專利名稱：鑒定抗阿維菌素小菜蛾種群的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蔬菜害蟲的分子鑒定技術(shù)，特別是一種鑒定抗阿維菌素小菜蛾種群的方法。
背景技術(shù)：
小菜蛾P(guān)lutella xylostella(L.)又名菜蛾，方塊蛾，屬鱗翅目(Lepidoptera), 菜蛾科(Plutellidae)，世界各地均有分布。在我國20世紀(jì)70年代以來逐漸上升為長江流域中、下游地區(qū)十字花科蔬菜的主要害蟲。小菜蛾主要為害十字花科植物，目前，對其防治以農(nóng)藥防治為主，物理防治和生物防治為輔。而化學(xué)防治中又以阿維菌素的使用最為廣泛， 主要是由于阿維菌素良好的防治效果和較低的價(jià)格決定的。阿維菌素作為一種高效經(jīng)濟(jì)的防治小菜蛾的藥劑已經(jīng)在田間使用很長時(shí)間。長期大面積反復(fù)施用必然導(dǎo)致小菜蛾抗藥性產(chǎn)生，目前全國各地均有報(bào)道，其中在云南，廣東等南方省份尤為嚴(yán)重，小菜蛾對阿維菌素抗性已經(jīng)達(dá)到上千倍。為了有效防治小菜蛾，鑒定小菜蛾種群是否對阿維菌素產(chǎn)生抗性以及抗性程度，對于采取防治措施是否恰當(dāng)非常有意義，目前鑒定小菜蛾的抗性大多通過生物測定，即采集至少300頭小菜蛾，設(shè)置5-6個(gè)梯度濃度的阿維菌素，然后觀察記錄小菜蛾的半致死劑量。該方法比較繁瑣，需要捕捉相當(dāng)大數(shù)量的小菜蛾才能進(jìn)行測定。有研究表明位于小菜蛾細(xì)胞膜上的GluCl α亞基是阿維菌素的作用受體之一。 GluCl α亞基基因的全長序列已于2008年由本實(shí)驗(yàn)室的梁延坡碩士克隆并且已在GenBank 上登錄(登陸ID = GQ221939. 1)。GluCl α亞基基因表達(dá)量與小菜蛾對阿維菌素的抗性之間的關(guān)系，以及如何利用GluCl α亞基基因采用分子檢測方法進(jìn)行小菜蛾抗性群體的鑒定的研究，對于小菜蛾的防治及抗性種群研究具有實(shí)用價(jià)值和指導(dǎo)性。到目前，并未見到有有效應(yīng)用GluCl α亞基基因來檢測抗阿維菌素小菜蛾種群的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過設(shè)計(jì)出特異性引物，運(yùn)用分子生物學(xué)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法鑒定小菜蛾種群對阿維菌素的抗性情況，僅僅需要幾頭待測小菜蛾即可完成鑒定，具有便捷， 準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。一種鑒定抗阿維菌素小菜蛾種群的方法，步驟如下(1)隨機(jī)捕捉5 15頭待測種群的小菜蛾，分別制備每頭小菜蛾的cDNA，即10個(gè)重復(fù)的待測樣品；(2)制備小菜蛾敏感種群的cDNA，即陰性對照樣品；(3)分別以待測樣品、陰性對照樣品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；(4)統(tǒng)計(jì)計(jì)算比較待測樣品與陰性對照樣品的熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)量是否具
有顯著差異；其特征在于所述熒光定量PCR采用的引物如下
YG-S16 CGTCTACATCCGCATCTTCC,
YG-A16CAAGATCGTCAGTCGTCCAA。所述小菜蛾敏感種群指對阿維菌素的半致死劑量為0. 05ug/ml以下。所述小菜蛾敏感種群為福建敏感種群。所述熒光PCR的反應(yīng)體系如下cDNA 1. Oul ；dNTP 2. Oul ;rTaq 酶 0. 2ul ； 10 X Buffer 2. Oul ；IOuM ^ YG-S160. 4ul ； IOuM 的 YG-A160. 4ul ；ddH20 至 20ul ；PCR 程序95 "C, 5. Omin ；95 V 0. 5 min，50-60 V 0. 5min，72 V lmin，35 循環(huán)； 72 0C 10min，4°C 停止。本發(fā)明根據(jù)梁延坡在2009提交的GluCl α亞基基因序列，設(shè)計(jì)了一序列GluCl α 亞基基因的特異性引物，并根據(jù)特異性引物對小菜蛾抗性與GluCl α亞基基因表達(dá)量之間的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)GluCl α亞基基因表達(dá)量與小菜蛾對阿維菌素的抗性呈正相關(guān)。根據(jù)這一結(jié)果，發(fā)明人將選得的一對特異性引物F16結(jié)合熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法提供一種堅(jiān)定小菜蛾抗性種群的方法測定小菜蛾的GluCl α亞基基因表達(dá)量，并與與陰性對照的基因表達(dá)量比較是否具有顯著差異，有顯著差異說明待測小菜蛾為抗性種群， 從而為進(jìn)一步的防治手段及用藥量提供指導(dǎo)和依據(jù)。由于本發(fā)明的方法的核心是采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行定量檢測和統(tǒng)計(jì)，因此，在檢測一個(gè)地區(qū)或一定區(qū)域的田間的小菜蛾是否為抗性種群時(shí)，僅僅需要捕捉少數(shù)幾頭做為檢測的樣品，每頭為一個(gè)重復(fù)，用作熒光定量 PCR的模板，不需要捕捉大量的小菜蛾用于進(jìn)行阿維菌素致死劑量的測定以判斷其是否為抗性種群。本發(fā)明的方法，需要設(shè)陰性對照，即敏感種群小菜蛾作為模板的對照，其一般為在不接觸任何藥劑的環(huán)境下飼養(yǎng)5以上的小菜蛾后代，GluCl α亞基基因表達(dá)量高于這類敏感種群且有顯著差異的小菜蛾種群說明為阿維菌素選擇壓環(huán)境下的后代，對阿維菌素有抗性，需要調(diào)整用藥量或者更換藥物種類。根據(jù)本發(fā)明的方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以采用任何符合這一要求的小菜蛾作為陰性對照。


圖1.總RNA電泳圖。圖2. cDNA經(jīng)Actin檢測電泳結(jié)果。圖3.福建敏感種群四齡小菜蛾退火溫度為50_60°C溫度梯度下，F(xiàn)16引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖4.福建敏感種群蛹期小菜蛾退火溫度為50-60°C溫度梯度下，F(xiàn)16弓丨物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖5.使用同時(shí)設(shè)計(jì)的其它引物對小菜蛾cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。從左到右依次為引物F14、F15、F17、F18和F19的電泳結(jié)果，每個(gè)引物4次重復(fù)。圖6.同時(shí)用其他小菜蛾種群的cDNA模板檢測F16海南(HN)種群和廣州敏感(GM)種群小菜蛾使用F16和Actin引物PCR產(chǎn)物電泳
結(jié)果，所得結(jié)果與福建敏感小菜蛾種群一致。
具體實(shí)施例方式
1..材料與方法11試驗(yàn)材料福建敏感(FM)和福建抗性(FT)小菜蛾，均為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)小菜蛾種群，其中福建抗性種群用阿維菌素持續(xù)汰選多代而得，福建敏感種群用無藥的甘藍(lán)葉飼喂至少5年而得(其阿維菌素半致死劑量為0. 05ug/ml以下)。海南種群(HN):海南種群小菜蛾為從海南田間采集而得。廣州敏感(GM)廣州敏感小菜蛾種群為本實(shí)驗(yàn)室長期飼養(yǎng)獲得。美國種群從美國帶回，在實(shí)驗(yàn)室用無藥的甘藍(lán)葉長期飼喂獲得。以上小菜蛾種群及其cDNA，本實(shí)驗(yàn)室均有保存，可向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。1.2試驗(yàn)基本情況。首先根據(jù)已知的GluCl α亞基基因序列設(shè)計(jì)小菜蛾特異性的熒光引物，然后提取福建敏感和抗性小菜蛾各齡期總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后以所得的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)所得參數(shù)進(jìn)行基因表達(dá)量分析。1. 3試驗(yàn)結(jié)果所得數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。2.結(jié)果與分析2. 1福建抗性小菜蛾的抗性測定由表1中可以看出，福建抗性小菜蛾相對于福建敏感的抗性倍數(shù)為180. 51倍，抗性水平較高。表1福建抗性小菜蛾種群同福建敏感小菜蛾種群對阿維菌素敏感性測定
~SS~~LC50 (ug/ml)斜率b±SE 95%置信限卡平方值抗性倍數(shù)
權(quán)利要求
1.鑒定抗阿維菌素小菜蛾種群的方法，步驟如下(1)隨機(jī)捕捉5 15頭待測種群的小菜蛾，分別制備每頭小菜蛾的CDNA，即10個(gè)重復(fù)的待測樣品；(2)制備小菜蛾敏感種群的cDNA，即陰性對照樣品；(3)分別以待測樣品、陰性對照樣品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；(4)統(tǒng)計(jì)計(jì)算比較待測樣品與陰性對照樣品的熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)量是否具有顯著差異；其特征在于所述熒光定量PCR采用的引物如下 YG-S16 CGTCTACATCCGCATCTTCC, YG-A16CAAGATCGTCAGTCGTCCAA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述小菜蛾敏感種群指對阿維菌素的半致死劑量為 0. 05ug/ml 以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述小菜蛾敏感種群為福建敏感種群。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述熒光PCR的反應(yīng)體系如下cDNA 1. Oul ；dNTP 2. Oul ；rTaq 酶 0. 2ul ； 10 X Buffer 2. Oul ； IOuM 的 YG-S160. 4ul ； IOuM 的 YG-A160. 4ul ；ddH20 至 20ul ；PCR程序:95°C,5. Omin ；95°C0. 5min，50_60°C 0. 5min，72°C lmin，35循環(huán)；72°C IOmin, 4°C停止。
全文摘要
本發(fā)明“鑒定抗阿維菌素小菜蛾種群的方法”，屬于蔬菜害蟲的分子鑒定技術(shù)。步驟如下(1)隨機(jī)捕捉5～15頭待測種群的小菜蛾，分別制備每頭小菜蛾的cDNA，即10個(gè)重復(fù)的待測樣品；(2)制備小菜蛾敏感種群的cDNA，即陰性對照樣品；(3)分別以待測樣品、陰性對照樣品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；(4)統(tǒng)計(jì)計(jì)算比較待測樣品與陰性對照樣品的熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)量是否具有顯著差異；其特征在于所述熒光定量PCR采用的引物如下YG-S16CGTCTACATCCGCATCTTCC，YG-A16CAAGATCGTCAGTCGTCCAA。僅僅需要幾頭待測小菜蛾即可完成鑒定，具有便捷，準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK102154468SQ20111000539
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者吳青君, 孫禮兵, 張友軍, 徐寶云, 柳峰, 梁延坡, 王少麗 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所