專利名稱：一種快速診斷膀胱癌的fn試紙及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試紙，具體地說關(guān)于一種快速診斷膀胱癌的FN試紙 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前膀胱癌的診斷，尤其是治療后復(fù)發(fā)的監(jiān)測，主要以尿脫落細(xì)胞檢 查和膀胱鏡活檢為主，但尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查受影響因素多，陽性率較低； 膀胱鏡雖然是最可靠的診斷方法，但屬于侵入性操作，有一定的創(chuàng)傷和并 發(fā)癥，不易被病人接受和堅(jiān)持。尿纖維連接蛋白(Fibronectin， FN)是 一種廣為研究的新的膀胱癌腫瘤標(biāo)記物。研究表明尿液FN作為浸潤性膀 胱癌的診斷指標(biāo)，診斷的靈敏度為76. 47%~100%,特異度為87. 22%,診 斷正確率為86. 96°/。。目前，尿FN的臨床4企測主要采用ELISA方法4金測。 采用的ELISA試劑盒為不同廠家生產(chǎn)，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。步驟比4交繁瑣，結(jié) 果易受操作者技術(shù)水平等的影響，不確定因素較多。ELISA方法需要操作 者具備一定的分子生物學(xué)技能，不易在基層醫(yī)院開展。ELISA方法檢測不 但要求操作者具有一定的操作技能，還必須應(yīng)用酶標(biāo)儀等特殊儀器，因此 病人無法在家中對自己的病情進(jìn)行監(jiān)測。
中國專利申請?zhí)?00610014168. 3，公開了檢測雌二醇的膠體金免疫試紙及其制備方法；中國專利申請?zhí)?00610165370. 6， 7>開了一種檢測肺炎 球菌的免疫層析試紙及其制備方法；中國專利申請?zhí)?00510109165. 3公開 了用于奶牛早期妊娠診斷的試紙及其檢測方法。但是，關(guān)于一種快速診斷 膀胱癌的FN試紙及其應(yīng)用方面未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于
(1 )提供一種快速診斷膀胱癌的FN試紙； (2 )提供一種快速診斷膀胱癌FN試紙的應(yīng)用。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種快速診斷膀胱癌的FN試紙，包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸 纖維膜層、吸水紙層，所述的底板上依次覆蓋樣品墊、金膠墊、硝酸纖維 膜層、吸水紙層，所述的金膠墊中含有膠體金與抗尿纖維連接蛋白抗體結(jié) 合的金標(biāo)抗體復(fù)合物。
所述的金標(biāo)抗體復(fù)合物是由下列方法制備得到的 (a )待標(biāo)記蛋白溶液的制備； (b )待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備；
(c) 確定膠體金與標(biāo)記蛋白用量比；
(d) 膠體金與抗尿纖維連接蛋白抗體的結(jié)合； (e )膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物的純化。
所述的步驟(d)中將膠體金溶液以0.05 mol/l-0. 3 mo1/1〖2(]03調(diào) pH至7. 5-10. 0,加入抗尿纖維連接蛋白抗體溶液中。所述的步驟(d)中膠體金與抗尿纖維連接蛋白抗體混勻，反應(yīng)后加 入穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑是5 %胎牛血清和1%聚乙二醇。
所述的步驟(e )中膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物在900rpm/min離心15min， 仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含5 %的蔗糖和0. 05訂ween-20的0. 002M硼酸 鹽緩沖溶液復(fù)溶。
所述的硝酸纖維膜層標(biāo)記有測試線和質(zhì)控線，所述的測試線是牛血清 白蛋白偶聯(lián)物，所述的質(zhì)控線是抗鼠的二抗。
一種快速診斷膀胱癌的FN試紙?jiān)诎螂装┘膊『Y查藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明所公開一種快速診斷膀胱癌的FN試紙及其應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn) 在檢測尿中尿纖維連接蛋白，具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性 好、操作簡便、無需任何儀器設(shè)備的特點(diǎn)，結(jié)果判斷直觀可靠、易于掌握。 為膀胱癌的大規(guī)模人群篩查、膀胱癌術(shù)后病人的自我檢測提供方便、可靠、 無創(chuàng)、價(jià)廉的方法。減少膀胱癌術(shù)后病人有創(chuàng)性檢查方法，例如膀胱4竟才企 查的次數(shù)。有助于浸潤性膀胱癌的診斷。有助于判斷和預(yù)測淺表非浸潤性 膀胱癌向浸潤性膀胱癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)膀胱癌的治療。


圖1: 一種快速診斷膀胱癌的FN試紙結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2A:待測標(biāo)本陽性結(jié)果示意圖。 圖2B:待測標(biāo)本陰性結(jié)果示意圖。 圖2C:待測標(biāo)本無效結(jié)果示意圖。
圖3: —種快速診斷膀胱癌的FN試紙檢測過程的示意圖。其中垂直箭頭方向?yàn)槟驑拥稳敕较?，水平箭頭方向?yàn)閷游龇较颉?
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1 制^^標(biāo)抗體復(fù)合物
一、 膠體金制備
將100ml0.005。/。-0.02。/。的氯金酸溶^口入圓底燒瓶中加熱至沸騰，沸 騰后在劇烈攪拌下迅速準(zhǔn)確地加入新鮮配制的0. 4%-2%的^寧檬酸三鈉 (Na3C6H507 ' 2H20 )水溶液1-2. 2ml，煮沸10-25分鐘后，繼續(xù)攪拌冷卻至 室溫。此過程中可以看到溶液的顏色變化是金黃色—黑色—紫色—深藍(lán) —鮮紅色，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯孽r紅色時(shí)，即制得所需的膠體金。 冷卻后裝入透析袋中對超純水(l: 5000)透析三次，最后將透析好的膠體 金轉(zhuǎn)移到干凈的帶旋蓋的玻璃瓶中，在4。C避光的環(huán)境下保存。(膠體金 HAuCl4國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，檸檬酸三鈉上海青析化工有限7> 司)。
二、 金膠體與蛋白的連接
1、 膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或 偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋 白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。
2、 待標(biāo)記蛋白溶液的制備將待標(biāo)記蛋白預(yù)先在0. 003 mol/1-O. 01 mo1/1 pH5. 5-7. 8 NaCl溶液中4'C透析過夜，以除去多余的鹽離子。然后 100000轉(zhuǎn)4。C離心lh，去除聚合物。3、 待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備以0.05 mol/1-0. 3 mol/1 1(2(:03調(diào)膠體 金液的pH值為7. 5-10. 0。由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此， 在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測定為宜。
4、 膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將 膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管lml。將標(biāo)記蛋白以0. 005mol/l pH9. 0 硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5Pg/ml ~ 5(mg/ml,分別取1ml，加入上列金膠 溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。5min后，在上述各管中加入0. 1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。對照管(未加蛋白質(zhì))和加 入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象； 而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。穩(wěn)定1ml膠 體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為標(biāo)記該蛋白質(zhì)的最低用量，在 實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加10% ~20%。
5、 膠體金與抗FN單抗(IgG )的結(jié)合將膠體金溶液以0. 05 mol/1-0. 3 mol/1 1(2(:03調(diào)pH至7. 5-10. 0，加入透析好的抗FN單抗IgG溶液，旋渦混 合器混勻，反應(yīng)10min后，加入穩(wěn)定劑以防止膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用 穩(wěn)定劑是5 %胎牛血清(BSA )和1 %聚乙二醇(分子量20KD )。加入的量 5 % BSA使溶液終濃度為1 % ; 1 %聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/10。
6、 膠體金標(biāo)記蛋白的純化制備好的膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物在 900rpm/min離心15min，仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含5 %的蔗糖和0. 05% Tween-20的0. 002M硼酸鹽緩沖溶液復(fù)溶。離心洗滌兩次，最后將復(fù)合物 濃縮至原體積的1/10, 4"C保存。(二抗ROCKLAND-INC 7>司；抗原SIGMA 公司；單抗SIGMA公司。多抗Biovison公司；NC膜Whatman公司。儀器臺式離心機(jī)型號1GE16G上海安亭科學(xué)儀器廠制造) 實(shí)施例2 制備快速診斷膀胱癌的FN試紙 請參照圖1。
圖1為一種快速診斷膀胱癌的FN試紙，該FN試紙?jiān)O(shè)有底板1,底板 l上依次覆蓋樣品墊2、金膠墊3、硝酸纖維膜層4、吸水紙層5。所述底 板1是PVC底板，樣品墊2的材料是吸尿玻璃纖維。金膠墊3的制作將 實(shí)施例1所制備得到的金標(biāo)抗體溶液噴點(diǎn)在lcm寬的玻璃纖維膜上，點(diǎn)樣 量約為2ul/cm， 37。C干燥。硝酸纖維膜層4的制作將二抗噴點(diǎn)在硝酸 纖維膜(NC膜)上，作為質(zhì)控線(C線)，將抗FN多克隆抗體噴點(diǎn)在距離 質(zhì)控線lcm處作為測試線(T線)。點(diǎn)樣量約為lul/cm， 37。C干燥。將上 述的樣品墊2、金膠墊3、硝酸纖維膜層4、吸水紙層5依次組裝在底板 上，切成4mm寬的試紙條，裝入沖企測卡中。
實(shí)施例3
快速診斷膀胱癌的FN試紙的檢測
一、 試紙檢測方法
1、 取50ul的待測樣本加在試紙條的加樣區(qū)；
2、 在10min后記觀察記錄檢測結(jié)果。20min后觀察的結(jié)果無效。
二、 檢測結(jié)果的判斷
1、 陽性結(jié)果在試紙條的測試線和質(zhì)控線位置上各出現(xiàn)一條紫紅 色條帶。(見圖2A)
2、 陰性結(jié)果僅在試紙條的質(zhì)控線上出現(xiàn)一條紫紅色條帶。(見圖2B)3、無效結(jié)果在試紙條的質(zhì)控線上未出現(xiàn)紫紅色條帶。(見圖2C) 三、；險(xiǎn)測原理
見圖3，幾滴尿樣滴在樣品墊上，因?qū)游鲎饔茫后w向吸水紙層方向 流動(dòng)，當(dāng)流經(jīng)金膠墊時(shí)，金標(biāo)抗體便會(huì)^皮溶解，并與尿液中的FN結(jié)合， 形成金標(biāo)復(fù)合物，隨液體繼續(xù)前移，在流經(jīng)T線(檢測線)時(shí)，復(fù)合物與 T線上的抗FN多克隆抗體結(jié)合而凝聚顯色，流經(jīng)C線(質(zhì)控線)時(shí)，復(fù) 合物與二抗結(jié)合而凝聚顯色，如C線不顯色則表明檢測無效，若T線顯色 則表明病人尿樣中FN含量超標(biāo)，有患有膀胱癌的可能，若T線不顯色則 表明病人尿中FN含量正常。
權(quán)利要求
1、一種快速診斷膀胱癌的FN試紙，包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層、吸水紙層，其特征在于所述的底板上依次覆蓋樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層、吸水紙層，所述的金膠墊中含有膠體金與抗尿纖維連接蛋白抗體結(jié)合的金標(biāo)抗體復(fù)合物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的FN試紙，其特征在于所述的金標(biāo)抗體復(fù)合 物是由下列方法制備得到的(a) 待標(biāo)記蛋白溶液的制備；(b) 待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備；(c) 確定膠體金與標(biāo)記蛋白用量比；(d) 膠體金與抗尿纖維連接蛋白抗體的結(jié)合；(e) 膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物的純化。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的FN試紙，其特征在于步驟(d)中將膠體金 溶液以0. 05 molA-O. 3mo1/1 LC03調(diào)pH至7. 5-10. 0,加入抗尿纖維連接蛋 白抗體溶液中。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的FN試紙，其特征在于步驟(d)中膠體金與 抗尿纖維連接蛋白抗體混勻，反應(yīng)后加入穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑是5%胎牛血 清和1%聚乙二醇。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的FN試紙，其特征在于步驟(e)中膠體金標(biāo) 記抗體復(fù)合物在900rpm/min離心15min，爿f子細(xì)吸出上清，沉淀物用含5%的 蔗糖和0. 05%Tween-20的0. 002M硼酸鹽緩沖溶液復(fù)溶。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的FN試紙，其特征在于所述的硝酸纖維膜層 標(biāo)記有測試線和質(zhì)控線，所述的測試線是牛血清白蛋白偶聯(lián)物，所述的質(zhì)控 線是抗鼠的二抗。
7、根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的FN試紙?jiān)诎螂装┘膊『Y查藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速診斷膀胱癌的FN試紙，它包括底板、樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層、吸水紙層，所述的底板上依次覆蓋樣品墊、金膠墊、硝酸纖維膜層、吸水紙層，所述的金膠墊中含有膠體金與抗尿纖維連接蛋白抗體結(jié)合的金標(biāo)抗體復(fù)合物。本發(fā)明還公開了一種快速診斷膀胱癌FN試紙的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于FN試紙檢測尿中尿纖維連接蛋白，具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡便、無需任何儀器設(shè)備的特點(diǎn)，結(jié)果判斷直觀可靠、易于掌握，適用于對膀胱癌疾病的診斷及病情的自我監(jiān)測。
文檔編號G01N33/574GK101634655SQ20081004082
公開日2010年1月27日 申請日期2008年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日
發(fā)明者周海清, 張敏光, 沈周俊, 沈鶴柏 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院;上海師范大學(xué)