一種分離細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種分離細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體（exosome）的方法，步驟為：收集新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基通過離心除去培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞以及其他細(xì)胞碎片和雜質(zhì)；然后將上清液移入濃縮管中濃縮，在濃縮后的培養(yǎng)基中加入Total?Exosome?Isolation（invitrogen）來最終提取外泌體。該方法可以方便的得到細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體，且大大降低分離成本。
【專利說明】一種分離細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體屬于一種分離細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體(exosome)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]外泌體(exosome)是由細(xì)胞內(nèi)的多泡體(multivesicular body,MVB)與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約40-100nm的膜性囊泡。很多細(xì)胞均能分泌外泌體，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。外泌體中包含有多種蛋白質(zhì)和RNA，在細(xì)胞之間起到傳遞信息和相互調(diào)控的作用，而這種傳遞信息的方式和相互調(diào)控的機(jī)制并不完全清楚，尤其是在腫瘤細(xì)胞之間:外泌體是否將癌細(xì)胞的特征信息傳遞到了癌旁組織，并通過所包含的蛋白促進(jìn)其癌變？外泌體是否對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖以及浸潤(rùn)有影響？等等。
[0003]這些急待解決的問題都遇到了一個(gè)共同的瓶頸，那就是外泌體的提取與分離。在目前的研究中用到的外泌體的分離方法主要有兩種:
[0004]第一種是超高速離心或者是密度梯度離心，這種方法有一個(gè)限制因素，那就是需要配備超高速離心機(jī)，而這種設(shè)備的價(jià)格是非常昂貴的，因此限制了一些中小型實(shí)驗(yàn)室對(duì)外泌體的研究。
[0005]第二種是利用試劑盒提取，這種方法也有缺點(diǎn)，采用這種方法時(shí)，收集的新鮮培養(yǎng)基，僅通過較低的離心力除去細(xì)胞及其碎片，然后就加入抽提試劑，孵育，然后離心，而離心得到的沉淀很可能因?yàn)榛煊屑?xì)胞器以及一些其它細(xì)胞雜質(zhì)而純度不高，從而影響后續(xù)試驗(yàn)。而且培養(yǎng)基不經(jīng)過濃縮就利用試劑盒抽提，對(duì)試劑盒的消耗也是很大的，如果要進(jìn)行長(zhǎng)期或大規(guī)模研究，這也將成為一個(gè)限制因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于尋找一種低成本高效率的方法來分離提取培養(yǎng)基中的外泌體。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供的一種分離細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體的方法，具體步驟如下:
[0008]I)收集新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基于離心管中，4°C，300g離心15分鐘，除去培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片；該步驟中，若離心力過大則可能使未破裂的懸浮細(xì)胞破裂，導(dǎo)致細(xì)胞中的細(xì)胞器和其它雜質(zhì)也進(jìn)入培養(yǎng)基中，不利于第二步中對(duì)細(xì)胞器和其他雜質(zhì)的除去，離心力為300g時(shí)最佳。
[0009]2)將步驟I)中離心過后的上清液移入新的離心管中，4°C，IOOOOg離心30分鐘，除去細(xì)胞器和其他雜質(zhì)。
[0010]3)將步驟2)中離心后的上清液移入30KD的濃縮管中，4°C，3000g離心濃縮，將培養(yǎng)基濃縮至原體積的1/30至1/50 ;該步驟中，選用30KD濃縮管可以最大限度的截留不同尺寸的外泌體，同時(shí)也可以除去培養(yǎng)基中的血清蛋白。
[0011]4)將步驟 3)中濃縮后的培養(yǎng)基與 Total Exosome Isolation (invitrogen)以2: I的體積比混合，震蕩混勻后，4°C過夜孵育；然后將孵育后的混合液在4°C，IOOOOg離心I小時(shí)，得到的沉淀即為外泌體。
[0012]本發(fā)明采用離心和試劑綜合運(yùn)用的方法，可以實(shí)現(xiàn)快速高效的提取細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體，且本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0013]首先，避免了超高速離心機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)的限制，本方法中用到的最高離心力僅為lOOOOg，這在一般的生物實(shí)驗(yàn)室都可以達(dá)到。
[0014]其次，通過多次離心將細(xì)胞器以及細(xì)胞凋亡小體等干擾因素除去，使得接下來通過試劑盒提取得到的外泌體的純度更高。
[0015]最后，通過濃縮管將培養(yǎng)基濃縮成較小的體積，這樣可以相應(yīng)的減少試劑的用量，這對(duì)于想要進(jìn)行長(zhǎng)期或大規(guī)模研究的實(shí)驗(yàn)室來說，無疑節(jié)省了一大筆費(fèi)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為分別利用超速離心和本發(fā)明所述方法進(jìn)行外泌體分離后外泌體沉淀的對(duì)照?qǐng)D片。
[0017]圖2為用Western blot的方法檢測(cè)超速離心和本發(fā)明所述方法分離得到的外泌體的標(biāo)志物⑶63。
[0018]圖3為用Di0(細(xì)胞膜綠 色熒光探針)檢測(cè)用本發(fā)明所述方法分離得到的外泌體
的直徑。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下具體實(shí)施例是為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體試驗(yàn)條件和試驗(yàn)方法的按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件實(shí)施。
[0020]本發(fā)明所使用的各種器材和試劑均為本領(lǐng)域所熟知的產(chǎn)品，可市售獲得。
[0021]實(shí)施例1
[0022]將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腸癌細(xì)胞DLDl接種于三個(gè)直徑為IOcm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿7X IO5個(gè)細(xì)胞，在37°C，5%的CO2的條件下用不含抗生素的RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)到融合度為90%時(shí)，換成新的不含抗生素的RPMI1640+10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)基，每皿10mL，培養(yǎng)24小時(shí)后，將三個(gè)皿的培養(yǎng)基約30mL分別收集到兩個(gè)50mL的離心管中，然后分別編號(hào)A和B，A采用超速離心的方法分離外泌體，同時(shí)B采用本發(fā)明所述的方法分離外泌體。
[0023]本發(fā)明方法:步驟如下:
[0024]I)收集新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基于離心管中，4°C，300g離心15分鐘，除去培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片。
[0025]2)將步驟I)中離心過后的上清液移入新的離心管中，4°C，IOOOOg離心30分鐘，除去細(xì)胞器和其他雜質(zhì)。
[0026]3)將步驟2)中離心后的上清液移入30KD的濃縮管中，4°C，3000g離心濃縮，將培養(yǎng)基濃縮至原體積的1/30至1/50。[0027]4)將步驟 3)中濃縮后的培養(yǎng)基與 Total Exosome Isolation (invitrogen)以2: I的體積比混合，震蕩混勻后，4°C過夜孵育；然后將孵育后的混合液在4°C，IOOOOg離心I小時(shí)，得到的沉淀即為外泌體。
[0028]結(jié)果如圖1所示，A為通過超速離心分離得到的外泌體，B為用本發(fā)明所述方法的分離得到的外泌體。兩者通過直觀的方法可以看出，本發(fā)明所提供的方法分離出的外泌體較多。
[0029]實(shí)施例2
[0030]用例I中分離得到的外泌體進(jìn)行western blot試驗(yàn)檢測(cè)外泌體中的標(biāo)志性蛋白CD63。
[0031](I)在上述分離得到的外泌體中加入適量含有PMSF的膜蛋白提取液，4°C孵育30min后在液氮中反復(fù)凍融三次，使其充分裂解。
[0032](2)利用BCA法測(cè)定裂解物中的蛋白濃度，確保每個(gè)樣品的蛋白總量相同，然后加Λ5Χ上樣緩沖液，100°C變性5min，進(jìn)行10%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2h。
[0033](3)封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗去封閉液，加入⑶63的抗體，4°C孵育過夜。次日，用TBST洗去一抗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2小時(shí)，然后用TBST緩沖液洗去二抗，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑后進(jìn)行成像分析。
[0034]結(jié)果如圖2所示，樣品I為超速離心法分離得到的外泌體，樣品2為本發(fā)明所述方法分離得到的外泌體?？?見本方法與超速離心分離得到的外泌體在生物學(xué)特性上沒有區(qū)別。
[0035]實(shí)施例3
[0036]通過熒光顯微鏡觀察用本發(fā)明方法分離得到的外泌體。
[0037](I)將實(shí)施例一中分離得到的外泌體用適量PBS重新懸起，加入DiO(細(xì)胞膜綠色突光探針)，染色約10分鐘，使得外泌體標(biāo)記上綠色突光。
[0038](2) IOOOOg離心I小時(shí)，棄去上清液加入PBS洗去未結(jié)合的探針分子。
[0039](3)重復(fù)(2)中的步驟一次。
[0040](4)將分離得到的外泌體用PBS重新懸起，將此懸液涂抹到載玻片上，待其干燥后封片，在突光顯微鏡下觀察。
[0041]結(jié)果如圖3所示分離得到的外泌體被染上綠色，并且外泌體的直徑也與文獻(xiàn)報(bào)道相符。
【權(quán)利要求】
1.一種分離細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體的方法，其特征在于，步驟為: 1)收集新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基于離心管中，4°c，300g離心15分鐘，除去培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片； 2)將步驟I)中離心過后的上清液移入新的離心管中，4°C，IOOOOg離心30分鐘，除去細(xì)胞器和其他雜質(zhì)； 3)將步驟2)中離心后的上清液移入30KD的濃縮管中，4°C，3000g離心濃縮，將培養(yǎng)基濃縮至原體積的1/30至1/50 ； 4)將步驟3)中濃縮后的培養(yǎng)基與invitrogen公司生產(chǎn)的TotalExosome Isolation以2:1的體積比混合，震蕩混勻后，4°C過夜孵育；然后將孵育后的混合液在4°C、IOOOOg離心I小時(shí)，得到 外泌體。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103468642SQ201310435800
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】張立超, 李宗偉, 李卓玉, 李汗卿 申請(qǐng)人:山西大學(xué)