用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法。本發(fā)明提供的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液、捕獲抗體包被的微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液、底物液、洗滌液、陰性對照液和陽性對照液。本發(fā)明提供的二聯(lián)免疫試劑盒是采用特異性識(shí)別膀胱癌腫瘤標(biāo)志物：抗膀胱腫瘤抗原BTA與抗膀胱AG?α3β1抗體兩株單克隆抗體，利用雙抗體提高膀胱癌的早期診斷。同時(shí)本發(fā)明還結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析方法進(jìn)行分析，提供一種高靈敏、特異好、操作簡便、價(jià)格適宜的定量檢測的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒。
【專利說明】
用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膀胱癌(bladder carcinoma，BC)是我國泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，大約90% 的膀胱癌為移行細(xì)胞癌，其中約70%為表淺性，20%為浸潤性，增加了膀胱癌早期診斷的難 度。膀胱腫瘤的發(fā)生可先后或同時(shí)伴有腎盂、輸尿管、尿道腫瘤等并發(fā)癥，加重了膀胱癌患 者的病情。在國外，膀胱腫瘤的發(fā)病率在男性泌尿生殖器腫瘤中僅次于前列腺癌，居第2位； 在國內(nèi)則占首位，嚴(yán)重影響人們的身體健康。
[0003] 目前，膀胱癌早期診斷的方法有:尿液分析，尿脫落細(xì)胞分析，超聲、CT或者M(jìn)RI成 像觀察和膀胱鏡觀察等。但是，尿液分析不能確定患者是否患有膀胱癌;尿脫落細(xì)胞分析和 超聲、CT或者M(jìn)RI成像觀察對膀胱癌早期診斷存在靈敏度不高、差異較大、容易出現(xiàn)漏檢現(xiàn) 象的缺陷；而膀胱鏡觀察是一種有創(chuàng)性檢查，不能用于膀胱癌早期篩查環(huán)節(jié)。因此，研究和 探索出一種特異性更高、更靈敏的膀胱癌檢測方法是當(dāng)前亟需解決的問題。
[0004] 特異性膀胱腫瘤標(biāo)志物是實(shí)現(xiàn)快速、便捷檢測膀胱癌的重要手段。中國專利 CN103018461B公開了一種尿液早期診斷膀胱癌的免疫試劑盒及其制備方法，所述的試劑盒 是利用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析法，通過檢測人尿液中的膀胱癌腫瘤標(biāo)志物-異常糖基化 的整合素 AG-a3i3^立的一種快速、靈敏、高特異性的早期診斷膀胱癌的檢測方法。該試劑盒 具有簡便、快速、靈敏、高特異、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于常規(guī)體檢中膀胱癌早期篩查及膀胱癌跟 蹤觀察和預(yù)后評價(jià)，滿足目前膀胱癌體外診斷方面缺乏特異診斷方法的需要。
[0005] 中國專利CN103033625B公開了一種人膀胱癌細(xì)胞化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其制備 方法，所述的試劑盒是采用免疫磁顆粒特異捕獲、酶標(biāo)記單克隆抗體特異識(shí)別的雙抗體夾 心方法，實(shí)現(xiàn)了膀胱癌細(xì)胞的特異性檢測，該檢測方法具有操作簡便、檢測時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)， 有利于臨床大規(guī)模的應(yīng)用。
[0006] 目前，膀胱腫瘤標(biāo)志物的檢測方法大大的提高了膀胱癌檢測的準(zhǔn)確性和特異性， 在膀胱癌的早期篩查及預(yù)后方面具有重要的臨床價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性高的膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試 劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，所述二聯(lián)免疫 試劑盒組成如下:標(biāo)準(zhǔn)品溶液、捕獲抗體包被的微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體 溶液、底物液、洗滌液、陰性對照液和陽性對照液。
[0008] 進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為膀胱癌患者尿液樣本的逐級稀釋液，所述標(biāo)準(zhǔn)品溶 液用作制備定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將包含膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-a^的量定義為1U/ ml。所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度梯度為0、1、2、4、8、16、32、64、128U/ml，用其標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣 本中膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱Α6-α3β4^濃度。
[0009] 進(jìn)一步地，所述捕獲抗體包被的微孔板的制備方法為:將抗膀胱腫瘤抗原ΒΤΑ與抗 膀胱AG-a^i抗體配制成包被緩沖液，將包被緩沖液加入微孔板中，室溫過夜，接著再加入封 閉液，室溫過夜，洗滌，干燥，封板，于4°C保存;所述封閉液為復(fù)合封閉液：1000ml磷酸緩沖 液，其中含〇.3g NaH2P〇4· 2H20和3.2g Na2HP〇4· 12H20,加入8g酪蛋白、2g水解明膠和lml生 物防腐劑，所述封閉液的pH值為8.4。
[0010] 進(jìn)一步地，所述微孔板為適用于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的檢測為96孔微孔板，也可以是任 意孔數(shù)的微孔板。
[0011] 進(jìn)一步地，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液的制備方法為：
[0012] 采用碳二亞胺偶聯(lián)法，將辣根過氧化物酶加入碳二亞胺中，再加入抗膀胱腫瘤抗 原BTA抗體與抗膀胱AG-a^i抗體，得辣根過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱腫瘤抗原BTA抗體和辣根過 氧化物酶標(biāo)記抗膀胱AG-a^i抗體;將0.5mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱腫瘤抗原BTA抗 體和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱AG-aWi抗體、〇.35m g//L的聚乙二醇200加入17mmol/L PBS 緩沖液，pH值為8.6,即得。
[0013] 進(jìn)一步地，所述底物液由A液和B液組成，其中，500mlA液為0.913g魯米諾、0.023g 4-羥基聯(lián)苯和6.5g硼酸，pH值為7.5;500ml B液為0.159g過氧化脈，pH為6.8。
[0014]進(jìn)一步地，所述洗滌液為含有2-3 % Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
[0015] 進(jìn)一步地，所述陰性對照液為不含膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-a^的正常人全尿 樣本;所述陽性對照液為含有膀胱癌腫瘤標(biāo)志物膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-a#d^膀胱癌 患者全尿樣本。
[0016] 另外，本發(fā)明還提供了一種用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒的制備方法， 包括以下步驟：
[0017] S1配制標(biāo)準(zhǔn)品；
[0018] S2制備捕獲抗體包被的微孔板；
[0019] S3制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液；
[0020] S4配制底物液、洗滌液、陰性對照液和陽性對照液；
[0021] S5分裝上述各組分，組裝，即得。
[0022]本發(fā)明采用〃膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-a3fo雙抗體夾心法〃的反應(yīng)模式，即載體 上包被的抗體與酶標(biāo)記的抗體和被測樣品的膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-aWi形成〃包被雙 抗體-抗原-雙抗體-酶〃的夾心復(fù)合物結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供的酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液能特異 地識(shí)別尿液中的膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-a^i，同時(shí)本發(fā)明還結(jié)合高靈敏的化學(xué)發(fā)光免 疫分析方法進(jìn)行分析，提供了一種高靈敏、高特異、操作簡便、價(jià)格適宜的定量檢測的用于 膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] (1)本發(fā)明提供的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒可以靈敏、快速測定尿 液中膀胱癌腫瘤標(biāo)志物-膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-aWi的含量，對膀胱癌患者的早期診 斷、早期治療提供可靠的臨床參考價(jià)值，能夠?qū)崿F(xiàn)無創(chuàng)性地早期篩查膀胱癌的目標(biāo)；
[0025] (2)本發(fā)明提供的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒可以大大提高膀胱腫瘤 抗BTA與膀胱AG-aWi檢測的線性范圍，可以從膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-a^i含量的變化 判斷膀胱癌治療效果及其病情的變化，有利于提高治療效果；
[0026] (3)本發(fā)明提供的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒既可應(yīng)用于開放式的半 自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測量儀，也可用于全自動(dòng)的測量系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)大批量快速檢測，更易于推廣應(yīng) 用。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面將進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求 保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附 權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0028] 下列實(shí)施例中未注明具體試驗(yàn)條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆試 驗(yàn)指南
[0029] (Sambrook J ?et al.2008.Molecular Cloning：A Laboratory Manual?3rd Ed.) 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0030] 實(shí)施例1、用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒
[0031] 所述用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒的制備：
[0032] S1配制標(biāo)準(zhǔn)品;所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度梯度為0、1、2、4、8、16、32、64、128U/ml;
[0033] S2制備捕獲抗體包被的微孔板;采用0.05M pH值為9.5的碳酸鹽緩沖液與適當(dāng)濃 度的抗膀胱腫瘤抗原BTA與抗膀胱AG-a3m抗體混合配制成包被液，所述1000ml的碳酸鹽緩 沖液包含2.86g的NaHC0 3、1.48g的Na2C03、和10g NaCl，將包被緩沖液加入微孔板中，每孔 120μ1，室溫過夜，接著再加入封閉液，每孔250μ1，室溫過夜，用含有2 % Tween-20的磷酸鹽 緩沖液洗滌，干燥，封板，于4°C保存;所述封閉液為復(fù)合封閉液：1000ml磷酸緩沖液，其中含 0.3g NaH2P〇4· 2H20和3.2g Na2HP〇4· 12H20,加入8g酪蛋白、2g水解明膠和lml生物防腐劑， 所述封閉液的pH值為8.4;
[0034] S3制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液;采用碳二亞胺偶聯(lián)法，將20mg辣 根過氧化物酶溶解于檸檬酸鹽緩沖液中，加入碳二亞胺，l〇min后加入N-羥基硫代琥珀酰亞 胺，洗去多余碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺后，再加入lmg抗膀胱腫瘤抗原BTA抗體與 lmg抗膀胱AG-a^i抗體，得辣根過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱腫瘤抗原BTA抗體和辣根過氧化物酶 標(biāo)記抗膀胱AG-a^i抗體;將0.5mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱腫瘤抗原BTA抗體和辣根 過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱AG-a^i抗體、0.35mg/L的聚乙二醇200加入17mmo 1/L PBS緩沖液，pH 值為8.6;
[0035] S4配制底物液和洗滌液;所述底物液由A液和B液組成，其中，500ml A液為0.913g 魯米諾、0.023g 4-羥基聯(lián)苯和6.5g硼酸，pH值為7.5; 500ml B液為0.159g過氧化脈，pH為 6.8;所述洗滌液為含有2 % Tween-20的磷酸鹽緩沖液;所述陰性對照液為不含膀胱腫瘤抗 原BTA與膀胱AG-a^i的正常人全尿樣本;所述陽性對照液為含有膀胱癌腫瘤標(biāo)志物膀胱腫 瘤抗原BTA與膀胱AG-asfo的膀胱癌患者全尿樣本。
[0036] S5分裝上述各組分，組裝，即得。
[0037]實(shí)施例2、用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒的使用方法 [0038] 1、樣品前處理：
[0039]取人的尿液，無需其它特殊處理，直接進(jìn)行分析。
[0040] 2、檢測步驟：
[0041] 采用實(shí)施例1中所制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、捕獲抗體包被的微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo) 記的單克隆抗體溶液、底物液、洗滌液、陰性對照液和陽性對照液。
[0042] 使用本試劑盒的具體操作步驟如下：
[0043] 1)取出試劑盒內(nèi)各組分平衡至室溫；
[0044] 2)將試驗(yàn)需要的板條放置在空板架上；
[0045] 3)反應(yīng)孔中加入50ul尿液樣品、陰性對照、陽性對照和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每次試驗(yàn)設(shè)空 白對照孔，然后除空白孔外，每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液(工作濃度為1: 5000)50ul；
[0046] 4)在微量振蕩器上振蕩30s混勻；
[0047] 5)在37°C 恒溫溫育60min;
[0048] 6)棄去孔中溶液，將稀釋10 X洗滌液至原倍濃度，用原倍洗液液經(jīng)自動(dòng)洗板機(jī)或 者手工洗板5次，在吸水紙上拍干；
[0049] 7)每孔加底物液lOOul，振蕩混勻；
[0050] 8)用化學(xué)發(fā)光儀(北京濱松光子有限公司，BHP9504)測相對發(fā)光值(RLU)，測量時(shí) 間1秒/孔；
[0051 ] 9)分別對校準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)RLU取對數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以各待測尿液RLU值在標(biāo) 準(zhǔn)曲線上查出該尿液的膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-a3fo的濃度，計(jì)算檢測結(jié)果。
[0052]實(shí)施例3、用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒的質(zhì)量檢測試驗(yàn) [0053] 1、試驗(yàn)對象:實(shí)施例1中制備的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒。
[0054] 2、試驗(yàn)方法：
[0055] 按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實(shí)施例1中制備的用于膀胱癌早期診斷的 二聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行鑒定：
[0056] 2.1、相關(guān)系數(shù)計(jì)算:采用辣根過氧化物酶催化魯米諾和過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系， 用化學(xué)發(fā)光儀檢測發(fā)光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R 2;
[0057] 2.2、靈敏度的測定：同時(shí)測定20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，得RLU的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算RLU 平均值與兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的差值，由內(nèi)插法，從工作曲線中得出其對應(yīng)濃度值，計(jì)算靈敏度； [0058] 2.3、精密度的測定:選取高、中、低值3種膀胱癌患者尿液樣本，分為20份，在同一 次分析中同時(shí)檢測每份樣本，每種樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值的比值，為批內(nèi)變異系數(shù);高中 低樣本在批次不同分析中，測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值的比值，為批間變異系數(shù)，計(jì)算批內(nèi) 和批間變異系數(shù)；
[0059] 2.4、回收率的測定:取兩例膀胱癌患者尿液樣本，分別加入等體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 20U/ml和50U/ml，按照實(shí)施例2的方法對每個(gè)濃度做3個(gè)平行檢測。再根據(jù)工作曲線，實(shí)際檢 測該溶液中膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG- a3fo含量，則樣品的測定值減去尿液樣本發(fā)光值，再 除膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-a3fo標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，得到回收率。
[0060] 3、試驗(yàn)結(jié)果：
[0061] 試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0062]表1用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒的質(zhì)量檢測試驗(yàn)
[0064] 本發(fā)明提供的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒是一種靈敏度高，精密度高 的試劑盒，是一種較為理想的用于膀胱癌早期診斷的試劑盒。
[0065] 實(shí)施例4、用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0066] 1、將實(shí)施例1制備的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒在20°C分別放置6個(gè) 月和12個(gè)月后，按照實(shí)施例3中的方法進(jìn)行靈敏度測定，并根據(jù)實(shí)施例1中不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 進(jìn)行測定，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算R2值。
[0067] 2、本實(shí)施例中對比例設(shè)定如下：
[0068] 對比例1:試劑盒的制備方法同實(shí)施例1，區(qū)別僅在于:所述復(fù)合封閉液：1000ml磷 酸緩沖液，其中含〇.3g NaH2P04· 2H2〇和3.2g Na2HP〇4· 12H20,加入8g牛血清白蛋白、2g水 解明膠和lml生物防腐劑，所述封閉液的pH值為8.4;
[0069]對比例2:試劑盒的制備方法同實(shí)施例1，區(qū)別僅在于:所述復(fù)合封閉液：1000ml磷 酸緩沖液，其中含〇.3g NaH2P04· 2H2〇和3.2g Na2HP〇4· 12H20,加入8g酪蛋白、2g水解明膠 和lml生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.6;
[0070]對比例3:試劑盒的制備方法同實(shí)施例1，區(qū)別僅在于:所述復(fù)合封閉液：1000ml磷 酸緩沖液，其中含〇.3g NaH2P04· 2H2〇和3.2g Na2HP〇4· 12H20,加入8g酪蛋白、2g水解明膠 和lml生物防腐劑，所述封閉液的pH值為8.8。
[0071 ]對比例4:試劑盒的制備方法同實(shí)施例1，區(qū)別僅在于：所述底物液由A液和B液組 成，其中，500ml A液為0.913g魯米諾、0.023g 4-羥基聯(lián)苯和6.5g硼酸，pH值為8;500ml B液 為0.159g過氧化脈，pH為6.8。
[0072]對比例5 :試劑盒的制備方法同實(shí)施例1，區(qū)別僅在于：所述底物液由A液和B液組 成，其中，500ml A液為0.913g魯米諾、0.023g 4-羥基聯(lián)苯和6.5g硼酸，pH值為7.5;500ml B 液為0.159g過氧化脈，pH為7。
[0073] 3、試驗(yàn)結(jié)果：
[0074]試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。
[0075]表2用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0077] 另外，本發(fā)明提供的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒在4 °C下保存36個(gè)月 后，試劑盒靈敏度及線性良好，與剛制備的試劑盒無明顯差別。
[0078] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技 術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到 的技術(shù)方案也在本申請保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開 內(nèi)容中具體記載一樣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述二聯(lián)免疫試劑盒組 成如下:標(biāo)準(zhǔn)品溶液、捕獲抗體包被的微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液、底 物液、洗滌液、陰性對照液和陽性對照液。2. 如權(quán)利要求1所述的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn) 品溶液為膀胱癌患者尿液樣本的逐級稀釋液。3. 如權(quán)利要求1所述的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述捕獲 抗體包被的微孔板的制備方法為： 將抗膀胱腫瘤抗原BTA與抗膀胱AG-a^抗體配制成包被緩沖液，將包被緩沖液加入微 孔板中，室溫過夜，接著再加入封閉液，室溫過夜，洗滌，干燥，封板，于4°C保存;所述封閉液 為復(fù)合封閉液：l〇〇〇ml磷酸緩沖液，其中含0.3g NaH2P〇4 · 2H20和3.2g Na2HP〇4 · 12H20,加 入8g酪蛋白、2g水解明膠和lml生物防腐劑，所述封閉液的pH值為8.4。4. 如權(quán)利要求3所述的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述微孔 板為適用于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的檢測為96孔微孔板。5. 如權(quán)利要求1所述的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述辣根 過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液的制備方法為： 采用碳二亞胺偶聯(lián)法，將辣根過氧化物酶加入碳二亞胺中，再加入抗膀胱腫瘤抗原BTA 抗體與抗膀胱AG-aWi抗體，得辣根過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱腫瘤抗原BTA抗體和辣根過氧化 物酶標(biāo)記抗膀胱AG-a^i抗體;將0.5mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱腫瘤抗原BTA抗體和 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗膀胱AG-aWi抗體、0.35m g//L的聚乙二醇200加入17mmol/L PBS緩沖 液，pH值為8.6,即得。6. 如權(quán)利要求1所述的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述底物 液由A液和B液組成，其中，500ml A液為0.913g魯米諾、0.023g4-羥基聯(lián)苯和6.5g硼酸，pH值 為7.5; 500ml B液為0.159g過氧化脈，pH為6.8。7. 如權(quán)利要求1所述的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述洗滌 液為含有2-3%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。8. 如權(quán)利要求1所述的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述陰性 對照液為不含膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG- a3fo的正常人全尿樣本;所述陽性對照液為含有 膀胱癌腫瘤標(biāo)志物膀胱腫瘤抗原BTA與膀胱AG-asfo的膀胱癌患者全尿樣本。9. 一種如權(quán)利要求1-8任一所述的用于膀胱癌早期診斷的二聯(lián)免疫試劑盒的制備方 法，包括以下步驟： S1配制標(biāo)準(zhǔn)品； S2制備捕獲抗體包被的微孔板； S3制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液； S4配制底物液、洗滌液、陰性對照液和陽性對照液； S5分裝上述各組分，組裝，即得。
【文檔編號】G01N33/574GK106093389SQ201610373690
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】陳立國
【申請人】廣州華弘生物科技有限公司