一種測(cè)定肌酸激酶同工酶（ck?mb）的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種測(cè)定肌酸激酶同工酶（CK?MB）的試劑盒。本發(fā)明針現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)肌酸激酶同工酶存在過(guò)程復(fù)雜、不適用于大批量快速檢測(cè)的問(wèn)題，提出以下的解決方案：一種測(cè)定肌酸激酶同工酶（CK?MB）的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中試劑R1含有緩沖液20~180mmol/L、葡萄糖10~60mmol/L、ADP 0.1~4.0mmol/L、NADP 1~7mmol/L、NAC、5~35mmol/L、HK0.01~4.00KU/L、G?6?PD、0.01~3.00KU/L、其余為純化水；其中試劑R2包含緩沖液20~180mmol/L、CrP、10~50mmol/L、防腐劑、0.01~1.0g/L、抗CK?M抗體>2100U/L、其余為純化水。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌酸激酶(CK)有三種主要的同工酶，即CK-MM，CK-MB，CK-BB。肌肉型(MM)主要存在 于各種肌肉細(xì)胞中，腦型(BB)主要存在于腦細(xì)胞中，雜化型(MB)主要存在于心肌細(xì)胞中，肌 酸激酶MB同工酶(CK-MB )是心肌酶譜中最有特異性的酶。
[0003] 人體中肌酸激酶同工酶升高有以下情形：急性心肌梗死(CK-MB>0.03，可達(dá)0.12~ 0.38)、甲狀腺功能減低癥、腦血管疾病、肺部疾病、慢性醇中毒、手術(shù)后恢復(fù)期肌肉痙攣、心 臟復(fù)蘇后、休克、破傷風(fēng)、骨骼肌損傷等同工酶分析只發(fā)現(xiàn)有CK-MM型，無(wú) CK-MB型、也檢不出 CK-BB型。藥物注射(氯丙嗪、苯巴比妥、青霉素、利血平、苯妥英鈉、腎上腺素、多粘菌素 B)肌 肉損傷可檢出CK-MM型 肌酸激酶的同功酶在臨床診斷中有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌 梗塞發(fā)生時(shí)，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，認(rèn)為在心肌梗塞的診斷中測(cè)定肌酸激酶 的活性比做心電圖更為可靠。心肌梗死時(shí)，肌酸激酶在起病6小時(shí)內(nèi)升高，24小時(shí)達(dá)高峰，3-4日內(nèi)恢復(fù)正常。其中肌酸激酶的同工酶CK-MB診斷的特異性最高。肌酸激酶因其具有重要 的生理功能和臨床應(yīng)用價(jià)值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。
[0004] 目前，臨床上用于檢測(cè)肌酸激酶同工酶(CK-MB)的方法有免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸 附法和免疫抑制法等。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)耗時(shí)且操作復(fù)雜，不適用于大批量快速檢測(cè)。膠 乳增強(qiáng)免疫比濁法反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生膠乳顆粒物的沉淀，不利于儀器的清洗，且檢測(cè)精度差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)肌酸激酶同工酶存在過(guò)程復(fù)雜、不適用于大批量快速檢 測(cè)，檢測(cè)精度不足等問(wèn)題，提供一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題提供的技術(shù)方案是:一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB) 的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，所述的相互獨(dú)立的試劑R1和試劑 R2包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 20~180mmol/L 葡萄糖 10~60mmol/L ADP 0.l~4.0mmol/L NADP l~7mmol/L NAC 5~35mmol/L HK 0.01-4.00KU/L G-6-PD 0.01-3.00KU/L 其余為純化水； 試劑R2: 緩沖液 20~180mmol/L CrP 10~50mmol/L 防腐劑 0.01~1.0g/L 抗CK-M抗體 >2100 U/L 其余為純化水。
[0007] 作為優(yōu)選方案，所述的相互獨(dú)立的試劑R1和試劑R2包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 100mmol/L 葡萄糖 35mmol/L ADP 2.Ommol/L NADP 4.Ommol/L NAC 20mmol/L HK 2KU/L G-6-PD 1.5KU/L 其余為純化水； 試劑R2: 緩沖液 100mmol/L CrP 25mmol/L 防腐劑 〇.5g/L 抗CK-M抗體 2200 U/L 其余為純化水。
[0008] 優(yōu)選的所述的緩沖液為Tri S緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、甘氨酸 緩沖液中的一種或多種組合而成。
[0009] 優(yōu)選的，所述的防腐劑為苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種組合而成。
[0010]優(yōu)選的，本發(fā)明還提供了試劑盒的制備和使用方法，包括以下步驟： (1)試劑R1液的配制： (a) 按照試劑R1的組分含量，配置成緩沖液； (b) 按照試劑R1的組分含量，將葡萄糖、ADP、NADP、NAC溶于步驟(a)制得的緩沖液中，攪 拌均勻； (c) 按照試劑R1的組分含量，稱取HK、G-6-PD溶于步驟(b)制得的液體中，攪拌均勻即 可。
[0011] ⑵所述的試劑R2的配制如下： (a) 按照試劑R2的組分含量，配置成緩沖液； (b) 按照試劑R2的組分含量，稱取一定量的CrP溶于步驟(a)制得的緩沖液中，攪拌均 勻； (c) 按照試劑R2的組分含量，稱取抗CK-M抗體溶于步驟(b)制得的液體中，攪拌均勻； (d) 按照試劑R2的組分含量，稱取防腐劑溶于步驟(c)制得的液體中，攪拌均 勻即可； (3)將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)，進(jìn)一步優(yōu)選試劑R1與試劑R2的 體積比為4:1，待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:20到1:70之間。
[0012] (4)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (5)根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的肌酸激酶同工酶的值。
[0013] R2試劑中的抗CK-M抗體抑制CK-M亞基，即抑制CK-MM活性和CK-MB的CK-M亞單位的 活性，CK-M抗體抑制CK-M活性;而CK-MB亞單位催化CrP與ADP反應(yīng)產(chǎn)生ATP與肌酸，偶聯(lián)HK 及G-6-H)的催化反應(yīng)。HK催化葡萄糖與ATP反應(yīng)，形成G-6-P，G-6-H)催化G-6-P氧化，使NADP 生成NADPH，通過(guò)測(cè)定NADPH生成速率可計(jì)算CK-MB的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0015] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1 緩沖液 100mmol/L 葡萄糖 35mmol/L ADP 2.Ommol/L NADP 4.Ommol/L NAC 20mmol/L HK 2KU/L G-6-PD 1.5KU/L 其余為純化水； 試劑R2: 緩沖液 100mmol/L CrP 25mmol/L 防腐劑 〇.5g/L 抗CK-M抗體 2200 U/L 其余為純化水。
[0016] 實(shí)施例2 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： 緩沖液 100mmol/L 葡萄糖 35mmol/L ADP 2.Ommol/L NADP 4.Ommol/L NAC 20mmol/L HK 2KU/L G-6-PD 1.5KU/L 其余為純化水； (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： 緩沖液 100mmol/L CrP 25mmol/L 防腐劑 〇.5g/L 抗CK-M抗體 2200 U/L 其余為純化水。
[0017] 2、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長(zhǎng):主波長(zhǎng)340nm，副波長(zhǎng)405nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度A1， 5min后讀取吸光度A2，計(jì)算吸光度變化Δ A=A2-A1; (d) 反應(yīng)方向：負(fù)反應(yīng)； 4、檢測(cè)步驟 (a) 取200μ1試劑R1與5μ1待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入50μ1試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 Δ A=A2-A1 ； (d) 樣本中肌酸激酶同工酶計(jì)算出樣本中的肌酸激酶 同工酶(CK-MB)的活度。
[0018]表1為實(shí)施例1所制得的測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒對(duì)質(zhì)控品1進(jìn)行測(cè)定 的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的肌酸激酶同工酶(CK-MB)為25.0 IU/L，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1: 表1
由表1可知，本發(fā)明所制得的測(cè)定唾液酸的試劑盒對(duì)質(zhì)控品1的測(cè)定結(jié)果偏差較小，因 此測(cè)定準(zhǔn)確度高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1 和試劑R2雙液體組分，其特征在于:所述的相互獨(dú)立的試劑R1和試劑R2包括的成分及相應(yīng) 含量為： 試劑R1: 緩沖液 20~180mmol/L 葡萄糖 10~60mmol/L ADP 0.l~4.0mmol/L NADP l~7mmol/L NAC 5~35mmol/L HK 0.01-4.00KU/L G-6-PD 0.01-3.00KU/L 其余為純化水； 試劑R2: 緩沖液 20~180mmol/L CrP 10~50mmol/L 防腐劑 0.01~1.0g/L 抗CK-M抗體 >2100 U/L 其余為純化水。2. 如權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒，其特征在于:所述 的相互獨(dú)立的試劑R1和試劑R2包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 100mmol/L 葡萄糖 35mmol/L ADP 2.Ommol/L NADP 4.Ommol/L NAC 20mmol/L HK 2KU/L G-6-PD 1.5KU/L 其余為純化水； 試劑R2: 緩沖液 100mmol/L CrP 25mmol/L 防腐劑 〇.5g/L 抗CK-M抗體 2200 U/L 其余為純化水。3. 如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒，其特 征在于:所述的緩沖液為Tri s緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中 的一種或多種組合而成。4. 如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒，其特 征在于:所述的防腐劑為苯酚、苯甲酸鈉、疊氮鈉中的一種或多種組合而成。5. 如權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒，其特征在于:所述 的試劑盒的制備和使用方法包括以下步驟： (1) 試劑R1液的配制： (a) 按照試劑R1的組分含量，配置成緩沖液； (b) 按照試劑R1的組分含量，將葡萄糖、ADP、NADP、NAC溶于步驟(a)制得的緩沖液中，攪 拌均勻； (c) 按照試劑R1的組分含量，稱取HK、G-6-PD溶于步驟(b)制得的液體中，攪拌均勻即 可； (2) 所述的試劑R2的配制如下： (a) 按照試劑R2的組分含量，配置成緩沖液； (b) 按照試劑R2的組分含量，稱取一定量的CrP溶于步驟(a)制得的緩沖液中，攪拌均 勻； (c) 按照試劑R2的組分含量，稱取抗CK-M抗體溶于步驟(b)制得的液體中，攪拌均勻； (d) 按照試劑R2的組分含量，稱取防腐劑溶于步驟(c)制得的液體中，攪拌均 勻即可； (3) 將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (4) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (5 )根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的肌酸激酶同工酶的值。6. 如權(quán)利要求5所述的一種一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒制備和使用方 法，其特征在于:所述的步驟(3)中，試劑R1與試劑R2的體積比為4:1。7. 如權(quán)利要求5所述的一種一種測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)的試劑盒制備和使用方 法，其特征在于:所述的步驟(3)中，待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:20 到1:70之間。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK106093386SQ201610359612
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請(qǐng)人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司