專利名稱：一種嵌合病毒樣顆粒疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種嵌合病毒樣顆粒疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(HPV)(附圖1所示)是小型DNA病毒，存在100個(gè)以上的基因型， 其中有 15 個(gè)基因型(高危型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、73 型)是子宮頸癌的原因。HPV16型在50-60%的子宮頸癌中被檢出。在歐美以18型居多，在亞洲以16、 58型居多。HPV病毒殼體為正20面體骨架上具有12分子的L2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，所述正20面體骨架由72個(gè)Ll蛋白質(zhì)五聚體形成。L2蛋白質(zhì)的兩端位于病毒殼體的內(nèi)部，而其N末端側(cè)的一部分露出在殼體表面(附圖2所示)。如果采用重組DNA技術(shù)僅使Ll蛋白質(zhì)大量表達(dá)，則會(huì)產(chǎn)生病毒樣顆粒(Virus-like particle ；VLP) 0如果將牛乳頭瘤病毒、棉尾兔乳頭瘤病毒的VLP或L2蛋白質(zhì)接種于動(dòng)物，則會(huì)對(duì)病毒侵染表現(xiàn)出抵抗性。具體參見(jiàn)附圖2中 HPV和VLP的截面示意圖。目前，尚沒(méi)有可供HPV增殖的培養(yǎng)細(xì)胞系。為了監(jiān)測(cè)HPV的感染，制作了假病毒。 在表達(dá)SV40T抗原的人293細(xì)胞中導(dǎo)入具有SV40復(fù)制起點(diǎn)的分泌性堿性磷酸酶(SEAP)表達(dá)質(zhì)粒、以及Ll和E7蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒，則復(fù)制的SEAP表達(dá)質(zhì)粒組入L1/E7-病毒樣顆粒， 從而形成了感染性假病毒(如附圖3所示)。可以通過(guò)抑制假病毒的感染性的活性來(lái)測(cè)定中和抗體，具體參見(jiàn)非專利文獻(xiàn) 1 (Rose, R. C.，Bonnez, W.，Reichman, R. C.，Garcea, R. L.， 1993.人乳頭瘤病毒11型Ll蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)在體內(nèi)和體外組裝成病毒樣顆粒 J. Virol. 67，1936-1944)。HPV的VLP接種于動(dòng)物而得到的抗血清具有基因型特異性的中和活性。由此Merck 公司開(kāi)發(fā)出HPV16、18型VLP的混合疫苗，具體參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)2 (Chen，X. S.，Garcea，R. L.， Goldberg, I.，Casini，G.，Harrison, S. C. ,2000.來(lái)自人乳頭瘤病毒 16 型 Ll 蛋白質(zhì)的小病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu).Mol. Cell 5，557-567.)和非專利文獻(xiàn)3 (Harper，D. Μ.，et al.由一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果表明一種二價(jià)Ll病毒樣顆粒疫苗抗人乳頭瘤病毒16型和18型的效果持續(xù)達(dá) 4. 5 年.Lancet 367 (9518)，1247-1255.)。這些疫苗在大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)中顯示出基因型特異性的感染預(yù)防效果，Merck公司的疫苗于2006年取得了 FDA和歐洲委員會(huì)的認(rèn)證并上市銷售。如上述，如果用HPV的Ll-病毒殼體免疫動(dòng)物，則會(huì)誘導(dǎo)出極其基因特異性的免疫應(yīng)答。使用16型Ll-病毒殼體疫苗進(jìn)行的臨床實(shí)驗(yàn)的中間成績(jī)顯示對(duì)16型的感染的預(yù)防有效性，但也顯示對(duì)于其它基因型基本沒(méi)有預(yù)防效果。因此，為了用疫苗阻止子宮頸癌的發(fā)病，至少必須開(kāi)發(fā)出能夠抵抗所有高危型的疫苗抗原。在15個(gè)高危HPV群體中，現(xiàn)在銷售的HPV疫苗僅對(duì)16型和18型有效。因?yàn)閂LP 誘導(dǎo)基因型特異性的中和抗體，為了針對(duì)全部高危HPV群，必須使用15種VLP的雞尾酒，以此作為實(shí)用性疫苗抗原是困難的。因此，希望開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性中和抗體的疫苗抗原。
專利文獻(xiàn)1 (W02007/018049)記載的抗原是至少能夠抗全部高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。但是，其存在以下問(wèn)題專利文獻(xiàn)1的研究中使用的感染性假病毒僅為16、18型，相對(duì)于這些感染性假病毒，專利文獻(xiàn)1記載的抗原顯示了良好的中和活性。但是，隨后，本發(fā)明人針對(duì)專利文獻(xiàn)1中的抗原對(duì)新開(kāi)發(fā)的31、53、58型的感染性假病毒進(jìn)行的中和實(shí)驗(yàn)表明，專利文獻(xiàn)1記載的抗原抗31、52、和58型的中和活性不高。因而， 開(kāi)發(fā)出一種提供能夠誘導(dǎo)抗高危型人乳頭瘤病毒的交叉反應(yīng)性中和抗體的疫苗抗原是目前研究的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種嵌合蛋白質(zhì)，該嵌 合蛋白質(zhì)通過(guò)在在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入一個(gè)人乳頭瘤病毒16型的E7表位而得到的。其能夠制作出誘導(dǎo)力更強(qiáng)的基因型共有中和抗體的疫苗抗原，該疫苗抗原是至少能夠抵抗所有高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種由上述嵌合蛋白質(zhì)聚集制成的病毒樣顆粒及其制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述病毒樣顆粒在制備人乳頭瘤病毒HPV16型 Ll-病毒樣顆粒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種病毒樣顆粒的混合物，該病毒樣顆?；旌衔锖猩鲜鲇汕逗系鞍踪|(zhì)聚集制成的病毒樣顆粒中的兩種、三種或全部。本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供上述病毒樣顆?；旌衔镌谥苽淙巳轭^瘤病毒HPV16 型Ll-病毒樣顆粒疫苗中的應(yīng)用，其中所述的人乳頭瘤病毒HPV16型Ll-病毒樣顆粒疫苗能夠誘導(dǎo)出至少抗16型、18型、31型、52型和58型人乳頭瘤病毒的中和抗體。本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供一種蛋白質(zhì)復(fù)合體，該復(fù)合體為上述具有編碼(a) 或(b)蛋白質(zhì)基因的人乳頭瘤病毒16型的E7表位與匙孔血藍(lán)蛋白經(jīng)連接形成的復(fù)合體。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種嵌合蛋白質(zhì)，該嵌合蛋白質(zhì)是在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入一個(gè)人乳頭瘤病毒16型的E7表位而得到的；其中，所述的人乳頭瘤病毒16型的E7表位具有編碼如下蛋白質(zhì)(a)的基因(a)具有 MLDLQPETT 簡(jiǎn)稱 12-20E7 表位、RAHYNIVTF 簡(jiǎn)稱 49_57E7 表位、LLMGTLGIV 簡(jiǎn)稱 82-90E7 表位、或TLGIVCPI簡(jiǎn)稱86-93E7表位所示的氨基酸序列。所述的E7表位還可以是具有編碼如下蛋白質(zhì)(b)的基因?qū)?a)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與原人乳頭瘤病毒16型E7表位的VLP 的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。12-20E7表位由HPV16型的E7蛋白質(zhì)的氨基酸12-20區(qū)域的9個(gè)氨基酸構(gòu)成。 49-57E7表位由HPV16型的E7蛋白質(zhì)的氨基酸49-57區(qū)域的9個(gè)氨基酸構(gòu)成。82-90E7表位由HPV16型的E7蛋白質(zhì)的氨基酸82-90區(qū)域的9個(gè)氨基酸構(gòu)成。86-93E7表位由HPV16 型的E7蛋白質(zhì)的氨基酸86-93區(qū)域的8個(gè)氨基酸構(gòu)成。
而且，在本發(fā)明中，從蛋白質(zhì)的氨基末端起依次對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)，例如第50 號(hào)位的氨基酸記作氨基酸50。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種嵌合病毒樣顆粒，采用上述的嵌合蛋白質(zhì)聚集制成。即本發(fā)明所述的病毒樣顆粒是在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白的環(huán)部位即第140 與141個(gè)氨基酸之間插入1個(gè)人乳頭瘤病毒16型的E7表位而得到的嵌合蛋白質(zhì)的聚集體， 其中，所述的人乳頭瘤病毒16型的E7表位具有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因(a)具有 MLDLQPETT 簡(jiǎn)稱 12-20E7 表位、RAHYNIVTF 簡(jiǎn)稱 49-57E7 表位、LMGTLGIV 簡(jiǎn)稱 82-90E7 表位、或TLGIVCPI簡(jiǎn)稱86-93E7表位所示的氨基酸序列。上述的E7表位還可以是具有編碼如下蛋白質(zhì)(b)的基因?qū)?a)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與原人乳頭瘤病毒16型E7表位的VLP 的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的嵌合蛋白質(zhì)的聚集體優(yōu)選是由多個(gè)五聚體病毒顆粒組成的聚集體。 且所述的多個(gè)五聚體病毒殼粒的聚集體具有粒子機(jī)構(gòu)。本發(fā)明所述的五聚體病毒顆粒的個(gè)數(shù)優(yōu)選為60-85。最好是72個(gè)。上述嵌合病毒樣顆粒的制備方法，通過(guò)在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入一個(gè)人乳頭瘤病毒16型的E7表位而得到的嵌合蛋白質(zhì)，將所述的嵌合蛋白質(zhì)聚集而成病毒樣顆粒。本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的嵌合病毒樣顆粒在制備人乳頭瘤病毒HPV16型Ll-病毒樣顆粒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種病毒樣顆粒的混合物，其含有在人乳頭瘤病毒HPVieSLl蛋白的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入 12-20E7表位嵌合蛋白的聚集體的病毒樣顆粒、在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入49-57E7表位嵌合蛋白的聚集體的病毒樣顆粒、在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入82-90E7表位嵌合蛋白的聚集體的病毒樣顆粒和在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白的環(huán)部位即第140與141 個(gè)氨基酸之間插入82-90E7表位嵌合蛋白的聚集體的病毒樣顆粒中的兩種、三種或全部的混合ο本發(fā)明的第五個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的上述病毒樣顆?；旌衔镌谥苽淙巳轭^瘤病毒HPV16型Ll-病毒樣顆粒疫苗中的應(yīng)用，其中所述的人乳頭瘤病毒HPV16 型Ll-病毒樣顆粒疫苗能夠誘導(dǎo)出至少抗16型、18型、31型、52型和58型人乳頭瘤病毒的中和抗體。本發(fā)明的第六個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述復(fù)合體為上述具有編碼(a)或(b)蛋白質(zhì)基因的人乳頭瘤病毒16型的E7表位與匙孔血藍(lán)蛋白經(jīng)連接形成的復(fù)合體，所述的人乳頭瘤病毒16型的E7表位具有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)所示的基因(a)具有 MLDLQPETT 簡(jiǎn)稱 12-20E7 表位、
RAHYNIVTF 簡(jiǎn)稱 49_57E7 表位、LMGTLGIV 簡(jiǎn)稱 82-90E7 表位、或TLGIVCPI簡(jiǎn)稱86-93E7表位所示的氨基酸序列；(b)將(a)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與原人乳頭瘤病毒16型E7表位的VLP的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的E7表位與匙孔血藍(lán)蛋白優(yōu)選通過(guò)半胱氨酸連接。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
①.通過(guò)本發(fā)明，能夠提供HPV16型Ll-病毒樣顆粒疫苗抗原，該HPV16型Ll病毒樣顆粒疫苗抗原的粒子結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)免疫誘導(dǎo)活性，并且能夠強(qiáng)力地抗原呈遞HPV的E7-表位，特別是其能夠誘導(dǎo)抗16型、18型、31型、52型和58型的人乳頭瘤病毒的中和抗體。而且，從前述15種高危人乳頭瘤病毒的E7氨基酸序列的同源性來(lái)推測(cè)，本發(fā)明的能夠誘導(dǎo)抗 16型、18型、31型、52型和58型的人乳頭瘤病毒的中和抗體的Ll-病毒樣顆粒疫苗抗原是與上述15種高危型基本上對(duì)應(yīng)的抗原。②.VLP疫苗已經(jīng)實(shí)用化，并展現(xiàn)出基因型特異性感染預(yù)防效果。本發(fā)明的嵌合 VLP是在現(xiàn)有疫苗抗原的基礎(chǔ)上增加交叉反應(yīng)性E7-表位而得到的抗原，其中保留了現(xiàn)有疫苗的中和表位，因而，其能夠誘導(dǎo)抗16型的基因型特異性中和抗體，也能夠誘導(dǎo)抗18型、 31型、52型和58型的交叉反應(yīng)性中和抗體。VLP由360個(gè)分子的Ll蛋白質(zhì)形成，因此，嵌合VLP具有360個(gè)交叉反應(yīng)性E7-表位。嵌合VLP是粒子結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)免疫誘導(dǎo)活性、同時(shí)強(qiáng)力呈遞交叉反應(yīng)性E7-表位的新疫苗抗原。


圖1是人乳頭瘤病毒(HPV)的說(shuō)明圖；圖2a是一個(gè)完整的HPV病毒粒子示意圖；圖2b是HPVLl病毒樣粒子的示意圖；圖2c是圖2b的HPVLl的電鏡圖；圖3是將交叉反應(yīng)性表位插入Ll蛋白質(zhì)而制作的嵌合VLP的說(shuō)明圖；圖4是嵌合VLP的說(shuō)明圖與粒子的照片；圖5是天然HPV病毒樣顆粒的電鏡圖；圖6是Chl2/20病毒樣顆粒，Ch49/57病毒樣顆粒，Ch82/90病毒樣顆粒，Ch86/93 病毒樣顆粒的電鏡圖。
具體實(shí)施例方式下面列舉一部分具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，有必要在此指出的是以下具體實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。首先對(duì)以下實(shí)施例中采用的嵌合蛋白質(zhì)、病毒樣顆粒及其混合物、應(yīng)用等進(jìn)行下詳細(xì)的描述本發(fā)明的Ll-病毒樣顆粒是這樣的病毒殼體其是在人乳頭瘤病毒(HPV) 16型Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位插入1個(gè)人乳頭瘤病毒16型E7表位而得到的嵌合蛋白質(zhì)的聚集體。如附圖l-2c所示和背景技術(shù)部分所述，HPV粒子中，72個(gè)由5個(gè)分子的Ll蛋白質(zhì)聚集而成的病毒殼粒聚集在一起形成正20面體的病毒殼體。 如果使Ll蛋白質(zhì)在細(xì)胞中高表達(dá)，則Ll蛋白質(zhì)集中在核內(nèi)，并自主性的形成病毒殼體。僅由Ll蛋白質(zhì)形成的病毒殼體稱為L(zhǎng)l-病毒殼體或病毒樣顆粒(virus-like particle :VLP)。本發(fā)明的Ll-病毒殼體是以HPV16型的Ll-病毒殼體為基礎(chǔ)的病毒殼體。HPV的基因型多，因而，通常以HPV16、HPV58等表示方式將其基因型一并表示出來(lái)。這里，例如將 HPV16型的Ll-病毒殼體表述為16L1-病毒殼體。如附圖3所示，本發(fā)明的Ll-病毒殼體是在HPV16型Ll蛋白質(zhì)中插入HPV16型的 E7表位而得到的嵌合蛋白質(zhì)的聚集體。以下，嵌合蛋白質(zhì)是指“在人乳頭瘤病毒(HPV)16 型Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位插入1個(gè)人乳頭瘤病毒16型的E7表位而得到的嵌合蛋白質(zhì)”，本發(fā)明也包括該嵌合蛋白質(zhì)。為了制作本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)而插入Ll蛋白質(zhì)的人乳頭瘤病毒16型的E7表位具有MLDLQPETT (以下簡(jiǎn)稱 12-20E7 表位)，RAHYNIVTF (以下簡(jiǎn)稱 A9-57E7 表位)，LLMGTLGIV (以下簡(jiǎn)稱 82-90E7 表位)或TLGIVCPI (以下簡(jiǎn)稱86-93E7表位)所表示的氨基酸序列。HPV16型Ll蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，1HPV16型Ll蛋白的 E7表位的全長(zhǎng)氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，上述12-20E7表位、49-57E7表位、 82-90E7 表位和 86-93E7 表位的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、 SEQID NO. 6所示，12-20E7表位由HPV16型的E7蛋白質(zhì)的氨基酸12-20區(qū)域的9個(gè)氨基酸構(gòu)成。49-57E7表位由HPV16型的E7蛋白質(zhì)的氨基酸49-57區(qū)域的9個(gè)氨基酸構(gòu)成。 82-90E7表位由HPV16型的E7蛋白質(zhì)的氨基酸82-90區(qū)域的9個(gè)氨基酸構(gòu)成。86-93E7表位由HPV16型的E7蛋白質(zhì)的氨基酸86-93區(qū)域的8個(gè)氨基酸構(gòu)成。而且，在本發(fā)明中，從蛋白質(zhì)的氨基末端起依次對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)，例如第50 號(hào)位的氨基酸記作氨基酸50。E7-表位區(qū)域與許多細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合。如果導(dǎo)入氨基酸取代突變，則感染性消失， 這表明E7-表面區(qū)域在HPV的感染中肩負(fù)著不可或缺的功能(見(jiàn)附圖4)。該區(qū)域的氨基酸序列在所有高危型HPV的E7蛋白質(zhì)中極為保守。本發(fā)明研究了用具有HPV16型E7-表面區(qū)域的氨基酸序的合成肽免疫兔而得到的抗血清。結(jié)果如實(shí)施例所示(表1)。從表1的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)氨基酸12-20、49-57、82-90、86-93區(qū)域中存在交叉反應(yīng)性表位。即，由表1所示的結(jié)果可知在氨基酸12-20、49-57、82-90、86-93區(qū)域中存在抗16型、18型、31型、和58 型的交叉反應(yīng)性表位。因此，將上述交叉反應(yīng)性表位插入到Ll蛋白質(zhì)的氨基酸140與141之間，制作了嵌合蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步制作了嵌合VLP。S卩，本發(fā)明涉及在人乳頭瘤病毒(HPV) 16型Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位的氨基酸140與141之間插入一個(gè)人乳頭瘤病毒16型的E7表位而得到的嵌合蛋白質(zhì)，其中，所述E7表位具
有MLDLQPETT (以下簡(jiǎn)稱 12-20E7 表位)，RAHYNIVTF (以下簡(jiǎn)稱 A9-57E7 表位)，LLMGTLGIV (以下簡(jiǎn)稱 82-90E7 表位)或TLGIVCPI (以下簡(jiǎn)稱86-93E7表位)所表示的氨基酸序列。而且，本發(fā)明涉及作為上述嵌合蛋白質(zhì)的聚集體的病毒殼體。該聚集體是多個(gè)五聚體病毒顆粒的聚集體，所述五聚體病毒顆粒是五個(gè)嵌合蛋白質(zhì)聚集而成的，而且，多個(gè)五聚體病毒顆粒的聚集體具有粒子結(jié)構(gòu)對(duì)于發(fā)揮抗原性而言是適宜的。構(gòu)成所述聚集體的五聚體病毒顆粒的個(gè)數(shù)是例如65 80個(gè)的范圍，優(yōu)選為與天然型相同的72個(gè)。天然型VLP通常由360個(gè)分子的Ll蛋白質(zhì)形成，這種情況下，每個(gè)粒子具有360 個(gè)交叉反應(yīng)性表位(見(jiàn)附圖5)。使用重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)sf9細(xì)胞中表達(dá)將HPV16E7 蛋白質(zhì)的氨基酸12 20、49 57、82 90、86 93的序列插入HPV16L1蛋白質(zhì)的氨基酸140/141之間形成的VLP，電子顯微鏡照片顯示各嵌合VLP形成了粒子，分別命名為 Chl2/20, Ch49/57，Ch82/90, Ch86/93。在以這些嵌合VLP作為抗原的ELISA中顯示針對(duì)插入表位的抗體特異地結(jié)合(后敘實(shí)施例2中的表2)、表位被呈遞到VLP表面。用這些嵌合VLP免疫兔，得到了抗血清。在以具有與交叉反應(yīng)性表位相同的序列的合成肽作為抗原的ELISA中顯示各抗血清與插入表位特異地反應(yīng)。對(duì)朋￥16、18、31、52、58型假病毒的中和活性進(jìn)行考察，結(jié)果抗0112/20的抗體中和了 16、18、31型，抗Ch49/57的抗體中和了全部類型，抗Ch82/90的抗體中和了 16、18、31、 58型，抗Ch86/93的抗體中和了 16、31、52、58型。全部抗血清均針對(duì)以嵌合VLP作為骨架的HPV16型強(qiáng)烈反應(yīng)，這表明VLP所具有的中和表位在嵌合VLP中得以保存。感染性假病毒由360個(gè)分子的Ll蛋白質(zhì)和360個(gè)分子的E7蛋白質(zhì)構(gòu)成，因而，樣品中過(guò)量合成的E7以游離狀態(tài)存在。因此顯示低的抗E7抗體的中和效價(jià)。在動(dòng)物乳頭瘤病毒的實(shí)驗(yàn)中，VLP疫苗與E7蛋白質(zhì)疫苗的效果為同等程度，這顯示本發(fā)明的嵌合VLP能夠成為誘導(dǎo)抗交叉反應(yīng)性表位的抗體的實(shí)用性疫苗抗原。所述的E7表位還可以由下述氨基酸序列構(gòu)成，所述氨基酸序列是在前面所述的氨基酸序列即MLDLQPETT (以下簡(jiǎn)稱12-20E7表位)，RAHYNIVTF (以下簡(jiǎn)稱49-57E7表位)， LLMGTLGIV (以下簡(jiǎn)稱82-90E7表位)或TLGIVCPI (以下簡(jiǎn)稱86-93E7表位)所表示的氨基酸序列1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或增加而得到的、且能夠?qū)Ρ景l(fā)明的病毒殼體賦予與具有原來(lái)的E7表位[具有MLDLQPETT (以下簡(jiǎn)稱12-20E7表位)，RAHYNIVTF (以下簡(jiǎn)稱49-57E7表位)，LLMGTLGIV (以下簡(jiǎn)稱82-90E7表位)或TLGIVCPI (以下簡(jiǎn)稱86-93E7表位)所述氨基酸序列中的任一項(xiàng)]的VLP的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性的氨基酸序列。即12-20E7表位還包括具有下述氨基酸序列的E7表位的突變體，所述氨基酸序列由在MLDLQPETT所表示的氨基酸序列中1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或增加而得到的氨基酸構(gòu)成，且能夠?qū)Ρ景l(fā)明的病毒殼體賦予與具有12-20E7表位的HPV16型的VLP的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性。具有12-20E7表位的HPV16型的VLP的交叉反應(yīng)性如表4所
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49-57E7表位還包括具有下述氨基酸序列的E7表位的突變體，所述氨基酸序列由在RAHYNIVTF所表示的氨基酸序列中1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或增加而得到的氨基酸構(gòu)成，且能夠?qū)Ρ景l(fā)明的病毒殼體賦予與具有49-57E7表位的HPV16型的VLP的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性。具有49-57E7表位的HPV16型的VLP的交叉反應(yīng)性如表4所示。82-90E7表位還包括具有下述氨基酸序列的E7表位的突變體，所述氨基酸序列由在LLMGTLGIV所表示的氨基酸序列中1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或增加而得到的氨基酸構(gòu)成，且能夠?qū)Ρ景l(fā)明的病毒殼體賦予與具有82-90E7表位的HPV16型的VLP的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性。具有82-90E7表位的HPV16型的VLP的交叉反應(yīng)性如表4所示。類似的86-93E7表位還包括具有下述氨基酸序列的E7表位的突變體，所述氨基酸序列由在TLGIVCPI所表示的氨基酸序列中1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或增加而得到的氨基酸構(gòu)成，且能夠?qū)Ρ景l(fā)明的病毒殼體賦予與具有86-93E7表位的HPV16型的VLP的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性。具有86-93E7表位的HPV16型的VLP的交叉反應(yīng)性如表4 所示。而且，在發(fā)明中，氨基酸的缺失、取代或增加中的數(shù)個(gè)氨基酸是指2、3、4、5、6、7、8或者9個(gè)。在本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)中，插入E7表位的Ll蛋白質(zhì)是Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位即氨基酸140與141之間。S卩，插入上述8 9個(gè)氨基酸的E7來(lái)插入Ll蛋白質(zhì)的氨基酸140/141 之間。HPVieSLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列，從HPV16L1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析、中和抗體表位的分布一級(jí)病毒殼體形成所必需的半胱氨酸殘基的位置等觀點(diǎn)來(lái)看，可以推定包含氨基酸 140/141的區(qū)域，是Ll蛋白質(zhì)的外側(cè)，并且是能夠作為抗原被識(shí)別的區(qū)域之一。插入Ll蛋白質(zhì)的E7表位在1分子的Ll蛋白質(zhì)中有1個(gè)。但，也可以將種類不同的至少2種E7表位插入到1個(gè)Ll蛋白質(zhì)的不同環(huán)部位。例如，也可將上述4個(gè)交叉反應(yīng)性表位以外的肽插入到Ll蛋白質(zhì)的氨基酸140/141以外的部位。或者，也可以將上述4個(gè)交叉反應(yīng)性表位中的任一個(gè)插入到Ll蛋白質(zhì)氨基酸140/141以外的部位。以下詳細(xì)說(shuō)明下含E7表位的制作過(guò)程E7肽(氨基酸12-20、49-57、82-90或86-9 的制作可以通過(guò)常規(guī)方法，采用96 柱自動(dòng)肽合成裝置上的Fmoc固相法來(lái)進(jìn)行合成。而且，該肽因?yàn)槭怯糜诳贵w制作目的，所以連接有KLH (匙孔血藍(lán)蛋白)，為了防止該KLH掩蔽肽區(qū)域，在N末端增加了半胱氨酸殘基。本發(fā)明包含匙孔血藍(lán)蛋白與人乳頭瘤病毒16型的E7表位復(fù)合體。所述的E7表位具有MLDLQPETT (以下簡(jiǎn)稱 12_20E7 表位)，RAHYNIVTF (以下簡(jiǎn)稱 A9-57E7 表位)，LLMGTLGIV (以下簡(jiǎn)稱 82_90E7 表位)或TLGIVCPI (以下簡(jiǎn)稱86-93E7表位)所表示的氨基酸序列。匙孔血藍(lán)蛋白與E7表位優(yōu)先通過(guò)半胱氨酸結(jié)合在一起。以下詳細(xì)說(shuō)明下插入E7表位的Ll蛋白質(zhì)(嵌合蛋白質(zhì))的制作過(guò)程制作嵌合Ll基因，并利用桿狀病毒載體表達(dá)制作的嵌合Ll基因，從而制作了嵌合 Ll蛋白質(zhì)、嵌合病毒殼體。嵌合Ll基因的制作是通過(guò)PCR進(jìn)行的。具體如下。(A)制作帶有希望插入的部分引物對(duì)；
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(B)將帶有插入部分的引物中的一個(gè)與引物1或引物2組合來(lái)進(jìn)行PCR ；(C)合成了 2個(gè)一側(cè)帶有插入片段的DNA。使各互補(bǔ)部分退火，進(jìn)行延伸反應(yīng)；(D)制作帶有插入DNA的嵌合基因；(E)以該DNA為模板使用引物1和引物2進(jìn)行PCR ；(F)從而能夠擴(kuò)增帶有插入基因的DNA。本發(fā)明包括病毒殼體的生產(chǎn)方式，該病毒殼體的生產(chǎn)方法包括通過(guò)使本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)聚集來(lái)形成病毒殼體。如上述，制作嵌合Ll基因，并利用桿狀病毒載體表達(dá)該基因，從而制作嵌合Ll蛋白質(zhì)。這樣，嵌合Ll蛋白質(zhì)被制造出來(lái)后，其會(huì)自主地形成嵌合病毒殼體(本發(fā)明的病毒殼體)。利用桿狀病毒載體進(jìn)行的表達(dá)可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行，但從促進(jìn)嵌合病毒殼體的自主性形成的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選對(duì)條件進(jìn)行設(shè)定。上述病毒樣顆粒VLP的制備方法具體包含以下步驟1、構(gòu)建表達(dá)上述蛋白的嵌合基因。2、構(gòu)建包含嵌合基因的表達(dá)質(zhì)粒。3、構(gòu)建重組桿粒。4、獲得表達(dá)體系。5、表達(dá)、純化獲得的嵌合蛋白質(zhì)。6、將上述嵌合蛋白質(zhì)聚集制成病毒樣顆粒。本發(fā)明的病毒殼體用于Ll-病毒殼體疫苗(病毒樣顆粒)的生產(chǎn)。Ll-病毒殼體疫苗的生產(chǎn)可以使用例如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明包括含有2種以上的上述本發(fā)明的病毒殼體的病毒殼體混合物。本發(fā)明的 3種病毒殼體各自具有的交叉反應(yīng)性不同，通過(guò)將這些交叉反應(yīng)性不同的病毒殼體2種以上混合使用，優(yōu)點(diǎn)是能夠得到更高的中和活性。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 12-20E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 49-57E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。 混合物中，這兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，2種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 49-57E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 82-90E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。 混合物中，這兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，2種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 82-90E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 86-93E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。 混合物中，這兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，2種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 12-20E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 82-90E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。 混合物中，這兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，2種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 12-20E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 86-93E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。 混合物中，這兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，2種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 49-57E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 86-93E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。 混合物中，這兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，2種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 12-20E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 49-57E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物、 與作為插入了 82-90E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。對(duì)這3種病毒殼體而言，其中任意兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，3種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 12-20E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 49-57E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物、 與作為插入了 86-93E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。對(duì)這3種病毒殼體而言，其中任意兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，3種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 49-57E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 82-90E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物、 與作為插入了 86-93E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。對(duì)這3種病毒殼體而言，其中任意兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，3種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物例如可以是作為插入了 12-20E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體、與作為插入了 49-57E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物、與作為插入了 82-90E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物、與作為插入了 86-93E7表位得嵌合蛋白質(zhì)聚集體的病毒殼體的混合物。對(duì)這4種病毒殼體而言，其中任意兩種病毒殼體的質(zhì)量比在例如1 100 100 1的范圍。但，4種病毒殼體的混合比不限于在上述范圍內(nèi)，可以在考慮免疫原性、中和活性的基礎(chǔ)上，適宜地確定。本發(fā)明的病毒殼體混合物還可用于Ll-病毒殼體疫苗的生產(chǎn)。使用病毒殼體混合物的疫苗的生產(chǎn)方法與上述相同。本發(fā)明的病毒殼體混合物可以用于能夠誘導(dǎo)抗16型、18型、31型、52型和58型人乳頭瘤病毒的中和抗體的Ll-病毒殼體疫苗的生產(chǎn)。以下結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明嵌合蛋白質(zhì)及其制備方法、由嵌合蛋白質(zhì)聚集制成的病毒樣顆粒及其效果應(yīng)用。實(shí)施例11.1兔肽抗血清的制作對(duì)2只新西蘭兔(2. 5kg 3. Okg)進(jìn)行了免疫。所使用的抗原是化學(xué)合成的肽與 KLH(keyholelimpet hemocyanin)相結(jié)合而得到的。首次致敏是將0. 5mg抗原與弗氏完全佐劑一起皮下施用。首次施用2周后將0.25mg抗原與弗氏完全佐劑一起皮下施用。而且， 在2周后、4周后、6周后同樣(0. 25mg)地進(jìn)行致敏，共計(jì)進(jìn)行5次致敏。在末次致敏1周后，采集全血，得到了血清。采用以下所示的中和實(shí)驗(yàn)，考察了用具有HPV16型E7-表面區(qū)域的氨基酸序列的合成肽免疫兔而得到的抗血清。結(jié)果如表1所示。由表1所示的結(jié)果可知氨基酸12-20、49-57,82-90,86-93區(qū)域中存在交叉反應(yīng)性表位。1.2中和實(shí)驗(yàn)1.2.1.中和實(shí)驗(yàn)前一天，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)用平板中播種10000個(gè)/孔的細(xì)胞(購(gòu)自hvitrogen公司)。1.2.2.用 Neautralization Buffer (在除去酚紅的 DMEM培養(yǎng)基中添加 10% FCS、 非必需氨基酸、L-谷氨酸、IOmM HEPES而得到)稀釋血清，并與感染性假病毒相混
合，4°C反應(yīng)1小時(shí)，再將其添加于前一天播種的細(xì)胞。1. 2. 3.培養(yǎng)約72小時(shí)后，回收上清20 μ 1，采用Roden等的方法(參照http:// home. ccr. cancer. gov/lco/colorimetricSEAP. htm)測(cè)定堿性磷酸酶活性。表1抗E7肽抗體中和活性
權(quán)利要求
1.一種嵌合蛋白質(zhì)，其特征是該嵌合蛋白質(zhì)是在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入一個(gè)人乳頭瘤病毒16型的E7表位而得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白質(zhì)，其特征是所述的人乳頭瘤病毒16型的E7表位具有編碼如下蛋白質(zhì)(a)的基因(a)具有 MLDLQPETT 簡(jiǎn)稱 12-20E7 表位、RAHYNIVTF 簡(jiǎn)稱 49-57E7 表位、LLMGTLGIV 簡(jiǎn)稱 82-90E7 表位、或TLGIVCPI簡(jiǎn)稱86-93E7表位所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嵌合蛋白質(zhì)，其特征是所述的E7表位具有編碼如下蛋白質(zhì) (b)的基因?qū)?a)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與原人乳頭瘤病毒16型E7表位的嵌合蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
4.一種嵌合病毒樣顆粒，其特征是采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白質(zhì)聚集制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合病毒樣顆粒，其特征是該病毒樣顆粒是在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入1個(gè)人乳頭瘤病毒16型的 E7表位而得到的嵌合蛋白質(zhì)的聚集體，其中，所述的人乳頭瘤病毒16型的E7表位具有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因(a)具有MLDLQPETT 簡(jiǎn)稱 12-20E7 表位、RAHYNIVTF 簡(jiǎn)稱 49-57E7 表位、LMGTLGIV 簡(jiǎn)稱 82-90E7 表位、或TLGIVCPI簡(jiǎn)稱86-93E7表位所示的氨基酸序列；(b)將(a)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與原人乳頭瘤病毒16型E7表位的VLP的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的嵌合病毒樣顆粒，其特征是所述的嵌合蛋白質(zhì)的聚集體是由多個(gè)五聚體病毒顆粒組成的聚集體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合病毒樣顆粒，其特征是所述的五聚體病毒顆粒的個(gè)數(shù)為 60-85。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合病毒樣顆粒，其特征是所述的五聚體病毒顆粒的個(gè)數(shù)為72。
9.權(quán)利要求5所述的嵌合病毒樣顆粒的制備方法，其特征是通過(guò)在人乳頭瘤病毒 HPV16型Ll蛋白質(zhì)的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入一個(gè)人乳頭瘤病毒16型的 E7表位而得到的嵌合蛋白質(zhì)，將所述的嵌合蛋白質(zhì)聚集而成病毒樣顆粒VLP。
10.權(quán)利要求4或5所述的嵌合病毒樣顆粒在制備人乳頭瘤病毒HPV16型Ll-病毒樣顆粒疫苗中的應(yīng)用。
11.一種病毒樣顆粒的混合物，其特征是其含有在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入12-20E7表位嵌合蛋白的聚集體的病毒樣顆粒、 在人乳頭瘤病毒HPV16型Ll蛋白的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入49-57E7表位嵌合蛋白的聚集體的病毒樣顆粒、在人乳頭瘤病毒HPVieSLl蛋白的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入82-90E7表位嵌合蛋白的聚集體的病毒樣顆粒和在人乳頭瘤病毒 HPV16型Ll蛋白的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入82-90E7表位嵌合蛋白的聚集體的病毒樣顆粒中的兩種或幾種。
12.權(quán)利要求11所述的病毒樣顆?；旌衔镌谥苽淙巳轭^瘤病毒HPV16型Ll-病毒樣顆粒疫苗中的應(yīng)用，所述的人乳頭瘤病毒HPV16型Ll-病毒樣顆粒疫苗能夠誘導(dǎo)出至少抗16 型、18型、31型、52型和58型人乳頭瘤病毒的中和抗體。
13.一種復(fù)合體，其特征是，所述復(fù)合體為下述具有編碼(a)或(b)蛋白質(zhì)基因的人乳頭瘤病毒16型的E7表位與匙孔血藍(lán)蛋白經(jīng)連接形成的復(fù)合體，所述的人乳頭瘤病毒16型的E7表位具有編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)所示的基因(a)具有MLDLQPETT 簡(jiǎn)稱 12-20E7 表位、RAHYNIVTF 簡(jiǎn)稱 49-57E7 表位、LMGTLGIV 簡(jiǎn)稱 82-90E7 表位、或TLGIVCPI簡(jiǎn)稱86-93E7表位所示的氨基酸序列；(b)將(a)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與原人乳頭瘤病毒16型E7表位的VLP的交叉反應(yīng)性相同的交叉反應(yīng)性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的復(fù)合體，其特征是，所述的E7表位與匙孔血藍(lán)蛋白通過(guò)半胱氨酸連接。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種嵌合蛋白質(zhì)，是在人乳頭瘤病毒HPV16型L1蛋白質(zhì)的環(huán)部位即第140與141個(gè)氨基酸之間插入一個(gè)人乳頭瘤病毒16型的E7表位得到的；其中，人乳頭瘤病毒16型的E7表位具有編碼如下蛋白質(zhì)(a)的基因(a)由MLDLQPETT簡(jiǎn)稱12-20E7表位、RAHYNIVTF簡(jiǎn)稱49-57E7表位、LLMGTLGIV簡(jiǎn)稱82-90E7表位、或TLGIVCPI簡(jiǎn)稱86-93E7表位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。還公開(kāi)了由上述嵌合蛋白質(zhì)聚集而成的病毒樣顆粒和由病毒樣顆粒組成的混合物，及上述病毒樣顆粒及病毒樣顆?；旌衔镌谥苽淙巳轭^瘤病毒HPV16型L1-病毒樣顆粒疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/04GK102153656SQ20111000567
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者安鴻, 尹海濱 申請(qǐng)人:廣州市元通醫(yī)藥科技有限公司