檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙條的制備方法，是通過克隆、表達純化EdiagA864重組蛋白，制備并純化單克隆抗體及兔多克隆抗體，利用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，之后利用膠體金對單克隆抗體進行標記，制備金標墊，組裝試紙條，細粒棘球絳蟲EdiagA864兔多克隆抗體作為檢測線、羊抗鼠抗體作為質(zhì)檢線。具有快捷、便于操作、不需要特殊儀器等特點，檢測結(jié)果清晰，可以較快的進行判斷，適合于臨床現(xiàn)場的快速診斷和牧區(qū)等大規(guī)模流行病學調(diào)查。具有高特異性和敏感性，利用細粒棘球絳蟲EdiagA864單克隆抗體和多克隆抗體夾心的方法，其中單克隆抗體保證了本方法的特異性，多克隆抗體又提高了本方法的敏感性。與傳統(tǒng)的檳榔堿導瀉法相比，保證了檢測人員的安全，避免蟲卵感染。
【專利說明】
檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙及制備方法
技術(shù)領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙，用于犬細粒棘球絳蟲感染的糞便檢測，屬于免疫學技術(shù)領域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]犬細粒棘球絳蟲病是由細粒棘球絳蟲引起的一種對宿主內(nèi)臟造成機械性損傷的人畜共患寄生蟲病。該病呈全球流行，嚴重威脅人畜的健康，并對畜牧業(yè)的發(fā)展造成阻礙。 犬是該病重要的終末宿主，也是該病流行的重要環(huán)節(jié)。目前，細粒棘球絳蟲診斷方法很多， 其中0IE把剖檢法和檳榔堿導瀉法定為犬細粒棘球絳蟲病檢測的“金標準”?？墒恰敖饦藴省?方法有著操作復雜、檢測時間長、檢測條件要求高等諸多缺點，在實踐應用中有諸多不方便之處，因此，不斷有新的檢測技術(shù)出現(xiàn)。
[0003]細粒棘球絳蟲EdiagA864基因是利用抗細粒棘球絳蟲兔高免血清對細粒棘球絳蟲 cDNA文庫進行篩選得到的，與多房棘球絳蟲診斷抗原gp50具有92%同源性，但在核苷酸同源性分析中，并未查找到與其同源的基因，分析可能是一個未知的新基因。經(jīng)原核表達可得到51kDa左右的蛋白條帶，經(jīng)Western blot檢測該蛋白具有良好的反應原性，可作為檢測細粒棘球絳蟲的診斷性抗原。目前，利用EdiagA864制備的單克隆抗體及兔多克隆抗體研制檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金試紙條的方法，還未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種快檢測犬細粒棘球絳蟲感染的膠體金試紙條方法，它具有快速便捷、操作簡單、不需要特殊儀器等特點，適合臨床現(xiàn)場檢測及牧區(qū)大規(guī)模流行病學調(diào)查。
[0005]本發(fā)明還公開了一種檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙的制備方法， 利用膠體金標記的細粒棘球絳蟲EdiagA864單克隆抗體2D12,細粒棘球絳蟲EdiagA864多克隆抗體包被檢測線(T線)，羊抗鼠抗體包被質(zhì)控線(C線)，以上為基礎研制出本發(fā)明的檢測犬細粒棘球絳蟲感染的膠體金免疫層析試紙條。
[0006]本發(fā)明涉及的一種檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙條，主要包括玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙、PVC底板;其特征在于:金標墊上的金標抗體為EdiagA864單克隆抗體2D12,硝酸纖維素膜上的指示線T線包被細粒棘球絳蟲EdiagA864兔多克隆抗體、C線包被羊抗鼠抗體，建立了一種雙抗體夾心膠體金試紙條檢測方法。
[0007]本發(fā)明涉及的一種檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙條的制備方法， 是通過克隆、表達純化EdiagA864重組蛋白，制備并純化單克隆抗體及兔多克隆抗體，利用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，之后利用膠體金對單克隆抗體進行標記，制備金標墊， 組裝試紙條，細粒棘球絳蟲EdiagA864兔多克隆抗體作為檢測線、羊抗鼠抗體作為質(zhì)檢線， 其中:一、EdiagA864重組蛋白的克隆、表達及純化1、AB策囷體插入基因的克隆插入基因片段擴增引物序列由上海生工合成，如下:Forward primer:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'Reverse primer:5 ’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ’2、開放性閱讀框PCR擴增根據(jù)開放性閱讀框基因序列，用Primer5.0軟件進行引物設計，限制性內(nèi)切酶分別為 BamH 1、Hind H1:ORF EdiagA864-F: 5；-GGATCCGGAATTGTCGTCTTCCTTCT-3’ORF EdiagA864-R: 5 ’-AAGCTTACCAATAAGTCTTCTCCAATGC-3’以EdiagA864 PCR擴增產(chǎn)物為模板進行開放性閱讀框的PCR擴增3、EdiagA864克隆載體構(gòu)建將目的片段與PMD-18T載體連接，EdiagA864-18T連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)，對重組質(zhì)粒進行鑒定以及雙酶切鑒定。
[0008]4、EdiagA864表達載體構(gòu)建ORF EdiagA864基因與pET-32a質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)，并進行雙酶切驗證。
[0009]二、EdiagA864單克隆抗體的制備1、動物免疫免疫6-8周齡的雌性Balb/c小鼠。免疫劑量應控制在100-200yL/只，蛋白含量控制在25-100yg/只2、骨髓瘤細胞與脾細胞融合取處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞與脾細胞進行融合。
[0010] 3、陽性雜交瘤細胞株的篩選用建立起的間接ELISA方法進行抗體的檢測，篩選陽性雜交瘤細胞并進行克隆。
[0011] 4、陽性雜交瘤細胞株的染色體分析利用秋水仙素破壞細胞的紡錘絲、低滲處理、吉姆薩染色的方法處理雜交瘤細胞，顯微鏡下觀察雜交瘤細胞染色體的形態(tài)和數(shù)目，單抗2D12染色體數(shù)目為97條。[〇〇12] 5、單克隆細胞亞型鑒定利用抗體亞型鑒定試劑盒，對單克隆抗體進行亞型鑒定。結(jié)果單抗2D12的重鏈亞型均為IgGl，輕鏈亞型均為Kappa。[0〇13] 6、單克隆抗體的大量制備將雜交瘤細胞小鼠腹腔，收集腹水。[〇〇14]三、膠體金試紙條的制備硝酸纖維素膜21mm，樣品墊24mm、金標墊9mm、吸水紙32mm從下到上依次粘貼于PVC底板上，樣品墊壓金標墊2mm，金標墊壓NC膜2mm，吸水紙壓NC膜2mm;依次粘貼好后，用切紙機將組裝的試紙板切成每條寬度為4mm的試紙條，T線包被細粒棘球絳蟲EdiagA864兔多克隆抗體、C線包被羊抗鼠抗體即可。[〇〇15]本發(fā)明的積極效果在于:制備的犬細粒棘球絳蟲感染檢測膠體金試紙條具有快捷、便于操作、不需要特殊儀器等特點，檢測結(jié)果清晰，可以較快的進行判斷，適合于臨床現(xiàn)場的快速診斷和牧區(qū)等大規(guī)模流行病學調(diào)查。具有高特異性和敏感性，利用細粒棘球絳蟲EdiagA864單克隆抗體和多克隆抗體夾心的方法，其中單克隆抗體保證了本方法的特異性，多克隆抗體又提高了本方法的敏感性。與傳統(tǒng)的檳榔堿導瀉法相比，保證了檢測人員的安全，避免蟲卵感染?！靖綀D說明】
[0016]圖1試紙條檢測結(jié)果示意圖；圖2膠體金透射電鏡圖；圖3透射電鏡觀察金標探針；圖4特異性試驗結(jié)果圖；圖5敏感性試驗結(jié)果圖?！揪唧w實施方式】
[0017]下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。
[0018]實施例1犬細粒棘球絳蟲感染檢測膠體金試紙條的制備 (1)膠體金的燒制利用檸檬酸三鈉還原法，向99mL ddH20中加入lmL 1%氯金酸，沸騰后加入lmL 1%檸檬酸三鈉，制備40nm膠體金顆粒。[〇〇19](2)金標抗體最佳pH確定利用K2C〇3梯度標記法，通過觀察顏色變化，確定金標最佳PH。
[0020](3)金標抗體的制備利用摸索好的最佳K2C〇3加入量通過膠體金對單抗進行標記，標記后的金標抗體溶解于復溶液中4°c保存待用或直接滴加于金標墊上。
[0021](4) NC膜上T線多抗包被濃度的確定將T線多抗稀釋成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每個試紙條包被ly L，按照常規(guī)條件進行操作，觀察結(jié)果T線的顯色情況，確定T線多抗的最佳包被濃度。[〇〇22](5) NC膜上C線抗體包被濃度的確定將C線抗體稀釋成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每個試紙條包被ly L，按照常規(guī)條件進行操作，觀察結(jié)果C線的顯色情況，確定C線抗體的最佳包被濃度。[〇〇23]、結(jié)果(1)膠體金的燒制膠體金溶液顏色均勻透明，透射電鏡觀察顆粒大小基本一致，約40nm左右，分散均勻， 沒有聚集，可用于下一步試驗(見圖2)。[〇〇24](2)金標抗體最佳pH確定確定膠體金標記抗體的最適0.2mol/L K2CO3加入量為4yL。
[0025](3)金標抗體的制備通過透射電鏡觀察，金顆粒周圍有一圈蛋白暈，分散性較好，無聚集現(xiàn)象，表明標記成功(見圖3)。
[0026](4)NC膜上T線多抗最佳包被濃度的確定多抗?jié)舛认♂尩絣mg/mL時T線顯色仍較為明顯，故選擇lmg/mL為T線最佳包被濃度。
[0027](5) NC膜上C線抗體最佳包被濃度的確定結(jié)果顯示當抗體濃度稀釋到0.5mg/mL包被時C線顯色最明顯，故選擇0.5mg/mL為C線最佳包被濃度。[〇〇28] 實施例2膠體金免疫層析試紙條性能測試為了測試試紙條的試驗性能，需要進行一系列的試驗，其中包括特異性試驗、敏感性試驗、重復性試驗、保存期試驗。
[0029](1)特異性試驗分別取犬細粒棘球絳蟲參照陽性糞便、犬蛔蟲陽性糞便、犬賈第蟲陽性糞便，健康犬糞便做陰性對照，按照常規(guī)方法進行操作，判斷各種糞便之間有無交叉反應，從而評價試紙條的特異性(見圖4)。
[0030](2)敏感性試驗將犬細粒棘球絳蟲陽性糞便進行倍比稀釋(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)，按常規(guī)操作觀察試紙條顯色情況。當用肉眼無法觀察到T線，并且C線依舊清晰可見時，此時的稀釋度即為該方法的最低檢出濃度(見圖5)。[〇〇31](3)重復性試驗取犬細粒棘球絳蟲陽性糞便及陰性糞便，使用3個不同批次的試紙條按上述方法進行試驗，每個樣品做三次重復，根據(jù)膜片顯色情況，確定該方法的重復性情況。[〇〇32](4)穩(wěn)定性試驗將試紙條分別于4 °C密封保存、37 °C密封保存、室溫密封保存。分別在1個月、2個月、3個月、4個月幾個時間點分別對參照陽性樣品進行檢測，觀察三種環(huán)境各試紙條的顯色情況， 從而判斷試紙條檢測的穩(wěn)定情況。[〇〇33](5 )試紙條檢測陽性糞便符合率試驗應用已經(jīng)建立的膠體金試紙條檢測方法，對10份新疆地區(qū)犬細粒棘球絳蟲參照陽性樣品進行檢測，根據(jù)檢出的陽性樣品數(shù)，評價該方法陽性符合率。
[0034](6)試紙條的初步應用應用所組裝的試紙條對96份犬糞便樣品(其中包括36份新疆地區(qū)犬細粒棘球絳蟲感染參照樣品，60份長春地區(qū)臨床樣品)進行檢測，36份參照樣品檢出率為97.2%(35/36)，60份臨床樣品結(jié)果均為陰性。
[0035]、結(jié)果(1)特異性試驗結(jié)果只有犬細粒棘球絳蟲參照陽性樣品(b) T線顯色，犬賈第蟲(a)、犬蛔蟲陽性糞便 (c)和健康犬糞便(d) T線均無顯色，表明無交叉反應，特異性良好。(見圖3)(2)敏感性試驗結(jié)果1:4倍稀釋時T線仍有顯色，所以該試紙條敏感性為1:4。(見圖4)(3)重復性試驗結(jié)果陰陽性樣品的三次重復效果較好，結(jié)果比較一致，表明試紙條的重復性良好。
[0036] (4)保存期試驗結(jié)果表明4°、37°、室溫存放1個月、2個月、3個月依舊能夠顯示正確結(jié)果，T/C線顯色情況均也無太大區(qū)別，但4°和37°存放4個月時出現(xiàn)金標墊釋放不夠完全，且釋放速度變慢，但仍能指示正確結(jié)果，說明該試紙條至少可以存放四個月以上。
[0037] (5)試紙條檢測陽性糞便符合率試驗應用已經(jīng)建立的膠體金試紙條檢測方法，對10份新疆地區(qū)犬細粒棘球絳蟲參照陽性糞便進行檢測，結(jié)果表明，10份樣本均檢測為陽性，說明該試紙條的陽性符合率為1〇〇%。 [〇〇38] (6)試紙條的初步應用應用所組裝的試紙條對臨床96份犬糞便樣品(其中包括36份新疆地區(qū)犬細粒棘球絳蟲感染參照樣品，60份長春地區(qū)臨床樣品)進行檢測，36份參照樣品檢出35份，檢出率為 97.2%，60份臨床樣品結(jié)果均為陰性。
【主權(quán)項】
1.一種檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙條，主要包括玻璃纖維膜、硝酸 纖維素膜、吸水紙、PVC底板;其特征在于:金標墊上的金標抗體為EdiagA864單克隆抗體2D12 ;硝酸纖維素膜上的指示線T線包被 細粒棘球絳蟲EdiagA864兔多克隆抗體、C線包被羊抗鼠抗體。2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測犬細粒棘球絳蟲感染膠體金免疫層析試紙條的制備方 法，其特征在于:通過克隆、表達純化EdiagA864重組蛋白，制備并純化單克隆抗體及兔多克隆抗體，利 用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，之后利用膠體金對單克隆抗體進行標記，制備金標 墊，并利用抗細粒棘球絳蟲EdiagA864兔多克隆抗體作為檢測線、羊抗鼠抗體作為質(zhì)檢線， 其中:EdiagA864重組蛋白的克隆、表達及純化:.1 )AB策囷體插入基因的克隆插入基因片段擴增引物序列由上海生工合成，如下:Forward primer:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；Reverse primer:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’ ；.2)開放性閱讀框PCR擴增根據(jù)開放性閱讀框基因序列，用Primer5.0軟件進行引物設計，限制性內(nèi)切酶分別為 BamH 1、Hind H1:ORF EdiagA864-F: 5 ’-GGATCCGGAATTGTCGTCTTCCTTCT-3 ’；ORF EdiagA864-R: 5 ’-AAGCTTACCAATAAGTCTTCTCCAATGC-3 ’；以EdiagA864 PCR擴增產(chǎn)物為模板進行開放性閱讀框的PCR擴增3)EdiagA864克隆載體構(gòu)建將目的片段與PMD-18T載體連接，EdiagA864-18T連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)，對重組質(zhì) 粒進行鑒定以及雙酶切鑒定；4)EdiagA864表達載體構(gòu)建ORF EdiagA864基因與pET-32a質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)，并進行雙酶切驗 證；所述的抗細粒棘球絳蟲EdiagA864單克隆抗體的制備:1)動物免疫免疫6-8周齡的雌性Balb/c小鼠；免疫劑量應控制在100-200此/只，蛋白含量控制在25-100yg/只；2)骨髓瘤細胞與脾細胞融合取處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞與脾細胞進行融合；3)陽性雜交瘤細胞株的篩選用建立起的間接ELISA方法進行抗體的檢測，篩選陽性雜交瘤細胞并進行克?。?)陽性雜交瘤細胞株的染色體分析利用秋水仙素破壞細胞的紡錘絲、低滲處理、吉姆薩染色的方法處理雜交瘤細胞，顯微 鏡下觀察雜交瘤細胞染色體的形態(tài)和數(shù)目，單抗2D12染色體數(shù)目為97條；4)單克隆細胞亞型鑒定利用抗體亞型鑒定試劑盒，對單克隆抗體進行亞型鑒定;結(jié)果單抗2D12的重鏈亞型均 為IgGl，輕鏈亞型均為Kappa;5)單克隆抗體的大量制備 將雜交瘤細胞小鼠腹腔，收集腹水；膠體金試紙條的制備:硝酸纖維素膜21mm，樣品墊24mm、金標墊9mm、吸水紙32mm從下到上依次粘貼于PVC底板 上，樣品墊壓金標墊2mm，金標墊壓NC膜2mm，吸水紙壓NC膜2mm;依次粘貼好后，切成每條寬 度為4mm的試紙條，T線包被細粒棘球絳蟲EdiagA864兔多克隆抗體、C線包被羊抗鼠抗體即可。
【文檔編號】G01N33/558GK106093378SQ201610363426
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】宮鵬濤, 張西臣, 高珺珊, 李建華, 張壯志, 楊舉, 李 赫, 李棕松, 楊正濤, 尹繼剛
【申請人】吉林大學