專利名稱：一種從組織中分離富集靶細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物科學(xué)和藥物研發(fā)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
靶細胞的分離，富集在細胞學(xué)，分子生物學(xué)和免疫學(xué)方面有著廣泛的應(yīng)用。報導(dǎo)的血液循環(huán)癌細胞的臨床研究結(jié)果顯示，癌癥患者的血液循環(huán)癌細胞的數(shù)量可以用于癌癥患者的早期檢測，診斷，病患的跟蹤和預(yù)后等。由于癌細胞在癌癥患者的血液中以極少量存在，為了能準確檢測血液中的癌細胞的存在和數(shù)量，需要對血液樣品中的癌細胞進行富集， 以提高其檢測的靈敏度和準確性。近年來，血液循環(huán)癌細胞的分離，富集越來越受到科研， 臨床上的重視。以乳腺癌患者為例，血液中循環(huán)癌細胞的數(shù)量與患者的臨床表現(xiàn)有著密切的關(guān)聯(lián)。在切除腫瘤組織后的最初的一段時間內(nèi)，臨床上就沒有多少其他指標可以用來跟蹤病患的病情。而乳腺癌的特點之一就是有很高的復(fù)發(fā)率，有效跟蹤病患的病情，在臨床上作出及時的處理，血液循環(huán)癌細胞的檢測可提供一行之有效的指標。分離富集靶細胞的方法很多。首先可以將其分為抗體依賴性和非抗體依賴性兩種。非抗體依賴性方法，主要是利用細胞的物理學(xué)特性(如細胞大小，密度和重量等)來分離靶細胞。而抗體依賴性方法又分為陽性富集和陰性富集。陰性富集是把非靶細胞成分去除來達到富集靶細胞的目的。而陽性富集則是利用靶細胞的特殊標記物(一般指特異性抗原等)來富集靶細胞。近年來的報導(dǎo)多是用新鮮的組織樣品來富集靶細胞?？墒?，臨床上多種病理組織，細胞和正常組織，細胞等樣品，多在不同狀態(tài)下保存。病理切片后，對特定的細胞進行研究分析，單個細胞的DNA/RNA收集和分析，在臨床研究和應(yīng)用方面已很普遍，但從切片組織中收集單個細胞的DNA/RNA是不全面地，不完整的。在癌癥標記物研發(fā)中，多是用癌組織與正常組織進行比較?？上攵┙M織中也有象血管，血液細胞和其他一些正常組織，細胞等存在于癌組織中，這給研發(fā)工作帶來了許多不定的因素。

發(fā)明內(nèi)容
本實用新型的目的是解決上述問題而提供了一種從組織中分離富集靶細胞的方法，該方法可以從不同處理狀態(tài)下的組織中分離富集靶細胞。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種從組織中分離富集靶細胞的方法，包括以下步驟
(1)將組織塊在緩沖液中制備成單細胞的懸浮液；
(2)對單細胞的懸浮液進行離心處理，除去上清液，加入胰蛋白酶處理；接著加入含有 10%動物血清的細胞培養(yǎng)基，離心處理，除去上清液；最后加入含有10%動物血清的細胞培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到試管內(nèi)；
(3)向試管內(nèi)加入磁珠，磁珠與懸浮液中的靶細胞相結(jié)合，在4°C或室溫下培養(yǎng)30 60分鐘；所述磁珠含有單一的靶細胞的表面抗體、細胞質(zhì)內(nèi)抗體或者兩者都有，磁珠粒徑為50nM 4. 5uM，磁珠的濃度為單細胞懸浮液濃度的十分之一到五百分之一；(4)利用磁場器械將靶細胞從細胞懸浮液中分離富集出來；
(5)加入緩沖液，清洗掉非特異性結(jié)合的非靶細胞；
(6)抽離磁場，讓與磁珠結(jié)合的靶細胞從磁場中釋放出來，從而得到靶細胞。進一步地，所述步驟(2)后，經(jīng)保-80°C以下或液態(tài)氮罐中保存過的樣品；當(dāng)需要對保存的組織進行靶細胞的分離和富集時，從液態(tài)氮罐中取出陽樣品，使組織樣品溶解，加入相當(dāng)于試管內(nèi)樣品體積的5 10倍的蛋白質(zhì)復(fù)性緩沖液，培養(yǎng)10 60分鐘后，就可以用來進行靶細胞的分離和富集。優(yōu)選地，所述組織為血液、骨髓液、組織塊。優(yōu)選地，所述步驟(1)緩沖液為磷酸緩沖液或不含動物血清的細胞培養(yǎng)液。優(yōu)選地，所述步驟(3)中表面抗體為上皮細胞粘附分子抗體，MUCl。優(yōu)選地，所述步驟(3)中細胞質(zhì)內(nèi)抗體為抗細胞角蛋白抗體。
更優(yōu)選地，所述靶細胞包括癌細胞。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
本發(fā)明的方法可以從任何處理狀態(tài)下的組織中分離富集靶細胞，例如從緩沖液(PBS， 細胞培養(yǎng)基等)處理過的新鮮組織塊、血液、骨髓樣品等，固定液(10%福爾馬林固定液、4% 多聚甲醛固定液、70%乙醇固定液、100%甲醇固定液等)固定過的組織樣品，低溫保存(10% 二甲基亞砜液氮處理液)過的活體組織中分離富集靶細胞。該方法應(yīng)用范圍包括分離富集， 鑒定不同的靶細胞，提供純化足夠量的活的或固定過的靶細胞。利用該方法可以提高靶細胞檢測的靈敏度，同時通過分離富集過程，可以收集到足夠量的靶細胞，提供高純度的靶細胞作為研究、臨床診斷和分析研究的材料。同時對細胞的鑒定，準確的臨床診斷以及藥物研發(fā)有著非常重要的意義。


下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1為實施例1中經(jīng)過10% 二甲基亞砜處理后富集癌細胞的顯微鏡圖； 圖2為實施例1中分離富集新鮮血液循環(huán)癌細胞的顯微鏡圖3為實施例1中癌細胞的抗細胞角蛋白抗體的FITC熒光標記成像圖； 圖4為實施例1中血液白細胞表達⑶45顯微鏡圖； 圖5為實施例1中顯示癌細胞和白細胞的細胞核被DAPI染色的顯微鏡圖； 圖6為實施例1中顯示白光下的癌細胞和白細胞的形態(tài)學(xué)特征和整體結(jié)構(gòu)顯微鏡圖； 圖7為實施例2中分離富集骨髓液中癌細胞的顯微鏡圖。
具體實施例方式實施例1
利用有上皮細胞粘附分子抗體結(jié)合的磁珠來分離，富集用10%二甲基亞砜培養(yǎng)基處理過的，在液態(tài)氮保存過的癌細胞。(1)把新鮮的癌組織塊加入到磷酸緩沖液(PBS)中，盡量拉細，制成有單細胞的懸浮液。(2)對單細胞的懸浮進行離心處理，離心速度為lOOOrpm，時間為5分鐘，除去上清液，加入胰蛋白酶(Tripsin)處理5分鐘；接著加入含有10%小牛血清的細胞培養(yǎng)基 ’離心處理，離心速度為lOOOrpm，時間為5分鐘，除去上清液；最后加入含有10%DMS0的小牛血清，轉(zhuǎn)移到2mL試管內(nèi)。(3)將試管保存在_80°C下12小時，然后轉(zhuǎn)移到液態(tài)氮罐中進行保存。(4)從液態(tài)氮罐中取出所需癌組織，使癌組織溶解；加入10倍體積的蛋白質(zhì)復(fù)性緩沖液，培養(yǎng)60分鐘；最后再加入與上述體積等量的，含10%小牛血清的細胞培養(yǎng)基。(5)加入有上皮細胞粘附分子抗體結(jié)合的磁珠(StemCellTechnology)，于4°C或室溫下培養(yǎng)30分鐘到一小時。(6)用磁棒將癌細胞從懸浮液中分離富集出來。(7)用緩沖液清洗掉非特異性結(jié)合的非靶細胞。(8)抽離磁場，讓與磁珠結(jié)合的靶細胞從磁場中釋放出來，從而得到靶細胞。圖1是經(jīng)過10% 二甲基亞砜培養(yǎng)基處理后富集癌細胞的顯微鏡圖，從圖1中可以看出，超低溫保存過的癌細胞，單個的癌細胞或一群癌細胞，可以被癌細胞的特異性抗體結(jié)合，由磁珠富集出來。從而得出的結(jié)論是本發(fā)明的靶細胞的分離富集方法，在功能上是多方面的，在應(yīng)用上是成功的。對上述分離富集出來的癌細胞進行血液循環(huán)癌細胞熒光免疫鑒定。(1)將分離富集到的含有血液循環(huán)癌細胞的樣品用離心機離心到PLL載玻片 (Sigma)上(800rpm, 3min Cytospin)。(2)讓載玻片上的樣品在室溫或在Slide warmer (Fisher)上干燥30-60分鐘。(3)用-20°C的100%丙酮固定樣品10分鐘。(4)在空氣中干燥30分鐘。(5)用磷酸緩沖液(PBS)洗滌2次，每次3分鐘。(6)用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CAM5. 2或PAN抗體，TexasRed標記的CD45 抗體混合物對細胞進行染色30分鐘到一小時。(7)用pH7. 0-的磷酸緩沖液(PBS)緩沖液洗滌載玻片樣品5分鐘。(8)用上述緩沖液稀釋了的蘇木精依紅染色液(50%濃度)，將上述載玻片樣品染色 3分鐘。(9)用上述緩沖液，加熱到37度，洗滌載玻片樣品3次。(10)加一滴DAPI安裝試劑(Vector Laboratories)，蓋上蓋玻片，10分鐘后，就可以在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。(11)該載玻片樣品在-20°C密封度保存。通過以上步驟，可以獲得以下結(jié)果，參照圖2至圖6。從圖2中可以看出，分離富集到的新鮮血液循環(huán)癌細胞(方形框內(nèi)的細胞)。用這一染色法，不僅可以觀察熒光標記到的蛋白質(zhì)標記物，同時還可以觀察到白光下的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。圖3為癌細胞的抗細胞角蛋白抗體的FITC熒光標記成像(這意味癌細胞的抗細胞角蛋白抗體陽性);圖4顯示只有血液白細胞表達⑶45 (Texas紅色)，癌細胞則沒有；圖5顯示癌細胞和白細胞的細胞核都可以被 DAPI染色；圖6顯示白光下的癌細胞和白細胞的形態(tài)學(xué)特征和整體結(jié)構(gòu)。從而得出的結(jié)論是本實施例的染色方法，采用局部特征和整體特征相結(jié)合，對癌細胞和血液白細胞的鑒定是最可靠的。
實施例2
本實施例是從骨髓液中分離富集的癌細胞，并對癌細胞進行檢測，其具體步驟如下 (1)用癌癥患者的臨床抽取的骨髓液，用PBS稀釋3倍。(2)混合后，加入十分之一體積的有上皮細胞粘附分子抗體的磁珠，4度或常溫下培養(yǎng)30分鐘到一個小時。(3)用磁鐵吸附管中的有磁珠結(jié)合的靶細胞。用PBS緩沖液清洗三次。(4)抽離磁鐵，讓有磁珠結(jié)合的靶細胞釋放。(5)收集靶細胞，鑒定癌細胞。細胞鑒定方法與實施例1相同。通過以上步驟，可以獲得以下結(jié)果，參照圖7。從圖7中可以看到上皮細胞粘附分子抗體陽性的骨髓癌細胞，被有效地富集到，從而得出的結(jié)論是本實施例的癌細胞富集方法可以有效的應(yīng)用到臨床癌癥病患的骨髓液樣品。最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種從組織中分離富集靶細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將組織塊在緩沖液中制備成單細胞的懸浮液；(2)對單細胞的懸浮液進行離心處理，除去上清液，加入胰蛋白酶處理；接著加入含有 10%動物血清的細胞培養(yǎng)基，離心處理，除去上清液；最后加入含有10%動物血清的細胞培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到試管內(nèi)；(3)向試管內(nèi)加入磁珠，磁珠與懸浮液中的靶細胞相結(jié)合，在4°C或室溫下培養(yǎng)30 60分鐘；所述磁珠含有單一的靶細胞的表面抗體、細胞質(zhì)內(nèi)抗體或者兩者都有，磁珠粒徑為50nM 4. 5uM，磁珠的濃度為單細胞懸浮液濃度的十分之一到五百分之一；(4)利用磁場器械將靶細胞從細胞懸浮液中分離富集出來；(5)加入緩沖液，清洗掉非特異性結(jié)合的非靶細胞；(6)抽離磁場，讓與磁珠結(jié)合的靶細胞從磁場中釋放出來，從而得到靶細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從組織中分離富集靶細胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)后，經(jīng)保-80°C以下或液態(tài)氮罐中保存過的樣品；當(dāng)需要對保存的組織進行靶細胞的分離和富集時，從液態(tài)氮罐中取出陽樣品，使組織樣品溶解，加入相當(dāng)于試管內(nèi)樣品體積的 5 10倍的蛋白質(zhì)復(fù)性緩沖液，培養(yǎng)10 60分鐘后，就可以用來進行靶細胞的分離和富集。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從組織中分離富集靶細胞的方法，其特征在于，所述組織為血液、骨髓液、組織塊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從組織中分離富集靶細胞的方法，其特征在于，所述步驟 (1)緩沖液為磷酸緩沖液或不含動物血清的細胞培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從組織中分離富集靶細胞的方法，其特征在于，所述步驟(3) 中表面抗體為上皮細胞粘附分子抗體，MUCl。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從組織中分離富集靶細胞的方法，其特征在于，所述步驟(3)中細胞質(zhì)內(nèi)抗體為抗細胞角蛋白抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任意一項所述的從組織中分離富集靶細胞的方法，其特征在于， 所述靶細胞包括癌細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從組織中分離富集靶細胞的方法，屬于生物科學(xué)和藥物研發(fā)領(lǐng)域。該方法將組織制備成單細胞的懸浮液，利用陽性富集法將靶細胞從該細胞懸浮液中分離富集出來。本方法可以從不同處理狀態(tài)下的組織中分離富集出靶細胞，為基礎(chǔ)研究，臨床研究，診斷，以及藥物研發(fā)等提供足夠量的，高度純化的實驗材料。
文檔編號C12N5/07GK102174465SQ20111000537
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者鄧亞光, 鄧偉平, 鄧存常 申請人:武漢格藍麗富科技有限公司