膀胱癌篩選檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請?jiān)O(shè)及膀脫癌檢測治療領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] -些科學(xué)研究顯示，大于兩百核巧酸的長鏈非編碼RNA(lncRNA)參與了各種人類 疾病尤其是腫瘤的進(jìn)展。PVT1是長鏈非編碼家族中的明星成員且在前列腺癌、卵巢癌、胃 癌、肝癌等癌中起著重要的作用，但是該基因與膀脫癌的聯(lián)系仍不清晰。四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng) 是當(dāng)今使用最廣泛的調(diào)控系統(tǒng)，且是一種在醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)興起的時代發(fā)揮巨大作用的工 具。該系統(tǒng)可W被用來控制基因的表達(dá)，為我們提供了治療膀脫癌的新思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種新的膀脫癌篩選檢測試劑盒。
[0004] 本發(fā)明提供一種膀脫癌篩選檢測試劑盒，能夠特異性識別PVT1基因。
[0005]PVT1在膀脫癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過檢測該基因，可W實(shí)現(xiàn)對膀脫癌的篩選檢測。
[0006] -種膀脫癌細(xì)胞篩選檢測試劑盒，能夠特異性識別PVT1基因，所述膀脫癌細(xì)胞是 T24 和 5637。
[0007] -種四環(huán)素誘導(dǎo)的PVTlshRNA在制備治療膀脫癌的藥物中的應(yīng)用。
[0008] -種四環(huán)素誘導(dǎo)的PVTlshRNA在制備抑制膀脫癌細(xì)胞中PVT1基因表達(dá)的試劑中 的應(yīng)用。膀脫癌細(xì)胞如T24和5637。
[0009] 一種四環(huán)素誘導(dǎo)的PVTlshRNA在制備促進(jìn)膀脫癌細(xì)胞調(diào)亡的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 一種四環(huán)素誘導(dǎo)的PVTlshRNA在膀脫癌細(xì)胞中調(diào)控PVT1基因表達(dá)的應(yīng)用。該 shRNA通?？蒞敲低PVT1在膀脫癌細(xì)胞中的表達(dá)。
[0011] 一種四環(huán)素誘導(dǎo)的PVTlshRNA,其核巧酸序列如SEQNO: 1所示。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：PVT1在膀脫癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過檢測該基因，可W實(shí)現(xiàn) 對膀脫癌的初期篩查；四環(huán)素誘導(dǎo)的PVTlshRNA可W有效敲低PVT1的表達(dá)，抑制膀脫癌細(xì) 胞增殖，促進(jìn)膀脫癌細(xì)胞調(diào)亡，從而為膀脫癌的診斷治療提供了可能性。
【附圖說明】
[0013] 圖1是顯示PVT1在膀脫癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)的結(jié)果圖；其中，A部分表示使用 定量PCR方法檢測膀脫癌組織中PVT1的相對集中度；B部分表示與癌旁組織相比，PVT1在 癌組織中顯著性高表達(dá)（P<0. 01) ;C、D部分表示與SV-HUC-1細(xì)胞系對比，PVT1在T24(C部 分）及5637值部分）均顯著性高表達(dá)（兩個P均小于0. 01);數(shù)據(jù)用均值+標(biāo)準(zhǔn)差顯示 (沖<0. 05, *沖<0. 01);
[0014] 圖2是顯示轉(zhuǎn)染siRNA或者四環(huán)素誘導(dǎo)shRNA后PVT1表達(dá)水平顯著性下降的結(jié) 果圖；其中，A、B部分表示與si-NC組對比，PVT1表達(dá)水平在si-PVTl組中表達(dá)水平顯著 性下降燈24和5637均P<0. 01) ;C、D部分表示與對照組對比，加入不同濃度強(qiáng)力霉素后 四環(huán)素誘導(dǎo)組的PVTl表達(dá)水平下降；1μg/ml強(qiáng)力霉素能夠最大程度的抑制PVTl的表達(dá) 水平燈24、5637均P<0. 01);數(shù)據(jù)用均值+標(biāo)準(zhǔn)差顯示（沖<0. 05，*沖<0. 01);其中，對于 C、D部分，對應(yīng)每個濃度，從左到右的四個方柱分別表示PVTlshPVTl+DOX、NCshRNA+DOX、 PVTlshRNA-DOX和NCshRNA-DOX;
[0015] 圖3是顯示轉(zhuǎn)染siRNA或者四環(huán)素誘導(dǎo)質(zhì)粒后、細(xì)胞增殖被抑制的結(jié)果圖；其中， CCK8方法用于檢測細(xì)胞增殖；A、B部分中，與si-NC組對比，在si-PVTl組中，T24細(xì)胞（A 部分）及5637細(xì)胞度部分）的增殖被顯著性抑制（P<0.01) ;C、D部分中，與對照組相比， 在加入lug/ml強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的shRNA組中，T24細(xì)胞（C部分）及5637細(xì)胞值部分）的 增殖被顯著地抑制（P<〇. 01);數(shù)據(jù)用均值+標(biāo)準(zhǔn)差顯示（沖<0.05，*沖<0.01);其中，對于 A、B部分，實(shí)線表示si-NC，虛線表示si-PVTl;對于C、D部分，折線G、H、I和J分別表示 NC-D0X、NC+D0X、PVTlshRNA-DOX和PVTlshRNA+DOX;
[0016] 圖4是顯示轉(zhuǎn)染SiRNA或者四環(huán)素誘導(dǎo)質(zhì)粒后、細(xì)胞增殖被顯著地抑制的結(jié)果圖； A部分中，轉(zhuǎn)染SiRNA后，E加陽性細(xì)胞在T24及5637的si-PVTl組顯著性下降（P<0. 05); B部分中，轉(zhuǎn)染四環(huán)素誘導(dǎo)shRNA后，E加陽性細(xì)胞在T24及5637的si-PVTl組顯著性下降 (P<0. 05) ;C、D、E和F部分中，E加細(xì)胞率為E加陽性細(xì)胞數(shù)與化echst33342染色細(xì)胞數(shù)之 比；數(shù)據(jù)用均值+標(biāo)準(zhǔn)差顯示（沖<0. 05, *沖<0. 01);其中，C、D部分中，左、右方柱分別表 示si-NC、si-PVTl;E、F部分中，從左至右四個方柱分別表示NCshRNA-D0X、NCshRNA+DOX、 PVTlshRNA-DOX、PVTlshPVTl+DOX;
[0017] 圖5是顯示使用化ISA和化echst33258染色法檢測轉(zhuǎn)染SiRNA或者四環(huán)素誘導(dǎo) shRNA細(xì)胞調(diào)亡情況的結(jié)果圖；A部分中，轉(zhuǎn)染si-PVTl后，半脫天冬酶3在T24及5637均顯 著性提高（P<〇. 05) ;B部分中，化echst33258染色法檢測調(diào)亡的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染si-PVTl后，調(diào) 亡細(xì)胞數(shù)在T24及5637均顯著性提高（P<0. 05) ;C、D部分中，轉(zhuǎn)染四環(huán)素誘導(dǎo)shRNA后，半 脫天冬酶3在T24 (C部分）及5637值部分）均顯著性提高（P<0. 05) ;E、F部分中，轉(zhuǎn)染四 環(huán)素誘導(dǎo)ShRNA后，調(diào)亡細(xì)胞數(shù)在T24巧部分）及5637 (F部分）均顯著性提高（P<0. 05); G、H、I部分是轉(zhuǎn)染SiRNA及四環(huán)素誘導(dǎo)ShRNA后細(xì)胞調(diào)亡的代表性圖片；數(shù)據(jù)用均值+標(biāo) 準(zhǔn)差顯示（沖<0.05，*沖<0.01);其中，A、B部分中，左、右方柱分別表示si-NC、si-PVTl;C、 D、E、F部分中，從左至右四個方柱分別表示NCshRNA-DOX、NCshRNA+DOX、PVTlshRNA-DOX、 PVTlshPVTl+DOX；
[0018] 圖6是顯示流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞調(diào)亡水平的結(jié)果圖；A、B部分中，與si-NC組對 比，在si-PVTl組中可見更多的調(diào)亡細(xì)胞燈24及5637均P<0. 05) ;C、D部分中，與對照組 對比，在四環(huán)素誘導(dǎo)shRNA組中可見更多的調(diào)亡細(xì)胞燈24及5637均P<0. 05);數(shù)據(jù)用均值 +標(biāo)準(zhǔn)差顯示（沖<0. 05, *沖<0. 01)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0020] 技術(shù)與方法
[0021] 1.細(xì)胞培養(yǎng)
[0022] 膀脫癌細(xì)胞Τ24、5637購自AmericanTypeCultureCollection(ATCC，Manassas， USA)。膀脫正常上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1購自上海細(xì)胞研究所。T24在由90%的 0161(1]1￥；[付0邑6]1，〔4)，10%的胎牛血清（1]1￥；[付0邑6]1)，1%-2%的谷氨酷胺和0.5%-1%的雙抗組成的細(xì)胞培養(yǎng)液里培養(yǎng)。5637在由90%的1640(11^1付〇邑611，〔4)，10%的胎牛 血清（11^1付〇邑611)，1%-2%的谷氨酷胺和0.5%-1%的雙抗組成的細(xì)胞培養(yǎng)液里培養(yǎng)。 SV-HUC-1 在由 90 % 的F-12K(Invitrogen，CA)，10 % 的胎牛血清（Invitrogen)，1 % -2 % 的 谷氨酷胺和0. 5% -1 %的雙抗組成的細(xì)胞培養(yǎng)液里培養(yǎng)。Ξ種細(xì)胞系都放在37°C，5%C〇2 的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[002引 2.標(biāo)本采集
[0024]本研究包括32位在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科診斷為膀脫癌的病人。 實(shí)驗(yàn)前已告知病人或病人家屬，取得同意后方進(jìn)行下一步操作。標(biāo)本取出后，立即放入液氮 中保存。
[002引 3.四環(huán)素誘導(dǎo)的針對PVT1的短發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒構(gòu)建
[0026] 四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)質(zhì)粒來源于廣州富能基因公司（化lenGen，Guangzhou，化ina)，該 系統(tǒng)在該公司的目錄號為CS-S冊024-LVRInU6TGP，質(zhì)粒名稱為psi-LVRInU6TGP。并將針對 PVT1的shRNA序列插入到四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的下端。四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)shRNA序列是GATCCGC AGCCATCATGATGGTACTTCAAGAGAGTACCATCATGATGGCTGTTTTTTGGAATT(SEQNO: 1)。shRNA序列 是CAGCCATCATGATGGTACT(SEQN0:2)
[0027] 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0028] 轉(zhuǎn)染前一天，按照Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染說明書的細(xì)胞數(shù)接種到對應(yīng)的培養(yǎng)板 上，加入培養(yǎng)基，放在 37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)。按照Lipofectamin2000(Invit;rogen,CA) 轉(zhuǎn)染說明書，在無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入小分子干擾RNA或者構(gòu)建好的質(zhì)粒，柔和混勻。在無 血清培養(yǎng)基內(nèi)加入Lipofectamin2000試劑，輕輕混勻，室溫放置5min。將稀釋好的插有 shRNA的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)質(zhì)粒和Lipofectamin2000輕柔混勻，室溫放置20分鐘，W便形 成siRNA/Lipofectamin或質(zhì)粒/Lipofectamin復(fù)合物。將siRNA/Lipofectamin或質(zhì)粒 / Lipofectamin混合物加入對應(yīng)的培養(yǎng)板內(nèi)，輕柔搖晃。放入培養(yǎng)箱內(nèi)，4-6小時后更換無雙 抗的培養(yǎng)基，準(zhǔn)備下一步實(shí)驗(yàn)。
[0029] 5.組織及細(xì)胞RNA的提取及巧光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR)
[0030] 根據(jù)操作說明書，用RNA裂解液裂解組織及細(xì)胞，并提取RNA。使用化kara的逆轉(zhuǎn)