一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法及檢測(cè)芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種外泌體分離、富集和檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，包括：設(shè)計(jì)和組裝雙膜過(guò)濾芯片，構(gòu)建芯片ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本收集、注樣和清洗，芯片ELISA檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理分析。本發(fā)明還提供一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)芯片。本發(fā)明的反應(yīng)體系與檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)膀胱癌患者尿液樣本或膀胱癌細(xì)胞系培養(yǎng)液上清中外泌體的含量，本方法具有高度特異性的特點(diǎn)，且不會(huì)對(duì)人體造成任何影響或創(chuàng)傷，檢測(cè)方法也不需要昂貴且精密的實(shí)驗(yàn)儀器（如超速離心機(jī)、熒光顯微鏡），具有很大的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法及檢測(cè)芯片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及開(kāi)發(fā)一種集成尿液外泌體分離、富集及ELISA檢測(cè)的微流體芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤。是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是全身十大常見(jiàn)腫瘤之一。占我國(guó)泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位。檢查方法包括尿常規(guī)檢查、尿脫落細(xì)胞學(xué)、尿腫瘤標(biāo)記物、腹部和盆腔B超等檢查。根據(jù)上述檢查結(jié)果決定是否行膀胱鏡、靜脈尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等檢查明確診斷。其中，膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的最主要方法。然而膀胱鏡檢測(cè)費(fèi)用高，并不適用于基層醫(yī)療單位或者貧困地區(qū)的普及應(yīng)用，臨床上亟待尋找一種針對(duì)膀胱癌檢測(cè)的生物標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。外泌體(exosomes)是一種直徑約為40-120nm，具有雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，由細(xì)胞通過(guò)胞吐作用釋放至細(xì)胞外隙或生物學(xué)體液中。近年來(lái)，外泌體成為新的研究熱點(diǎn)，因其內(nèi)包含來(lái)源細(xì)胞所特有的mRNAs、micr0RNAs及蛋白等多種信號(hào)分子，在信號(hào)傳導(dǎo)和免疫系統(tǒng)中起重要作用，并由完整的膜性結(jié)構(gòu)包裹而減少微環(huán)境干擾，這使其在疾病診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性，是研究生物標(biāo)志物和進(jìn)行腫瘤免疫的新的生物材料，同時(shí)也具有治療潛力。
[0003]目前針對(duì)外泌體的研究主要分為分離技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)。分離技術(shù)包括超速離心法、過(guò)濾離心法、密度梯度超速離心法、免疫磁珠結(jié)合超速離心法和色譜法等。檢測(cè)技術(shù)主要包括:掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)(但SEM對(duì)樣品的預(yù)處理和制備上面要求較高，樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜，不適合對(duì)外泌體進(jìn)行大量快速的測(cè)量，而且由于外泌體經(jīng)過(guò)了預(yù)處理和制備過(guò)程，無(wú)法準(zhǔn)確的進(jìn)行外泌體濃度的測(cè)量)、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(但由于動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)是測(cè)量光強(qiáng)的波動(dòng)數(shù)據(jù)，所以大顆粒的光強(qiáng)波動(dòng)信號(hào)會(huì)掩蓋較小顆粒的光強(qiáng)波動(dòng)信號(hào)，所以動(dòng)態(tài)光散射不適合大小不一的復(fù)雜外泌體樣本的測(cè)量，只適合通過(guò)色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測(cè)量，并且無(wú)法測(cè)量樣品中外泌體的濃度。)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)(流式細(xì)胞儀不僅可以檢測(cè)囊泡的大小、數(shù)量，而且通過(guò)熒光標(biāo)記可以檢測(cè)囊泡的來(lái)源，將囊泡進(jìn)行分類(lèi)，因此，流式細(xì)胞儀是進(jìn)行囊泡快速、高通量、多參數(shù)檢測(cè)的最優(yōu)選擇。然而，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀針對(duì)的樣本主要是細(xì)胞，散射光的檢測(cè)極限通常是300-500nm，而大多數(shù)細(xì)胞外囊泡的直徑都在300nm以下，因此很難進(jìn)行精確地定量和定性分析。)、納米微粒追蹤分析技術(shù)(是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，可以直接和實(shí)時(shí)的觀測(cè)納米顆粒。由于外泌體表面有標(biāo)志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在復(fù)雜的背景環(huán)境下(如血清中)，可以用熒光抗體標(biāo)記外泌體，再用NTA的熒光測(cè)量功能實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜背景下對(duì)外泌體的測(cè)量，但是需要精密的儀器)、流式細(xì)胞儀分析技術(shù)(但是流式細(xì)胞分析一次只能針對(duì)一個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，夕卜泌體太小，由目前的流式細(xì)胞儀設(shè)備檢測(cè)，有必要先綁定外來(lái)抗體包被的磁珠，需要精密的儀器設(shè)備，且操作繁瑣、敏感度各異)、免疫印跡檢測(cè)技術(shù)(操作過(guò)程復(fù)雜)和熒光定量PCR檢測(cè)分析microRNA(提取核酸步驟復(fù)雜，需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器)。因此，發(fā)展一種能夠可靠、快速、經(jīng)濟(jì)地?zé)o創(chuàng)檢測(cè)外泌體尤其是膀胱癌患者來(lái)源的外泌體的方法非常必要。微流體芯片微流體芯片實(shí)驗(yàn)室，是指把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離檢測(cè)等基本操作單位集成或基本集成一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。是生命科學(xué)、化學(xué)科學(xué)與信息科學(xué)信號(hào)檢測(cè)和處理方法研究的重要技術(shù)平臺(tái)。具有集成性、分析速度快、高通量、能耗少、污染小、廉價(jià)、安全等特點(diǎn)。因此，構(gòu)建一種集成外泌體分離、富集、檢測(cè)為一體的微流體芯片，擁有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]外泌體在尿液中可以穩(wěn)定存在，尤其是尿液樣品可以在非創(chuàng)傷性損傷的前提下大量獲得。因此，如果能夠檢測(cè)尿液外泌體中的癌癥信息，則有望將其用于癌癥的無(wú)創(chuàng)診斷、監(jiān)控等臨床應(yīng)用。然而，實(shí)際上，由于單位體積尿液中的外泌體含量非常低，采用一般方法單次提取得到的外泌體，根本無(wú)法滿足后續(xù)檢測(cè)的要求，所以目前針對(duì)外泌體的檢測(cè)主要是先對(duì)樣本中的外泌體進(jìn)行濃縮處理，之后再采取一定的表征測(cè)量。因此，本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題，研制了一種集成外泌體分離、富集和檢測(cè)為一體的微流體芯片，同時(shí)利用外泌體跨膜蛋白⑶63這一特有的標(biāo)志物，建立了一種芯片ELISA快速診斷方法。該方法在膀胱癌患者外泌體檢測(cè)、監(jiān)測(cè)等方面具有一定的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種外泌體分離、富集和檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，該方法為外泌體芯片ELISA檢測(cè)方法，可有效檢測(cè)膀胱癌患者體內(nèi)外泌體的量，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)，實(shí)用性強(qiáng)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下具體步驟:
I)設(shè)計(jì)和組裝雙膜過(guò)濾芯片:所述雙膜過(guò)濾芯片為四層PMMA板，從上至下的每一層厚度分別為2 mm, I mm, I mm,和2 mm,芯片外徑尺寸為20 I 40 I 6 mm，相鄰兩層PMMA板之間用雙面膠(DSA)連接，中間兩層PMMA板上分別切割有上下位置一致的進(jìn)液孔和廢液排出孔，最上層的PMMA板為切割有直徑1.8 mm的兩個(gè)圓孔的PMMA板層;第二層為切割有直徑10 mm的兩個(gè)圓孔的PMMA板層;第三層為割有直徑10 mm的兩個(gè)圓孔，同時(shí)兩個(gè)圓孔之間用寬度1.5mm，長(zhǎng)度為I Imm的渠道相連的PMMA板層;最后一層，為PMMA平板。其中，中間兩層PMMA板之間設(shè)有兩層DSA膠，這兩層DSA膠之間粘附有孔徑分別為200nm和30nm的聚碳酸酯膜(如圖1)，用于液體的過(guò)濾和外泌體的收集。
[0007]2)構(gòu)建芯片ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線:
①收集膀胱癌患者尿液樣本200mL，采用超速離心方法(2，OOOg室溫離心10-15min，并去除細(xì)胞及其碎片，將上清液用100，000 g轉(zhuǎn)速超離l_2h，后用pH 7.4的I3BS重懸外泌體沉淀，
②將①所得外泌體懸液，按照1:3，1:9,1:27和1:81的不同比例進(jìn)行稀釋，之后分別取上述一定量的外泌體懸液原液和稀釋液各300 yL，以40yL/min的流速用微流注射栗注入到步驟I)的雙膜過(guò)濾芯片中，
③之后，每個(gè)雙膜過(guò)濾芯片繼續(xù)以相同的流速注入300yL ant1-⑶63(1:200-1:500稀釋，濃度為2-5 yg/mL)后，于25°C條件下進(jìn)行孵育l-1.5h，
④用300-400yLPBS緩沖液清洗雙膜過(guò)濾芯片，重復(fù)三-四次，清洗結(jié)束后向每個(gè)雙膜過(guò)濾芯片內(nèi)以相同的流速注入500yL—定量的空氣來(lái)排盡雙膜過(guò)濾芯片內(nèi)液體，
⑤向每個(gè)雙膜過(guò)濾芯片注入300yL鏈霉親合素標(biāo)記的HRP(1:2000-1:5000稀釋，濃度為0.2-0.5 yg/mL)，并放在于濕盒里于37°C孵育l_2h，
⑥重復(fù)步驟④和⑤三-四次。
[0008]⑦向每個(gè)雙膜過(guò)濾芯片注入300yL TMB顯色液，并于暗室中37°C顯色5-30min，
⑧用手機(jī)成像系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，
⑨最后利用無(wú)線信號(hào)傳輸?shù)焦P記本電腦，對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，從而構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0009]3)樣本收集、注樣和清洗:收集健康志愿者/膀胱癌患者尿液樣本10 ml，采用2，000 g室溫離心10-15分鐘，并去除細(xì)胞及其殘片，將上清液用微流注射栗以40yL/min的流速連續(xù)注入雙膜過(guò)濾芯片中，注入體積為8mL，最后用400yLpH 7.4的PBS以40yL/min的流速注入到雙膜過(guò)濾芯片中，重復(fù)該步驟3-4次，完成捕獲樣本的清洗。
[0010]4)芯片ELISA檢測(cè):采用步驟2)的③-⑨，對(duì)步驟3)所捕獲的外泌體進(jìn)行檢測(cè)。
[0011]5)數(shù)據(jù)處理分析:將檢測(cè)結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行外泌體濃度的比對(duì)。
[0012]6)按照步驟2)-5)以PBS緩沖液替代外泌體，設(shè)立陰性對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)照。
[0013]本發(fā)明中首先進(jìn)行微流體芯片的設(shè)計(jì)和組裝。利用激光切割機(jī)進(jìn)行芯片主體PMMA板的切割組裝。PMMA板的厚度范圍為l_2mm。樣本進(jìn)出口軟管外徑為1.5-1.8mm，所述軟管和芯片主體均用膠粘合牢固。
[0014]構(gòu)建外泌體ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即將超離自尿液中的外泌體連讀系列倍比稀釋(1；1:3; 1:9; 1:27; 1:81)成不同的濃度，之后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。后續(xù)，樣本收集測(cè)定結(jié)果與已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，來(lái)判定患者體內(nèi)外泌體的含量。
[0015]在采用上述技術(shù)方案的同時(shí)，本發(fā)明還可以采用或者組合采用以下進(jìn)一步的技術(shù)方案:
將液體注入到雙膜過(guò)濾芯片中時(shí)，液體進(jìn)樣速度范圍為30-60yL/min，用微流注射栗或者自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行樣本注入。
[0016]所述樣本清洗中采用的洗滌液，為磷酸鹽緩沖液roS(pH 7.4 土 0.2)，洗滌次數(shù)通常可以為2-4次。
[0017]在向雙膜過(guò)濾芯片中加樣時(shí)，每個(gè)樣本做2-3個(gè)重復(fù)，每孔300yL。
[0018]所述加完樣的酶標(biāo)板的靜置反應(yīng)為生物素和鏈霉親合素結(jié)合，其反應(yīng)溫度一般為35-37°C，時(shí)間通常為1-2小時(shí)。
[0019]所述的顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，顯色反應(yīng)為HRP和TMB結(jié)合反應(yīng)，顯色反應(yīng)時(shí)間一般為5-30分鐘，反應(yīng)溫度一般為35-37 °C。
[0020]本發(fā)明的ELISA檢測(cè)方法的反應(yīng)體系，主要包括以下組分:外泌體、生物素標(biāo)記的ant 1-⑶63、鏈霉親合素的HRP、TMB顯色液、終止反應(yīng)液、樣本洗滌液PBS和尿液樣本。
[0021]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)芯片，能夠完成外泌體的分離、富集并為檢測(cè)做基礎(chǔ)。
[0022]本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)芯片，包括底板、頂板以及位于所述底板和頂板之間的檢測(cè)板，所述檢測(cè)板包括上層檢測(cè)板和下層檢測(cè)板，所述頂板上設(shè)有切割形成的注液孔和排液孔，所述注液孔上連接有注液軟管，所述排液孔上連接有排液軟管，所述上層檢測(cè)板和下層檢測(cè)板上分別設(shè)有進(jìn)樣孔和廢液排出孔所述注液孔與所述進(jìn)樣孔的位置相對(duì)應(yīng)，所述排液孔和所述廢液排出孔的位置相對(duì)應(yīng)；
所述頂板和所述上層檢測(cè)板之間通過(guò)第一雙面膠層固定粘貼在一起，所述第一雙面膠層上設(shè)有分別與所述注液孔和所述排液孔相對(duì)應(yīng)的第一開(kāi)孔，所述上層檢測(cè)板和所述下層檢測(cè)板之間設(shè)有兩層第二雙面膠層，這兩層DSA雙面膠層上均設(shè)有分別與所述進(jìn)樣孔和所述廢液排出孔對(duì)應(yīng)的第二開(kāi)孔，位于進(jìn)樣孔下方的第二開(kāi)孔之間粘附有孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片，位于廢液排出孔下方的第二開(kāi)孔之間粘附有孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片;所述下層檢測(cè)板上設(shè)有連通所述進(jìn)樣孔和所述廢液排出孔的第一通道;下層檢測(cè)板和所述底板之間設(shè)有第三雙面膠層，所述第三雙面膠層上設(shè)有分別與所述進(jìn)樣孔和所述廢液排出孔對(duì)應(yīng)的第三開(kāi)孔，所述第三開(kāi)孔之間設(shè)有與所述第一通道對(duì)應(yīng)的第二通道。
[0023]在采用上述技術(shù)方案的同時(shí)，本發(fā)明還可以采用或者組合采用以下進(jìn)一步的技術(shù)方案:
所述底板、頂板和上下層檢測(cè)板均為形狀大小一致的PMMA板。
[0024]所述注液孔和所述排液孔的孔徑均為1.8mm，所述進(jìn)樣孔和所述廢液排出孔的孔徑均為10mm，所述注液孔與進(jìn)樣孔同心設(shè)置，所述排液孔與所述廢液排出孔同心設(shè)置。
[0025]構(gòu)成所述底板、頂板以及檢測(cè)板的PMMA板的長(zhǎng)度為40mm，寬度為20mm，所述集成檢測(cè)芯片的厚度為6mm。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
I)本發(fā)明提供了一種用于集成外泌體分離、富集及檢測(cè)微流體芯片，同時(shí)構(gòu)建了芯片ELISA檢測(cè)方法。該反應(yīng)體系與檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)膀胱癌患者尿液樣本或膀胱癌細(xì)胞系培養(yǎng)液上清中外泌體的含量，本方法具有高度特異性的特點(diǎn)。
[0027]2)本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象是排出人體之外的尿液，容易獲得，且不會(huì)對(duì)人體造成任何影響或創(chuàng)傷，檢測(cè)方法也不需要昂貴且精密的實(shí)驗(yàn)儀器(如超速離心機(jī)、熒光顯微鏡)，具有很大的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0028]附圖用于和具體實(shí)施案例結(jié)合對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0029]圖1是雙膜過(guò)濾芯片結(jié)構(gòu)示意圖。
[0030]圖2是雙膜過(guò)濾芯片實(shí)物圖。
[0031]圖3是雙膜過(guò)濾芯片的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比圖。
[0032]圖4是外泌體ELISA檢測(cè)原理圖。
[0033]圖5是外泌體芯片ELI SA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0034]圖6是外泌體分離、富集及檢測(cè)流程圖。
[0035]圖7是ELISA檢測(cè)方法臨床檢測(cè)箱線圖。
[0036]圖8是ROC曲線分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)注意，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0038]實(shí)施案例中未注明具體試驗(yàn)條件和試驗(yàn)方法的按照常規(guī)條件和方法或者制造商所建議的條件予以實(shí)施。
[0039]本發(fā)明中未特別說(shuō)明的各種儀器和試劑均為本領(lǐng)域熟知的市售產(chǎn)品，可通過(guò)商業(yè)途徑米購(gòu)獲得。
[0040]實(shí)施例1:膀胱癌患者尿液中外泌體的分離及芯片ELISA方法檢測(cè)，參照附圖1_8。
[0041]請(qǐng)參閱圖1-7，一種尿液外泌體分離、富集及ELISA檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，包括如下步驟:
I)在患者知情及倫理委員會(huì)同意的前提下，收集膀胱癌患者(臨床活檢已證實(shí)為膀胱癌)尿液樣本16份，健康捐贈(zèng)者8份，每份100ml，在室溫2，OOOg的離心條件下去除細(xì)胞及大的碎片，然后得到上層清液。
[0042]2)將I)得到的上層清夜，于4°C條件下，100，OOOg超速離心60分鐘，棄掉上清取沉淀，并用ImL pH 7.4的PBS緩沖液重懸外泌體(如圖1)。
[0043]3)將I)所得上層清夜，利用微流栗，以流速40yL/min注入到雙膜過(guò)濾芯片中，連續(xù)過(guò)濾8次。
[0044]4)將2)所得外泌體，按照3倍倍比進(jìn)行系列稀釋，分別保存，以備后續(xù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0045 ] 5 )將4 )所備外泌體進(jìn)行芯片ELISA檢測(cè)(原理如圖2 )，首先向4 )中芯片注入抗體，每孔加入1:200-1: 500稀釋的300 yL的ant1-CD63(b1tin_labeled)抗體(即濃度為2-5 μ8/!1^)，25°(:溫育1-1.511。
[0046]6)向5)中注入300-400yL PBS緩沖液進(jìn)行清洗，重復(fù)三次。
[0047]7)向6)每個(gè)芯片內(nèi)以相同的流速注入500yL空氣來(lái)排盡芯片內(nèi)液體。
[0048]8)向7)每個(gè)芯片注入300yL鏈霉親合素標(biāo)記的HRP( 1:2000-1:5000稀釋，濃度為
0.2-0.5 yg/mL)，并放在濕盒里于37°C孵育1-2K9)重復(fù)步驟6)和7)。
[0049]10)向9)中每個(gè)過(guò)濾芯片注入300yL TMB顯色液，并于暗室中37°C顯色5_30min。
[0050]11)用圖像采集系統(tǒng)(例如手機(jī)中從成像系統(tǒng))進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。
[0051]12)將11)所得數(shù)據(jù)通過(guò)無(wú)線信號(hào)傳輸?shù)焦P記本電腦中，利用ImageJ進(jìn)行RGB分析，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖4-5)，同時(shí)采用上述1)-12)步驟進(jìn)行膀胱癌患者外泌體含量檢測(cè)，并進(jìn)行ROC曲線分析和構(gòu)建箱線圖。檢測(cè)結(jié)果如圖6。
[0052]實(shí)施例2，集成檢測(cè)芯片，參照附圖1-3。
[0053]本發(fā)明的微流體芯片包括底板1、頂板2以及位于所述底板和頂板之間的檢測(cè)板，所述檢測(cè)板內(nèi)設(shè)有液體檢測(cè)腔，所述液體檢測(cè)腔能夠?qū)⒛蛞褐械耐饷隗w收集于其中，并通過(guò)多次注樣富集達(dá)到檢測(cè)的要求。
[0054]所述檢測(cè)板包括上層檢測(cè)板3和下層檢測(cè)板4，所述頂板2上設(shè)有切割形成的注液孔5和排液孔12，所述注液孔5上連接有注液管6，所述排液孔12上連接有排液管13，所述上層檢測(cè)板3和下層檢測(cè)板4上分別設(shè)有進(jìn)樣孔7和廢液排出孔8，所述注液孔5與所述進(jìn)樣孔7的位置相對(duì)應(yīng)，所述排液孔12和所述廢液排出孔8的位置相對(duì)應(yīng)。
[0055]所述頂板2和所述上層檢測(cè)板3之間通過(guò)第一雙面膠層9固定粘貼在一起，所述第一雙面膠層9上設(shè)有分別與所述注液孔5和所述排液孔12相對(duì)應(yīng)的第一開(kāi)孔14，所述上層檢測(cè)板3和所述下層檢測(cè)板4之間設(shè)有兩層第二雙面膠層15，這兩層DSA雙面膠層15上均設(shè)有分別與所述進(jìn)樣孔7和所述廢液排出孔8對(duì)應(yīng)的第二開(kāi)孔16，位于進(jìn)樣孔7下方的第二開(kāi)孔16之間粘附有孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片10，位于廢液排出孔8下方的第二開(kāi)孔16之間粘附有孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片17。
[0056]所述下層檢測(cè)板4上設(shè)有連通所述進(jìn)樣孔7和所述廢液排出孔8的第一通道11。
[0057]下層檢測(cè)板4和所述底板I之間設(shè)有第三雙面膠層18，所述第三雙面膠層18上設(shè)有分別與所述進(jìn)樣孔7和所述廢液排出孔8對(duì)應(yīng)的第三開(kāi)孔19，所述第三開(kāi)孔19之間設(shè)有與所述第一通道11對(duì)應(yīng)的第二通道20。
[0058]所述底板1、頂板2和上下層檢測(cè)板均為形狀大小一致的PMMA板。
[0059]構(gòu)成所述底板1、頂板2以及檢測(cè)板的PMMA板的長(zhǎng)度為40mm，寬度為20mm，所述微流體芯片的整體厚度為6mm。
[0060]所述第一雙面膠層9、第二雙面膠層15以及第三雙面膠層18均為DSA雙面膠。
[0061 ]所述注液管5和所述排液管13均為無(wú)菌軟管。
[0062]所述注液孔5和所述排液孔12的孔徑均為1.8mm，所述進(jìn)樣孔7和所述廢液排出孔8的孔徑均為10mm，所述注液孔5與進(jìn)樣孔7同心設(shè)置，所述排液孔12與所述廢液排出孔8同心設(shè)置。
[0063]本實(shí)施例中，利用激光切割機(jī)進(jìn)行芯片主體PMMA板的切割組裝，PMMA板的厚度范圍為1-2_，作為樣本進(jìn)出口軟管的注液管外徑為1.5-1.8mm，所述軟管和芯片主體均用膠粘合牢固。
[0064]本發(fā)明的微流體芯片的工作原理是:將待檢測(cè)的尿液通過(guò)注液管5按照一定流速注入到注液孔5中，并由此進(jìn)入上層檢測(cè)板3的進(jìn)樣孔7，尿液經(jīng)過(guò)設(shè)置在上層檢測(cè)板3的進(jìn)樣孔7下方的孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片10的過(guò)濾，將雜志和大分子細(xì)胞去除，濾液進(jìn)入到下層檢測(cè)板4的進(jìn)樣孔7中，并通過(guò)通道11進(jìn)入下層檢測(cè)板4上的廢液排出孔8內(nèi)，經(jīng)由孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片17的過(guò)濾，外泌體被收集在下層間的版14的廢液排出孔8內(nèi)，濾液透過(guò)第二聚碳酸酯膜片17進(jìn)入到上層檢測(cè)板3的廢液排出孔8內(nèi)，并能經(jīng)由排液孔12和排液管13被排出。
[0065]本發(fā)明的芯片在實(shí)際使用中的案例如實(shí)施例1所述。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下具體步驟: 1)設(shè)計(jì)和組裝雙膜過(guò)濾芯片:所述雙膜過(guò)濾芯片為四層PMMA板，相鄰兩層PMMA板之間用雙面膠(DSA)連接，中間兩層PMMA板上分別切割有上下位置一致的進(jìn)液孔和廢液排出孔，最上層的PMMA板上切割有分別與進(jìn)液孔和廢液排出孔對(duì)應(yīng)的注液孔和排液孔，所述注液孔和排液孔上分別連接軟管，最底層為PMMA平板，中間兩層PMMA板之間設(shè)有兩層DSA膠，這兩層DSA膠之間粘附有孔徑分別為200nm和30nm的聚碳酸酯膜，用于液體的過(guò)濾和外泌體的收集； 2)構(gòu)建芯片ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線: ①收集，并去除細(xì)胞及其碎片，將上清液超離后用PBS重懸外泌體沉淀， ②將①所得外泌體懸液，按照不同比例進(jìn)行稀釋，之后分別取一定量的外泌體懸液原液和稀釋液用微流注射栗注入到步驟I)的雙膜過(guò)濾芯片中， ③之后，每個(gè)雙膜過(guò)濾芯片繼續(xù)注入ant1-CD63(1:200-1:500稀釋，濃度為2-5yg/mL)后進(jìn)行孵育， ④用PBS緩沖液進(jìn)行清洗雙膜過(guò)濾芯片，清洗結(jié)束后向每個(gè)雙膜過(guò)濾芯片內(nèi)注入一定量的空氣來(lái)排盡雙膜過(guò)濾芯片內(nèi)液體， ⑤向每個(gè)雙膜過(guò)濾芯片注入300yL鏈霉親合素標(biāo)記的HRP(1:2000-1:5000稀釋，濃度為0.2-0.5 yg/mL)，并于濕盒孵育， ⑥向每個(gè)雙膜過(guò)濾芯片注入TMB顯色液，并于暗室中顯色， ⑦用成像系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集， ⑧對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，從而構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線； 3)樣本收集、注樣和清洗:收集尿液樣本，室溫離心并去除細(xì)胞及其殘片，將上清液用微流注射栗連續(xù)注入雙膜過(guò)濾芯片中，后用pH 7.4的I3BS以一定流速注入到雙膜過(guò)濾芯片中，重復(fù)數(shù)次，完成樣本的清洗； 4)芯片ELISA檢測(cè):采用步驟2)的③-⑧，對(duì)步驟3)所捕獲的外泌體進(jìn)行檢測(cè)； 5)數(shù)據(jù)處理分析:將檢測(cè)結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行外泌體濃度的比對(duì)。2.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，其特征在于，將液體注入到雙膜過(guò)濾芯片中時(shí)，液體的進(jìn)樣速度范圍為30-60yL/min，用微流注射栗或者自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行樣本注入。3.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，其特征在于，所述樣本清洗中采用的洗滌液為磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4 ± 0.2)，洗滌次數(shù)為2-4次。4.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，其特征在于，在向雙膜過(guò)濾芯片中加樣時(shí)，每個(gè)樣本重復(fù)2-3次，每孔300yL。5.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，其特征在于，加完樣的酶標(biāo)板在進(jìn)行濕盒孵育時(shí)的靜置反應(yīng)為生物素和鏈霉親合素結(jié)合，其反應(yīng)溫度為35-37°C，時(shí)間為1-2小時(shí)。6.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)方法，其特征在于，所述的顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，顯色反應(yīng)為HRP和TMB結(jié)合反應(yīng)，顯色反應(yīng)時(shí)間為5-30分鐘，反應(yīng)溫度為35-37 °C。7.一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)芯片，其特征在于:包括底板(I)、頂板(2)以及位于所述底板和頂板之間的檢測(cè)板，所述檢測(cè)板包括上層檢測(cè)板(3)和下層檢測(cè)板(4)，所述頂板(2)上設(shè)有切割形成的注液孔(5)和排液孔(12)，所述注液孔(5)上連接有注液軟管(6)，所述排液孔(12)上連接有排液軟管(13)，所述上層檢測(cè)板(3)和下層檢測(cè)板(4)上分別設(shè)有進(jìn)樣孔(7)和廢液排出孔(8)，所述注液孔(5)與所述進(jìn)樣孔(7)的位置相對(duì)應(yīng)，所述排液孔(12)和所述廢液排出孔(8)的位置相對(duì)應(yīng)； 所述頂板(2)和所述上層檢測(cè)板(3)之間通過(guò)第一雙面膠層(9)固定粘貼在一起，所述第一雙面膠層(9)上設(shè)有分別與所述注液孔(5)和所述排液孔(12)相對(duì)應(yīng)的第一開(kāi)孔(14)，所述上層檢測(cè)板(3)和所述下層檢測(cè)板(4)之間設(shè)有兩層第二雙面膠層(15)，這兩層DSA雙面膠層(15)上均設(shè)有分別與所述進(jìn)樣孔(7)和所述廢液排出孔(8)對(duì)應(yīng)的第二開(kāi)孔(16)，位于進(jìn)樣孔(7)下方的第二開(kāi)孔(16)之間粘附有孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片(10)，位于廢液排出孔(8)下方的第二開(kāi)孔(16)之間粘附有孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片(17);所述下層檢測(cè)板(4)上設(shè)有連通所述進(jìn)樣孔(7)和所述廢液排出孔(8)的第一通道(11);下層檢測(cè)板(4)和所述底板(I)之間設(shè)有第三雙面膠層(18)，所述第三雙面膠層(18)上設(shè)有分別與所述進(jìn)樣孔(7)和所述廢液排出孔(8)對(duì)應(yīng)的第三開(kāi)孔(19)，所述第三開(kāi)孔(19)之間設(shè)有與所述第一通道(11)對(duì)應(yīng)的第二通道(20)。8.如權(quán)利要求7所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)芯片，其特征在于:所述底板(I )、頂板(2)和上下層檢測(cè)板均為形狀大小一致的PMMA板。9.如權(quán)利要求7所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)芯片，其特征在于:所述注液孔(5)和所述排液孔(12)的孔徑均為1.8mm，所述進(jìn)樣孔(7)和所述廢液排出孔(8)的孔徑均為10mm，所述注液孔(5)與進(jìn)樣孔(7)同心設(shè)置，所述排液孔(12)與所述廢液排出孔(8)同心設(shè)置。10.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測(cè)的集成檢測(cè)芯片，其特征在于:構(gòu)成所述底板(I)、頂板(2 )以及上下層檢測(cè)板的PMMA板的長(zhǎng)度為40mm，寬度為20mm，所述集成檢測(cè)芯片的厚度為6mm。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK106093392SQ201610386872
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月5日 公開(kāi)號(hào)201610386872.5, CN 106093392 A, CN 106093392A, CN 201610386872, CN-A-106093392, CN106093392 A, CN106093392A, CN201610386872, CN201610386872.5
【發(fā)明人】梁利國(guó), 孔夢(mèng)奇, 盛葉峰, 王書(shū)崎
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)