電穿孔轉(zhuǎn)染干擾rna到細(xì)粒棘球絳蟲的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了電穿孔轉(zhuǎn)染干擾RNA到細(xì)粒棘球絳蟲的方法，包括下述步驟：1)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)在含有青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-5天；2)清洗培養(yǎng)后的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，將其加入到RPMI1640培養(yǎng)基中，接著加入電轉(zhuǎn)緩沖液、干擾RNA到電極杯中，利用電轉(zhuǎn)儀對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；3)轉(zhuǎn)染好的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)靜置后轉(zhuǎn)移至含有RPMI1640培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，在孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。上述方法進(jìn)一步還包括通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)GRP78mRNA表達(dá)水平,Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)GRP78蛋白表達(dá)水平，鑒定轉(zhuǎn)染效果。觀察結(jié)果顯示，本發(fā)明利用電穿孔方法成功實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)染干擾RNA到細(xì)粒棘球絳蟲。
【專利說明】電穿孔轉(zhuǎn)染干擾RNA到細(xì)粒棘球絳蟲的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了使用電穿孔將干擾RNA轉(zhuǎn)染到細(xì)粒棘球絳蟲的方法，屬于生物實(shí)驗(yàn)

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]棘球蝴?。╡chinococcosis)俗稱包蟲?。╤ydatiddisease)，是棘球蝴絳蟲的中 絳期幼蟲寄生于人及其他一些動(dòng)物體內(nèi)所引起的一種嚴(yán)重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展的 人畜共患寄生蟲病。棘球絳蟲的種類較多，目前在我國主要有細(xì)粒棘球蚴?。倚桶x病 cysticechinococcosis，CE)和多房棘球蝴病（泡型包蟲病alveolarechinococcosis， AE)兩種，其分別由細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcusgranulosus,E.g)和多房棘球絳蟲 (Echinococcusmultilocularis，E.m)寄生于人及某些動(dòng)物體內(nèi)所致。細(xì)粒棘球蝴病呈全 球性分布，在我國主要流行于新疆、青海、內(nèi)蒙古、西藏等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的省區(qū)。
[0003] 細(xì)粒棘球蚴可寄生于人體任何部位，其中肝臟最為常見（50-70% )，其次為肺臟 (占20%?30% )，在脾，腎，骨，腦及其他器官中較少見到。目前，對(duì)于肝細(xì)粒棘球蚴病的 治療，仍然以外科手術(shù)為主，藥物治療為輔。對(duì)于手術(shù)治療方式而言，一個(gè)嚴(yán)重的缺陷是內(nèi) 囊摘除過程中易引起內(nèi)囊里的原頭節(jié)外溢，復(fù)發(fā)率較高。即使近些年出現(xiàn)的肝包蟲外膜內(nèi) 外囊完整摘除術(shù)可完整摘除肝包蟲外囊，降低包蟲病的復(fù)發(fā)率，但是當(dāng)包蟲囊腫體積較大 或緊貼重要臟器或管道（肝門或膽管）時(shí)，則需要選擇開放式外膜內(nèi)完整摘除術(shù)。此種術(shù) 式有兩種情況：一是開放式外膜內(nèi)外囊完全切除術(shù)，二是開放式外膜內(nèi)外囊次全切除術(shù)，這 兩種情況都可能有頭節(jié)的外漏和殘留，增加術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此本領(lǐng)域近年來已經(jīng)開始 嘗試使用藥物制劑來降低復(fù)發(fā)率。
[0004] 迄今為止，國內(nèi)外已經(jīng)在體外、動(dòng)物及臨床上對(duì)95%乙醇，高滲鹽水，5%的福爾馬 林，硝酸銀及阿苯達(dá)唑等藥物及其聯(lián)合作用效果方面進(jìn)行了廣泛的研究，它們雖然可以起 到一定的療效，但都不盡理想且副作用較大：95%的乙醇可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的肝膽并發(fā) 癥，20%的高滲鹽水會(huì)使病人出現(xiàn)嚴(yán)重的肝膽并發(fā)癥，10%H202會(huì)致使機(jī)體出現(xiàn)空氣栓賽 甚至?xí)l(fā)生過敏性休克，福爾馬林使用后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的肝膽并發(fā)癥，20%的硝酸銀可致使 病人出現(xiàn)術(shù)中休克，心血管功能衰竭，腎功能衰竭，肝功能不全等副作用，術(shù)后發(fā)生呼吸困 難，紫紺，低血壓等一系列副作用，阿苯達(dá)唑（ABZ)臨床上病人使用后，肝酶水平會(huì)因此而 上升，高濃度酸性和堿性溶液盡管能有效殺滅，但是無法在人體內(nèi)應(yīng)用，而低濃度的酸性和 堿性溶液殺滅效果不理想。
[0005] 最近幾年來，本領(lǐng)域技術(shù)人員嘗試將分子生物學(xué)的治療方案應(yīng)用于包蟲病的治 療，這種方案集中體現(xiàn)在利用RNA干擾技術(shù)抑制與細(xì)粒棘球蚴生長密切相關(guān)的基因到蛋白 的表達(dá)，從而使得靶基因沉默，殺滅細(xì)粒棘球蚴。針對(duì)細(xì)粒棘球蚴而言，如何將小分子的干 擾RNA進(jìn)入到目標(biāo)體內(nèi)是本領(lǐng)域面臨的一項(xiàng)技術(shù)難題，常見方法例如浸泡法效果并不理 想，轉(zhuǎn)染方法，例如病毒介導(dǎo)法，腺病毒，陽離子脂質(zhì)體法等，研發(fā)發(fā)現(xiàn)通過脂質(zhì)體法和腺病 病毒法轉(zhuǎn)染細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，未達(dá)到干擾RNA沉默原頭節(jié)靶基因的目的，因此本領(lǐng)域目 前迫切需要一種操作簡單、條件明確、能有效實(shí)現(xiàn)干擾RNA功能的轉(zhuǎn)染方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 申請(qǐng)人:多年來致力于棘球蚴病的治療研究，尤其是致力于研究細(xì)粒棘球蚴病在 細(xì)胞和基因?qū)用娴闹虏C(jī)理，發(fā)現(xiàn)在細(xì)粒棘球蚴病中細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)存在GRP78蛋白 (分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78，glucose-regulatedprotein78/bindingimmunoglobulin protein，GRP78)的高表達(dá)，從而確定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與細(xì)粒棘球蚴發(fā)病。在該研究過程 中， 申請(qǐng)人:通過創(chuàng)造性的努力發(fā)明了一種利用電穿孔成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染干擾RNA到細(xì)粒棘球絳 蟲的方法，利用該方法轉(zhuǎn)染干擾RNA能夠成功的實(shí)現(xiàn)靶基因的沉默，從而抑制和殺滅細(xì)粒 棘球蚴原頭節(jié)的生長，從而有效治療細(xì)粒棘球蚴病。
[0007] 基于上述，本發(fā)明公開了一種電穿孔轉(zhuǎn)染干擾RNA到細(xì)粒棘球絳蟲的方法，包括 下述步驟：1)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)在含有青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-5 天；2)清洗培養(yǎng)后的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，將其加入到RPMI1640培養(yǎng)基中，接著加入電轉(zhuǎn)緩 沖液、干擾RNA到電極杯中，利用電轉(zhuǎn)儀對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；3)轉(zhuǎn)染好的細(xì)粒棘 球蚴原頭節(jié)靜置后轉(zhuǎn)移至含有RPMI1640培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，在孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0008] 為了準(zhǔn)確了解轉(zhuǎn)染效果，上述方法還包括：4)通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)粒棘球蚴 原頭節(jié)內(nèi)GRP78mRNA表達(dá)水平，Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)GRP78蛋白 表達(dá)水平，鑒定轉(zhuǎn)染效果。
[0009] 其中，RPMI1640培養(yǎng)基是本領(lǐng)域所公知的，其含有10%的牛血清，其配置方法為 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，此處不再贅述。
[0010] 其中，在步驟1)中，青霉素和鏈霉素的含量為100U/mL，培養(yǎng)條件為37°C、5%C02 恒溫培養(yǎng)。
[0011] 在上述條件下，根據(jù)細(xì)粒棘球蚴的培養(yǎng)特性，優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間為3-4天。
[0012] 其中，在步驟2)中，干擾尺嫩的濃度為311111〇1/1-811111〇1/1，轉(zhuǎn)染時(shí)間為0.5-7211。 為了提高轉(zhuǎn)染的成功率，在轉(zhuǎn)染前對(duì)細(xì)粒棘球蚴進(jìn)行清洗，清洗方法為細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié) 用磷酸鹽緩沖液清洗，再用無菌的DEPC處理水清洗。
[0013] 為了保證清洗效果，優(yōu)選采用多次清洗。
[0014] 其中，步驟2)所用電轉(zhuǎn)緩沖液可參考市場上已有的電轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行配置，優(yōu)選 的，所述電轉(zhuǎn)緩沖液是如下兩種電轉(zhuǎn)緩沖液的混合物：電轉(zhuǎn)緩沖液I為加入三磷酸腺苷二 鈉鹽2g，六水氯化鎂1.2g，然后注入雙蒸水使溶液達(dá)到10ml，過濾除菌；電轉(zhuǎn)緩沖液II為 加入磷酸二氫鉀6g，碳酸氫鈉0. 2g，葡萄糖0. 2g，然后調(diào)節(jié)pH到7. 4,接著注入雙蒸水使溶 液達(dá)到500ml，過濾除菌。
[0015] 上述兩種成分的用量可以進(jìn)行合理調(diào)整，優(yōu)選為電轉(zhuǎn)緩沖液I與電轉(zhuǎn)緩沖液II的 用量比為80ul:4ml。
[0016] 申請(qǐng)人:在研發(fā)過程中，對(duì)轉(zhuǎn)染的時(shí)間、溫度、順序等各種條件進(jìn)行了大量摸索，發(fā) 現(xiàn)使用下列儀器及其設(shè)置是最有效的：采用Amaxa2型電轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)染參數(shù)為D023或U033程 序。
[0017] 上述的電轉(zhuǎn)儀為Lonza生產(chǎn)，在國內(nèi)外廣泛使用，其程序設(shè)定可參考機(jī)器操作手 nn ) \)i〇
[0018]其中，在步驟3)中，培養(yǎng)條件與步驟1)類似，也為37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)。
[0019] 本發(fā)明的方法可以適用于各種干擾RNA序列到細(xì)粒棘球蚴的轉(zhuǎn)染，尤其是所轉(zhuǎn)染 的干擾RNA靶向細(xì)粒棘球絳蟲的GRP78基因，序列為（siRNA的靶序列）

【權(quán)利要求】
1. 電穿孔轉(zhuǎn)染干擾RNA到細(xì)粒棘球絳蟲的方法，包括下述步驟：1)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié) 在含有青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-5天；2)清洗培養(yǎng)后的細(xì)粒棘球蚴原 頭節(jié)，將其加入到RPMI 1640培養(yǎng)基中，接著加入電轉(zhuǎn)緩沖液、干擾RNA到電極杯中，利用 電轉(zhuǎn)儀對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；3)轉(zhuǎn)染好的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)靜置后轉(zhuǎn)移至含有 RPMI 1640培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，在孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于還包括下述步驟：4)通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后 細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)GRP78mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi) GRP78蛋白表達(dá)水平，鑒定轉(zhuǎn)染效果。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在步驟1)中，青霉素和鏈霉素的含量為100U/ mL，培養(yǎng)條件為37°C、5% C02恒溫培養(yǎng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在步驟2)中，干擾RNA的濃度為3 y mol/ L-8iimol/L，轉(zhuǎn)染時(shí)間為 0. 5-72h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在步驟2)中，清洗方法為細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)用 磷酸鹽緩沖液清洗，再用無菌的DEPC處理水清洗。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在步驟2)中，電轉(zhuǎn)緩沖液是如下兩種電轉(zhuǎn)緩沖 液的混合物：電轉(zhuǎn)緩沖液I為加入三磷酸腺苷二鈉鹽2g，六水氯化鎂1. 2g，然后注入雙蒸水 使溶液達(dá)到l〇ml，過濾除菌；電轉(zhuǎn)緩沖液II為加入磷酸二氫鉀6g，碳酸氫鈉0. 2g，葡萄糖 0. 2g，然后調(diào)節(jié)pH到7. 4,接著注入雙蒸水使溶液達(dá)到500ml，過濾除菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于電轉(zhuǎn)緩沖液I與電轉(zhuǎn)緩沖液II的用量比為 80ul ：4ml〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在步驟2)中，采用Amaxa 2型電轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)染參數(shù) 為D023或U033程序。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在步驟3)中，培養(yǎng)條件為37°C，5% C02恒溫培 養(yǎng)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所轉(zhuǎn)染的干擾RNA靶向細(xì)粒棘球絳 蟲的 GRP78 基因，其靶序列為 GGITTCGGCTATGGITCTT，或 GGACATTACAAAGGATGT，或 CCTCGTGGTTTACCTCAAA。
【文檔編號(hào)】A01K67/033GK104342456SQ201410571966
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】姜玉峰, 呂海龍, 李思源 申請(qǐng)人:姜玉峰