專利名稱:一種早期診斷膀胱癌的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種膀胱癌患者尿液中的腫瘤標志物的檢測方法,該方法通過定量檢測存在于尿液中異常糖基化的整合素AG-α 3β I含量,無創(chuàng)性地實現(xiàn)膀胱癌的早期診斷。
背景技術(shù):
膀胱癌為泌尿系最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率在美國被列為男性惡性腫瘤的第四位,女性為第八位,居惡性腫瘤的第七位。在我國發(fā)病率泌尿系腫瘤第一位。膀胱癌約95%來源于膀胱上皮,絕大多數(shù)為惡性,只有少數(shù)為良性,包括乳頭狀瘤、移行細胞癌、鱗狀細胞癌和腺癌。其中以移行細胞癌最常見,占80%以上。目前手術(shù)治療、放療和化療的療效并不令人滿意,患者5年存活率在40% -60%。預后較差和極易復發(fā)是膀胱癌的最大特點,有效的治療很大程度上依賴于對膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療。然而,膀胱癌發(fā)病隱匿,大部分 患者都是因為肉眼或鏡下血尿懷疑膀胱癌才會到醫(yī)院就診,而出現(xiàn)肉眼血尿往往已是癌癥晚期。所以尋找特異的膀胱癌早期診斷方法具有重要的臨床應用價值。目前,膀胱癌的早期診斷方法有以下幾種I)尿液分析血尿出現(xiàn)后首先便是進行尿液分析,以便排除是否是由于尿路炎癥引起,并不能確定患者是否患膀胱癌;2)尿脫落細胞分析對尿沉渣中的尿脫落細胞進行顯微鏡下觀察,可以鑒別并區(qū)分惡化的腫瘤細胞和正常細胞。但靈敏度不高,且差異較大,早期膀胱癌容易漏檢;3)超聲、CT或者MRI成像觀察對腫瘤的大小和惡化程度可以直接進行圖像觀察,準確度較前面方法大大提高。盡管近年來成像技術(shù)的不斷進步,靈敏度不斷提高,但對較小的腫瘤觀察仍然不夠,易漏檢;4)膀胱鏡觀察膀胱鏡通過尿路進入膀胱,進行可視化的觀察,從而發(fā)現(xiàn)早期的腫瘤并取活檢。但該方法是一種有創(chuàng)性檢查,不能用于膀胱癌早期篩查環(huán)節(jié)。目前早期診斷膀胱癌細胞特異性最高的是通過膀胱鏡的觀察,熒光膀胱鏡的應用提高了檢測靈敏度。但患者一般需要經(jīng)常性的跟蹤觀察,從而能及早發(fā)現(xiàn)腫瘤,或者跟蹤治療中的療效及復發(fā)狀況的觀察。然而,膀胱鏡觀察會對患者造成身體不適。另外,目前熒光膀胱鏡檢測所需熒光染料特異性不高,且對人體有一定的負面影響。因此,在膀胱癌的早期診斷方面,人們一直在探索更特異和更靈敏的檢測方法,盡可能的利用特異的腫瘤標志物實現(xiàn)方便、快速的檢測。實現(xiàn)尿液中膀胱癌標志物或者細胞的檢測,進行實時檢測在臨床診斷方面具有重要的應用價值。目前商業(yè)化的可用的膀胱癌的標志物有人補體因子H相關(guān)蛋白(膀胱腫瘤抗原,BTA試劑盒)、高分子量的癌胚抗原和兩個膀胱癌細胞相關(guān)的粘附分子(美國ScimedxCorp公司的Immunocyt試劑盒)、核基質(zhì)蛋白22 (ΝΜΡ22)、3、7和17號染色體的異倍體以及Ρ16腫瘤抑制因子9ρ21位點的缺失(UroVysion試劑盒)。BTA是指人補充因子H相關(guān)蛋白,BTA檢測需要專業(yè)操作人員在標準實驗室進行。靈敏度達到57-83%,特異性60-92%,血尿患者的特異性只能達到46%,另外良性前列腺增生、腎結(jié)石以及尿路感染等情況均影響B(tài)TA檢測的特異性;Immunocyt試劑盒通過免疫熒光檢測尿脫落細胞,盡管靈敏度以及特異性很高,但為了達到較高的準確性需要進行大量的尿脫落細胞檢測,因此在膀胱癌患者的治療以及預后觀測方面具有很高的應用價值,但應用在早期診斷方面差強人意;其中NMP22是目前應用最廣的膀胱癌標志物,ELISA試劑盒的市場化實現(xiàn)了膀胱癌早期診斷的方便、快捷檢測,檢測靈敏度和特異性也很高,但是在有病毒感染、腎/膀胱結(jié)石等情況下,仍會出現(xiàn)假陽性;Ur0Vysi0n試劑盒采用的是多靶標的熒光原位雜交(FISH)技術(shù),盡管靈敏度與特異性得到極大提高,美國FDA批準,但與Immunocyt試劑盒類似,需要進行大量的尿脫落細胞檢測。結(jié)合目前的膀胱癌標志物的應用以及膀胱癌的診斷現(xiàn)狀,我們得出一方面,新的特異的膀胱癌仍是研究的重點;制備早期診斷試劑盒,實現(xiàn)快速、高通量檢測,在膀胱癌的早期篩查及預后方面具有重要的臨床價值。 因此,選用高特異性、高靈敏性且無創(chuàng)傷性的檢測方法對膀胱癌的早診、早治有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明人之前的研究(參見中國專利申請?zhí)?01010251384. 6),發(fā)現(xiàn)了一種人膀胱癌腫瘤標志物AG- α 3 β 1,其為異常糖基化的整合素α 3 β 1,其特征在于帶有作為抗原表位的糖結(jié)構(gòu)[30S03]Galbl-4(Fucal-3) [60S03]GlcNAc。在上述中國專利申請?zhí)?01010251384. 6中,公開了所述整合素α3β1的α 3亞單位的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示,所述整合素α 3β I的β I亞單位的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示,優(yōu)選所述異常糖基化是處在α 3亞單位的第740位的氨基酸T (蘇氨酸)上。在中國專利申請?zhí)?01010251384. 6中,本發(fā)明人通過以人膀胱癌細胞系T24(ATCC HTB-4)免疫Balb/C小鼠(商購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),將致敏的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合,用ELISA方法篩選出針對人膀胱癌腫瘤標志物AG- α 3 β I的一株雜交瘤細胞株,該雜交瘤細胞株于2010年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC,中國,北京),保藏號為CGMCC No. 3845。通過同樣的方法,本發(fā)明人還獲得了單抗BCMab3,其為特異性識別人膀胱癌腫瘤標志物AG_a3i3 I蛋白C端的單克隆抗體,分泌單抗的雜交瘤細胞株于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC,中國,北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,100101),保藏號為CGMCC No. 6907。(一)本發(fā)明解決的技術(shù)問題本發(fā)明著眼于膀胱癌的早期診斷與膀胱癌患者的跟蹤觀察,擬解決現(xiàn)行的膀胱癌早期診斷方面的難題,即采用特異性識別膀胱癌腫瘤標志物AG-a 3β I的兩株單克隆抗體,利用雙抗體夾心法實現(xiàn)對AG-a 3β I的識別與捕獲,結(jié)合高靈敏的化學發(fā)光免疫分析方法,提供了一種高靈敏、高特異、操作簡便、價格適宜的定量檢測AG_a3i3 1的化學發(fā)光免疫試劑盒。該試劑盒不需要昂貴的檢測儀器,便于臨床推廣,具有良好的市場應用價值,將會彌補市場現(xiàn)有試劑盒的不足。本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測AG- a 3 β I化學發(fā)光免疫分析試劑盒,很好的解決了檢測靈敏度和特異性低而影響膀胱癌早期診斷的問題。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。(二)技術(shù)方案1.本發(fā)明試劑盒組分本發(fā)明定量檢測AG-α 3β I化學發(fā)光免疫分析試劑盒,其組分包括如下Α.標準品。其是化學發(fā)光值很高的膀胱癌患者尿液樣本的逐級稀釋物。凍存?zhèn)溆谩.捕獲抗體BCMab3包被的微孔板。BCMab3為單克隆抗體,能特異地識別尿液中的AG- α 3 β I,將該抗體包被在微孔板上,用于特異性捕獲尿液中的AG- α 3 β I。C.用于檢測的標記抗體。該抗體為酶標記的針對AG-α 3β I的單克隆抗體 BCMabl,能特異地識別尿液中的AG-a 3β I。此單抗可用堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶偶聯(lián)形成酶聯(lián)單抗結(jié)合物。用其識別樣品中的AG-α 3β 1,釋放信號。其釋放信號能被轉(zhuǎn)換成為Α6_α3β1的濃度,用于定量分析。D.配置堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶所作用的化學發(fā)光底物液。Ε.1OX濃縮洗滌液。本發(fā)明所述試劑盒為了便于用戶使用,配制了濃縮洗滌液。使用時,用去離子水稀釋10倍至Ix使用。該濃縮洗液為含有2% Tween-20的磷酸鹽緩沖洗滌液。F.陰性對照,為正常男性尿液,不含有AG-a 3 β I。G.陽性對照,為膀胱癌患者尿液,含有一定量的AG- a 3 β I。2.本發(fā)明試劑盒的制備方法制備上述定量檢測AG- a 3 β I化學發(fā)光免疫分析試劑盒的方法包括以下步驟I)配制標準品。選取化學發(fā)光值很高的膀胱癌患者尿液樣本,逐級稀釋,凍存?zhèn)溆?,用作制備定量分析的標準曲線。本方法中將化學發(fā)光值為6685的樣本(即本方法選取的Cut off值)中包含AG-a 3β I的量定義為lU/mL。標準品的濃度梯度為0、1、2、4、8、16、32、64、128U/mL,用其標準曲線計算出樣本中AG-a 3 β I濃度。2)配制含單克隆抗體BCMab3的包被液,將其包被于96孔微孔板上。包被微孔板的步驟為a)包被采用O. 05M、pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液或O. 046M、pH值為4. 6的檸檬酸緩沖液與適當濃度的BCMab3抗體混合制成包被液,并將其加載于微孔板上,室溫過夜;b)封閉配制復合封閉液=IOOOmL磷酸緩沖液,包含O. 2g NaH2PO4 ·2Η20、2. 9g NaH2PO4 · 12H20、IOg BSA、lg水解明膠和ImL生物防腐劑(例如Proclin300),調(diào)pH值為7. O 7. 6,然后將該封閉液加載于包被好抗體的微孔板上,室溫過夜;c)洗板稀釋IOX濃縮洗液至原倍(IX),用原倍洗滌液洗板,干燥、封板后,于4°C封存?zhèn)溆谩?)制備辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體BCMabl。采用碳二亞胺(EDC)偶聯(lián)法,即采用碳二亞胺基團可以與酶分子上的羧基反應,洗去多余的EDC后,再加入抗體,實現(xiàn)抗體上的氨基與酶分子上的羧基結(jié)合,形成酶標記抗體。選取合適的酶濃度溶解于新配置的酶稀釋液中,凍存?zhèn)溆谩?)配制辣根過氧化物酶作用的化學發(fā)光底物液,化學發(fā)光底物液包含A液和B液,其中,基于IOOOmL所述化學發(fā)光底物A液,包括1. 7716g魯米諾、O. 051g4_羥基聯(lián)苯、
O.012g 4-碘苯硼酸、11. 4g硼酸、4. 9g硼砂,其pH值為8.0 10.0 ;基于IOOOmL所述化學發(fā)光底物 B 液,包括 O. 329g 過氧化脲、Iml Tween20、51. 58gNa2HP04 · 12H20、8. 74gNaH2P04 · 2H20,其 pH 值為 7· O 7· 6。5)配制濃縮洗滌液1000mL IOX濃縮洗液,包含5. 93g NaH2PO4 · 12H20、58gNaH2P04 · 2H20、9g NaClUOmL Tween-20 和 IOmL 生物防腐劑(例如 Proclin300)。6)分裝上述各組分,并組裝為成品。(三)技術(shù)效果本發(fā)明采用“雙抗體夾心一步法”反應模式,即載體上包被的抗體與酶標記的抗體和被測樣品的AG- α 3 β I形成“包被抗體-抗原-抗體-酶”的夾心復合物結(jié)構(gòu)。另外,本發(fā)明有效地利用了化學發(fā)光技術(shù)原理,實現(xiàn)了檢測的高靈敏度。
本發(fā)明一方面可以靈敏、快速測定尿液中膀胱癌腫瘤標志物AG-α 3β I的含量,對于膀胱癌患者早期診斷、早期治療提供可靠的臨床參考價值,能夠?qū)崿F(xiàn)無創(chuàng)性地早期篩查膀胱癌的目標;另一方面由于使用特異性提高的單克隆抗體作為包被固相,大大提高了AG-a 3β I檢測的線性范圍,可以根據(jù)AG-a 3β I含量的變化情況判斷膀胱癌治療效果及其病情的變化。本方法可以排除正常、炎癥上皮細胞,以及其它血細胞的干擾,特異性的識別膀胱癌腫瘤標志物。本發(fā)明具有使用簡便、檢測快速、靈敏、穩(wěn)定、可使用范圍寬等優(yōu)點。操作簡便適用性廣,既可應用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀,也可用于全自動的測量系統(tǒng),可實現(xiàn)大批量快檢測,使用成本低,更易推廣應用,特別適合廣大中、小醫(yī)院推廣使用。
圖1.本發(fā)明所制備的試劑盒中標準品的線性標準曲線(實施例1制備的試劑盒的標準曲線)。圖2.為實施例1制備的試劑盒特異性試驗。圖3.采用實施例2所述的方法對早期膀胱癌患者及正常人尿液檢測的散點圖。圖4.膀胱癌及正常人樣本尿液檢測的接收者操作特征曲線(receiveroperatingcharacteristic, ROC)。
具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的人尿液膀胱癌腫瘤標志物AG- α 3 β I的化學發(fā)光免疫分析試劑盒一、標準品的配制本方法采用辣根過氧化物酶催化魯米諾和過氧化氫化學發(fā)光體系,用化學發(fā)光儀檢測發(fā)光值為6685的樣本(即本方法選取的Cut off值)中包含AG- α 3 β I的量定義為lU/mL。該發(fā)光值也與濃度為lOOOcell/mL的人膀胱癌細胞系(EJ細胞)的化學發(fā)光值相
坐寸ο收集大量的化學發(fā)光值很高的膀胱癌患者尿液樣本以及正常人尿液樣本(正常人尿液中不含AG-α 3 β I),用正常人尿液樣本逐級稀釋膀胱癌患者尿液樣本,標準品的濃度梯度為0、l、2、4、8、16、32、64、128U/mL,凍存?zhèn)溆?,用作制備定量分析的標準曲線,用其標準曲線計算出樣本中AG- α 3 β I濃度。二、單克隆抗體BCMabl和BCMab3的制備
已具備兩株單克隆抗體雜交瘤細胞株保藏號為CGMCC No. 3845的雜交瘤細胞株分泌BCMabl抗體(中國專利申請?zhí)?01010251384. 6);保藏號為CGMCCNo. 6907的雜交瘤細胞株分泌BCMab3抗體。對于BCMabl和BCMab3各自的制備,取5X IO7個正處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞,以IX IO7的細胞濃度注射于BALB/c小鼠(購自北京維通利華實驗動物公司)腹腔,10天后收集腹水。通過以下步驟純化腹水中的單克隆抗體a)收集所得的腹水以2500r/min離心,取上清,以O. OlM pH7. 4PBS對倍稀釋腹水上清。b)向上述腹水中加入等體積的飽和硫酸銨,室溫攪拌I小時;c)以11000rrmin,4°C離心20分鐘,棄上清。重懸于適量O. OlM pH7.4PBS中,并加入1/2體積的飽和硫酸銨,4°C攪拌過夜。 d)上述腹水以11000r/min,4°C離心20分鐘,棄上清。將沉淀溶于O. OlM pH7. 4PBS中,再用O. OlM pH7. 4PBS透析,即得抗體粗球。e) Protein-G凝膠柱安裝到AKTA蛋白純化儀(GE Healthcare公司);f)將抗體粗球11000r/min,4°C離心20分鐘,取上清。上清以O. 5mL/min流速通過預先以O. 02M pH7. O含O. 15M的NaCl的PBS平衡過的Protein-G凝膠柱,上樣完畢后孵育I小時;g) O. 02M ρΗ7· O 含 O. 15Μ 的 NaCl 的 PBS 洗脫雜蛋白;h) O. 2M pH2. 8甘氨酸緩沖液,并收集洗脫液;i)清洗Protein-G凝膠柱,并將柱子保存在20%的乙醇中;j)洗脫的抗體溶液經(jīng)超濾濃縮,測抗體濃度,即完成抗體的純化。三、制備單克隆抗體BCMab3包被的微孔板采用O. 05M pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液與適當濃度的單克隆抗體BCMab3混合制成包被液,并將其加載于固相載體上;具體地,所述包被方法為a)包被采用0.05M pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液與適當濃度的單克隆抗體BCMab3混合配制成包被液。IOOOmL的碳酸鹽緩沖液包含2. 93g的NaHC03、1. 59g的Na2C03、和9g NaCl,與適當濃度的單克隆抗體BCMab3混合制成包被液。具體的碳酸鹽緩沖液見下
權(quán)利要求
1.一種檢測(人尿液中)膀胱癌腫瘤標志物(異常糖基化的整合素AG-α 3β I)的(化學發(fā)光)免疫分析試劑盒,其包括 特異性識別膀胱癌腫瘤標志物AG-a 3β I的兩種單克隆抗體,優(yōu)選鼠源單克隆抗體,更優(yōu)選BCMab3和BCMabI,最優(yōu)選用作捕獲抗體的BCMab3和酶標記的單克隆抗體BCMabl。
2.如權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫分析試劑盒,其包括 1)標準品; 2)捕獲抗體BCMab3包被的微孔板; 3)酶標記的單克隆抗體BCMabl; 4)上述酶所作用的化學發(fā)光底物; 5)濃縮洗滌液; 6)陰性對照,為不含膀胱癌腫瘤標志物AG-α 3 β I的正常人全尿樣本;和 7)陽性對照,為含有膀胱癌腫瘤標志物AG-α 3 β I的膀胱癌患者全尿樣本。
3.如權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫分析試劑盒,其中所述標準品為膀胱癌患者尿液樣本的逐級稀釋液。
4.如權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫分析試劑盒,其中所述捕獲抗體BCMab3為特異性識別人膀胱癌AG- α 3 β I蛋白C端的單克隆抗體,該單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 6907的雜交瘤細胞株分泌,優(yōu)選其中所述微孔板為適用于化學發(fā)光反應的檢測的96孔(白色)微孔板。
5.如權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫分析試劑盒,其中所述單克隆抗體BCMabl為抗人膀胱癌AG- α 3 β I的單克隆抗體,由保藏號為CGMCC No. 3845的雜交瘤細胞株分泌。
6.如權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫分析試劑盒,其中所述酶為堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或熒光素酶。
7.如權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫分析試劑盒,其中所述濃縮洗滌液使用前需用去離子水稀釋至原倍濃度后使用。
8.如權(quán)利要求1所述的化學發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法,包括以下步驟 1)配制標準品; 2)將捕獲抗體BCMab3包被固相載體,優(yōu)選微孔板; 3)制備酶標記的單克隆抗體BCMabl; 4)配制酶所作用的化學發(fā)光底物液; 5)配制濃縮洗滌液;和 6)分裝上述各組分,并組裝為試劑盒。
9.如權(quán)利要求8所述的方法,其中,所述包被固相載體的步驟2)包括以下步驟將純化后的BCMab3抗體配制成包被緩沖液;將BCMab3抗體包被緩沖液過夜包被微孔板;將封閉液封閉微孔板后,用洗滌液洗滌微孔板;再干燥、封板,于4°C保存。
10.如權(quán)利要求9所述的方法,其中所述封閉液為復合封閉液IOOOmL磷酸緩沖液,其中含 O. 2g NaH2PO4 · 2H20 和 2. 9gNa2HP04 · 12H20,加入 IOg BSAUg 水解明膠和 ImL 生物防腐劑,所述封閉液的PH值為7. O 7. 6,然后將所得封閉液加載于微孔板上。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學免疫分析領(lǐng)域,本發(fā)明利用微孔板化學發(fā)光免疫分析法,通過檢測人尿液中的膀胱癌腫瘤標志物——異常糖基化的整合素AG-α3β1建立一種快速、靈敏、高特異性的早期診斷膀胱癌的檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、高特異、穩(wěn)定等優(yōu)點,可用于常規(guī)體檢中膀胱癌早期篩查及膀胱癌跟蹤觀察和預后評價,可滿足目前膀胱癌體外診斷方面缺乏特異診斷方法的需要。
文檔編號G01N33/577GK103018461SQ20121054081
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者范祖森, 杜穎, 李翀, 張倩云, 王彥英, 楊昭, 周鵬 申請人:中國科學院生物物理研究所