK/JM109 單菌落，置于 100ml TB 培養(yǎng)基(Terrific Broth) 12 g/L 胰化蛋白胨(Tryptone )，24 g/L 酵母提取物(Yeast extract), 9. 4 g/L K2HPO4 和 2. 2 g/L KH2P04(pH6. 8)，過(guò)夜培養(yǎng)。該培養(yǎng)物經(jīng)離心收集菌體，菌體用20ml TB懸浮，全部轉(zhuǎn)入IL的發(fā)酵罐(Bioreactor，BI0STAT Bplus Sartoris BBI system德國(guó)產(chǎn)品 )。發(fā)酵罐培養(yǎng)基為T(mén)B含氨芐青霉素(Amp) 100呢/1111+卡那霉素(1(111)100 ug/ml，總體積為600ml?？刂茰囟?7°C，轉(zhuǎn)速1200rpm，通入流量為60ml/min的混合氣體(氧氣空氣1 :10 v/v，)，并用28%氨水及4 mol/L HCl自 動(dòng)調(diào)節(jié)pH至6. 8。培養(yǎng)約4小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)物OD6tltl達(dá)5時(shí)，加入IPTG使其終濃度達(dá)ImM，同時(shí)將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)至30°C培養(yǎng)2小時(shí)以誘導(dǎo)pmHas和kfiD的表達(dá)，此時(shí)加入50% (W/V) 葡萄糖和10% (W/V)磷酸銨(pH6. 8)使發(fā)酵液中葡萄糖和磷酸銨含量分別為50g/L和Ig/ L, 30°C培養(yǎng)10個(gè)小時(shí)后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸銨使其濃度分別為0. 5mM、50g/L和 lg/L，混合液30°C培養(yǎng)14小時(shí)后，完成共30小時(shí)發(fā)酵反應(yīng)，獲得平均約為2-3 g/L HA.
實(shí)施例4
PHK/JM109中透明質(zhì)酸的發(fā)酵罐培養(yǎng)合成
從Amp50ug/ml+Km25 ug/ml的LB平板上挑起3-5個(gè)經(jīng)劃線并過(guò)夜培養(yǎng)的pHK/JM109單菌落，置于 100ml TB培養(yǎng)基(Terrific Broth) 12 g/L 胰化蛋白胨(Tryptone)，24 g/L 酵母提取物(Yeast extract), 9. 4 g/L K2HPO4 和 2. 2 g/L KH2PO4 (pH6. 8)，過(guò)夜培養(yǎng)。該培養(yǎng)物經(jīng)離心收集菌體，菌體用50ml TB懸浮，全部轉(zhuǎn)入5L的發(fā)酵罐(Bioreactor，BI0STAT Bplus Sartoris BBI system德國(guó)產(chǎn)品)。發(fā)酵罐培養(yǎng)基為T(mén)B含氨芐青霉素(Amp) 50ug/ ml+卡那霉素(Km)25 ug/ml，總體積為3000ml?？刂茰囟?7°C，轉(zhuǎn)速1200rpm，通入流量為300ml/min的混合氣體(氧氣空氣1 :10 v/v，)，并用28%氨水及4 mol/L HCl自動(dòng)調(diào)節(jié)pH至7. 2。培養(yǎng)約4小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)物OD6tltl達(dá)5時(shí)，加入IPTG使其終濃度達(dá)ImM，同時(shí)將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)至33°C培養(yǎng)2小時(shí)以誘導(dǎo)pmHas和kfiD的表達(dá)，此時(shí)加入50% (W/V)葡萄糖和10%(W/V)磷酸銨(pH6.8)，使發(fā)酵液中葡萄糖和磷酸銨含量分別為50g/L和lg/L，30°C 培養(yǎng)10個(gè)小時(shí)后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸銨使其濃度分別為0. 5mM、50g/L和lg/L， 混合液30°C培養(yǎng)14小時(shí)后，完成共30小時(shí)發(fā)酵反應(yīng)，獲得平均約為2-3 g/L HA.
從圖4可見(jiàn)，在發(fā)酵罐中進(jìn)行HA的生產(chǎn)，細(xì)胞濃度得到極大的提高，OD600可達(dá)25-30， HA含量獲2-2.5g/L，大大提了合成能力，為規(guī)?；a(chǎn)準(zhǔn)備了條件。
透明質(zhì)酸的提取與分離
上述發(fā)酵生產(chǎn)的反應(yīng)混合物，加入1/10體積20%十六烷基溴化乙胺(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide CTAB)和2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后放置IOmin。用 HOOOrpm離心10分鐘取沉淀。(有時(shí)因透明質(zhì)酸含量過(guò)高，溶液分為三層(見(jiàn)圖3)，透明質(zhì)酸不易沉淀，這種情況下可適當(dāng)對(duì)初始的反應(yīng)混合物進(jìn)行稀釋)。沉淀再次用1倍體積，IM 的氯化鈉在42°C懸浮提取約2小時(shí)，12000rpm離心收集上清液，相應(yīng)沉淀再次用1/10體積 IM的氯化鈉重懸IOmin后，重懸混合再次離心，上清溶液合并后丟棄沉淀。合并的上清溶液加入2. 5倍的無(wú)水乙醇，混勻，放置5分鐘，離心取沉淀，沉淀用70%乙醇洗滌后，干燥或重溶于IM NaCl溶液中用于HA含量及分子量測(cè)定。PHK/JM109合成透明質(zhì)酸后菌體形態(tài)的觀測(cè)
在HA合成的反應(yīng)體系中取大約2μ1混合物，置于載玻片上讓液體風(fēng)干，風(fēng)干的細(xì)菌用0. 1%多染試劑染色5分鐘(多染試劑，Stains all為Sigma產(chǎn)品，http//www. sigmaaldrich.com)該染液用溶劑(甲酰胺異丙醇，v/v7:3)配制。染色后多余的燃料用蒸餾水沖洗后，直接1000X顯微觀查并用CCD收集圖片。為進(jìn)一步提高分辨率來(lái)觀查透明質(zhì)酸合成后細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)變化，反應(yīng)體系中PHK/JM109細(xì)胞用環(huán)境掃描電鏡(ESEM)進(jìn)行直接觀測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HA的合成導(dǎo)致大腸桿菌菌體加粗，末端著色深、菌體粘聯(lián)(圖4)。在ESEM下對(duì)照細(xì)胞(pBQ/JM109)比較光滑，而HA合成細(xì)胞(pHK/JM109)則表面粗糙(見(jiàn)圖4) 且菌體兩端有明顯的物質(zhì)堆積，說(shuō)明細(xì)胞合成了 HA，并積累于菌體表面上。從觀測(cè)到的細(xì)菌兩端著色深，推測(cè)兩端可能是菌體活躍分泌HA的主要位點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。
透明質(zhì)酸的酶促降解鑒定
為進(jìn)一步證實(shí)上述提取物確實(shí)為透明質(zhì)酸，利用Sigma公司從解透明質(zhì)酸鏈霉菌 (.Streptomyces Ajafero斤iicm)中純化的，能專(zhuān)一水解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶(Sigma產(chǎn)品貨號(hào)H 1136)，進(jìn)行水解，并用戴安公司(Dionex BioLC)離子交換型HPLC進(jìn)行分析鑒定。以250mU酶/mgHA比例，37 °C水解共10小時(shí)，分別于O、2. 5、5和10小時(shí)取樣進(jìn)行水解混合物中透明質(zhì)酸4寡糖的生成檢測(cè)。離子交換型HPLC分析的具體過(guò)程是，酶解混合樣品經(jīng)100°C、5min終止反應(yīng)，混合物經(jīng)13000rpm離心，0. 2uM的過(guò)濾器過(guò)濾后，上Dionex BioLC系統(tǒng)(Sunnyvale, CA，美國(guó))進(jìn)行分析，該系統(tǒng)用Carbolic PA20柱進(jìn)行分離，電化學(xué)檢測(cè)器(Dionex ED50 electrochemical detector)進(jìn)行信號(hào)監(jiān)測(cè)，該檢測(cè)器的具體參設(shè)置為(waveform: t = 0. 41 sec, ρ = -2.00 V; t = 0. 42 sec, ρ = -2.00 V; t = 0. 43 sec, ρ = 0.60 V; t = 0. 44 sec, ρ = _0· 10 V; t = 0. 50 sec, ρ = -0. 10 V).分析過(guò)程中用從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)的寡糖，01igo-HA4,(產(chǎn)品號(hào)09140_5MG)為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒定 (Dionex BioLC系統(tǒng)分析的出峰時(shí)間約為15min)。層析的流動(dòng)項(xiàng)為A溶液(脫氣處理的200 mM NaOH, B溶液(脫氣處理含200 mM NaOH和IM NaCl)，流速為0.5 ml/min，在整個(gè)分析過(guò)程中A液和B液均用惰性氣體氦充氣，且梯度洗脫過(guò)程中各自的比例關(guān)系變化如下 t = 0 min, 5:95 (A 液B 液，下同)；t = 5 min, 5:95; t = 10 min, 20:80; t = 20 min, 20:80; t = 21 min, 100:0; t = 30 min, 100:0; t = 35 min, 5:95; t = 50 min。 由表1可知，所提取物質(zhì)能被專(zhuān)一降解透明質(zhì)酸，來(lái)源于解透明質(zhì)酸鏈霉菌 Ajafer0斤iicm)的透明質(zhì)酸酶所降解。從而確證pmHas和kfiD在大腸桿菌中高效表達(dá)， 使天然條件下不能合成HA的大腸桿菌JM109菌株轉(zhuǎn)變HA合成菌株。
權(quán)利要求
1.一種透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于用工程大腸桿菌PHK/JM109生產(chǎn)透明質(zhì)酸的搖瓶培養(yǎng)合成按以下進(jìn)行在500ml-2500ml三角瓶中，以總體積100ml-500ml含25-50 mM K2HPO4·3Η20, ρΗ6· 5-7. 2，2-4mM g/L MgS04.7H20, 20-40 mM/L 檸檬酸，1-2 mM MnCl2, 300-400 mM葡萄糖50-75 mM氮乙酰葡萄糖胺，5_10 mM乳糖、10-30 g/L甘油、3_5g/L酪蛋白酸水解物(Casamino acid)的體系中加入已表達(dá)/M^ks和左/iD的pHK/JM109，使菌體細(xì)胞濃度達(dá)4-5% W/V,發(fā)酵條件為30-33 °C, 250 rpm，并用28% V/V的氨水調(diào)節(jié)pH至中性，發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間為30-36小時(shí)。
2.一種透明質(zhì)酸的制備方法，其特征在于用工程大腸桿菌PHK/JM109生產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵罐培養(yǎng)合成按以下進(jìn)行從Amp50-100ug/ml+Km25-100ug/ml的LB平板上挑起3-5經(jīng)劃線并過(guò)夜培養(yǎng)的PHK/JM109單菌落，置于100ml TB培養(yǎng)基(Terrific Broth)，過(guò)夜培養(yǎng)； 該培養(yǎng)物經(jīng)離心收集菌體，菌體用20-50ml TB懸浮，全部轉(zhuǎn)入1-5L的發(fā)酵罐，發(fā)酵罐培養(yǎng)基為 TB 培養(yǎng)基并含 Amp50- 100 ug/ml+Kmn25-100 ug/ml，總體積為 600-3000 ml，控制溫度37°C，轉(zhuǎn)速1200 rpm,通入流量為60 ml/min的混合氣體，即氧氣空氣1 10 v/v，并用 28% V/V氨水及4 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 2，培養(yǎng)4小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)物OD600達(dá)到5時(shí)， 加入IPTG使其終濃度達(dá)0.5-1 mM，同時(shí)將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)至30-33 °C培養(yǎng)2小時(shí)，此時(shí)加入 50% W/V葡萄糖和10% W/V磷酸銨pH6.8，使發(fā)酵液中葡萄糖和磷酸銨含量分別為50 g/L 和1 g/L，30 °C培養(yǎng)10小時(shí)后，再次加入IPTG、葡萄糖和磷酸銨使其濃度分別為0.5 mM、 50 g/L和1 g/L，混合液30 °C培養(yǎng)14 一 30小時(shí)后完成發(fā)酵，得到2-3 g/L濃度的透明質(zhì)酸。
全文摘要
本發(fā)明是一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法。該方法是通過(guò)構(gòu)建透明質(zhì)酸合成酶基因Has和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因在大腸桿菌中共表達(dá)的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得工程大腸桿菌，發(fā)酵該工程大腸桿菌得到透明質(zhì)酸。該方法提高生產(chǎn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)量達(dá)到2.5g/L,比現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)大腸桿菌中表達(dá)革蘭氏陽(yáng)性鏈鎖狀球菌HA合成基因spHas獲得的最高HA產(chǎn)量提高近10倍。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102154405SQ20111000622
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者尚海麗, 楊發(fā)祥, 毛自朝, 程倩 申請(qǐng)人:云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司