一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒。本試劑盒由R1、R2雙試劑組成，將含有肝源性堿性磷酸酶抑制劑的試劑R1與樣本相混合，以達(dá)到抑制肝源性堿性磷酸酶的目的。再將含有包被了高特異性的抗人骨源性堿性磷酸酶抗體的聚苯乙烯微球的緩沖液（即試劑R2）與上述中抑制了肝源性堿性磷酸酶的樣本中相應(yīng)的骨源性堿性磷酸酶抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在促凝劑作用下形成不溶性的聚苯乙烯微球?抗原?聚苯乙烯微球顆粒復(fù)合物乳濁液，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與樣本中的骨源性堿性磷酸酶抗原濃度成正比關(guān)系，在一定波長下進(jìn)行濁度測定，即可測得樣本中被檢測骨源性堿性磷酸酶的含量。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定骨源性堿性磷酸酶的 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞的表型標(biāo)志物之一，它可直接反映成骨細(xì)胞的活性或功 能狀況，是近年來主要用于小兒佝僂病早期診斷和亞臨床鑒別的特異性參考指標(biāo)，也是目 前用于評價(jià)人體骨礦化障礙的最佳指標(biāo)。
[0003] 骨源性堿性磷酸酶是由骨質(zhì)中分泌出來，當(dāng)骨頭中鈣鹽沉淀不足時(shí)，該酶分泌增 多，骨中鈣鹽充足時(shí)就分泌減少，所以用來幫助檢查有無鈣吸收不足。
[0004] 檢測小兒血中骨源性堿性磷酸酶催化活性，籍以篩查或輔助診斷因鈣營養(yǎng)不良引 起的骨鈣化障礙或其他原因引起的代謝性骨病。
[0005] 佝僂病的發(fā)病過程是一個(gè)慢性過程，初期臨床表現(xiàn)沒有特異性，直至出現(xiàn)明顯的 骨骼改變時(shí)在進(jìn)行治療，將錯(cuò)過治療的最佳時(shí)期。對兒童生長發(fā)育造成不利影響，因此，在 臨床工作中，需要有一個(gè)指標(biāo)來衡量治療水平。防止治療不足或過量。單純依靠癥狀和體征 容易造成誤診和漏診。以往的血鈣、磷、全血堿性磷酸酶及X線檢測靈敏度低，特異性差。不 應(yīng)用于早期診斷。1，25_二羥維生素 D3是國際公認(rèn)的反映體內(nèi)vitD營養(yǎng)狀況可靠的指標(biāo)?？?作為早期診斷的指標(biāo)。該實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣。不適合在基層醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)中開展。小兒骨源 性堿性磷酸酶的檢測，具有簡便、快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，該試劑的臨床應(yīng)用對早期發(fā)現(xiàn)佝 僂病提供了科學(xué)的診斷依據(jù)，對指導(dǎo)臨床治療有很大臨床意義。
[0006] 目前臨床檢測骨源性堿性磷酸酶主要采用酶聯(lián)免疫吸附法。但酶聯(lián)免疫吸附法操 作復(fù)雜耗時(shí)長，且對操作人員有較高的專業(yè)技術(shù)要求，且酶聯(lián)免疫吸附法只能定性或者半 定量，檢測結(jié)果不夠準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中骨源性堿性磷酸酶檢測過程操作復(fù)雜、以及測 定準(zhǔn)確度低的問題，提供一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑 盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，它們包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 20~100 mmol/L 吐溫-20 0.5-2.0 mL/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 肝源性堿性磷酸酶抑制劑 1.0~2.5 g/L 其溶劑為純化水。
[0009]試劑 R2: Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 10~60 g/L 海藻糖 5~25 g/L 聚乙二醇-6000 10-25 g/L 甘油 0.2~4.8 mL/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體1~4 g/L 其溶劑為純化水。
[0010]作為優(yōu)選方案，所述的彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 60 mmol/L 吐溫-20 1.3mL/L 疊氮鈉 〇.6g/L 肝源性堿性磷酸酶抑制劑 1.7g/L 其溶劑為純化水。
[0011] 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 35 g/L 海藻糖 15 g/L 聚乙二醇-6000 15 g/L 甘油 2.5mL/L 疊氮鈉 0.5 g/L 乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體 2g/L 其溶劑為純化水。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體為含有能與骨源性堿性磷 酸酶特異性結(jié)合的Fab功能部位的完整抗體或抗體片段。
[0013] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體的粒徑在40~500nm之間。
[0014] 作為優(yōu)選，本測定骨源性堿性磷酸酶試劑盒的制備方法和使用方法包括以下步 驟： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 20~100 mmol/L 吐溫-20 0.5-2.0 mL/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 肝源性堿性磷酸酶抑制劑 1.0~2.5 g/L 其溶劑為純化水。
[0015] (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 10~60 g/L 海藻糖 5~25 g/L 聚乙二醇-6000 10-25 g/L 甘油 0.2~4.8 mL/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水。
[0016] (C)將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)，進(jìn)一步優(yōu)選的R1與試劑R2 的體積比為4:1，待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:80到1:120之間； (d) 用全自動(dòng)生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (e) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的骨源性堿性磷酸酶的值。
[0017] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的含8 mg/mL抗人骨源性堿性磷酸酶抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠 乳顆粒最終濃度為2.0 g/L; (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo 1 /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為2g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人骨源性堿 性磷酸酶抗體。
[0018] 本發(fā)明所采用的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的反應(yīng)原理是:先將含有肝源性堿性磷酸酶 抑制劑的試劑R1與樣本相混合，在37°c下孵育5分鐘，以達(dá)到抑制肝源性堿性磷酸酶的目 的。再將含有包被了高特異性的抗人骨源性堿性磷酸酶抗體的緩沖液（即試劑R2)與上述中 抑制了肝源性堿性磷酸酶的樣本中相應(yīng)的骨源性堿性磷酸酶抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在促凝 劑作用下形成不溶性的聚苯乙烯微球-抗原-聚苯乙烯微球顆粒復(fù)合物乳濁液，產(chǎn)生一定的 濁度，其濁度高低與樣本中的骨源性堿性磷酸酶抗原濃度成正比關(guān)系，在一定波長下進(jìn)行 濁度測定，即可測得樣本中被檢測骨源性堿性磷酸酶的含量。
式中：△ At以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 ΔAs以空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中NBAP的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn):對骨源性堿性磷酸酶的檢測靈敏度更高， 檢測準(zhǔn)確性更好，另外檢測也比較方便。
[0020]
【附圖說明】： 圖1為本試劑盒與化學(xué)發(fā)光法的檢測結(jié)果對比。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0022] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 60 mmol/L 吐溫-20 1.3mL/L 疊氮鈉 〇.6g/L 肝源性堿性磷酸酶抑制劑 1.7g/L 其溶劑為純化水。
[0023] 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 35 g/L 海藻糖 15 g/L 聚乙二醇-6000 15 g/L 甘油 2.5mL/L 疊氮鈉 0.5 g/L 乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體 2g/L 其溶劑為純化水。
[0024] 實(shí)施例2 試劑盒的制備和使用方法 1、乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體制備： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的含8 mg/mL抗人骨源性堿性磷酸酶抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠 乳顆粒最終濃度為2.0 g/L; (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo 1 /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為2g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人骨源性堿 性磷酸酶抗體。
[0025] 2、按照下列組分含量配制好試劑： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 60 mmol/L 吐溫-20 1.3mL/L 疊氮鈉 〇.6g/L 肝源性堿性磷酸酶抑制劑 1.7g/L 其溶劑為純化水。
[0026] (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 35 g/L 海藻糖 15 g/L 聚乙二醇-6000 15 g/L 甘油 2.5mL/L 疊氮鈉 0.5 g/L 乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體 2g/L 其溶劑為純化水。
[0027] 3、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長600nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、檢測步驟 (a) 取200μ1試劑R1與2.5μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入50μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 Δ A = A2-A1； (d)骨源性堿性磷酸酶(NBAP)的活性計(jì)算出樣本中的骨源 性堿性磷酸酶的活度。
[0028]參照附圖1，附圖1為用實(shí)施例1所制得的一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒多 次測定不同樣本中骨源性堿性磷酸酶的測定結(jié)果，以及在同等條件下與化學(xué)發(fā)光法測定結(jié) 果的對比分析。從相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，本試劑盒與化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果相關(guān)性很好，相關(guān)方 程y=l. 0054x+0.415，R2=0.9903，從結(jié)果可以看出本試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確性可靠，相關(guān)性良好， 可以應(yīng)用于骨源性堿性磷酸酶的檢測。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組 分，其特征在于:所述的彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 20~100 mmol/L 吐溫-20 0.5-2.0 mL/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 肝源性堿性磷酸酶抑制劑 1.0~2.5 g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 10~60 g/L 海藻糖 5~25 g/L 聚乙二醇-6000 10-25 g/L 甘油 0.2~4.8 mL/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體1~4 g/L 其溶劑為純化水。2. 如權(quán)利要求1所述的一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒，其特征在于:所述的彼此 獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 60 mmol/L 吐溫-20 1.3mL/L 疊氮鈉 〇.6g/L 肝源性堿性磷酸酶抑制劑 1.7g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 35 g/L 海藻糖 15 g/L 聚乙二醇-6000 15 g/L 甘油 2.5mL/L 疊氮鈉 0.5 g/L 乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體 2g/L 其溶劑為純化水。3. 如權(quán)利要求1所述的一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠 包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體為含有能與骨源性堿性磷酸酶特異性結(jié)合的Fab功能部位 的完整抗體或抗體片段。4. 如權(quán)利要求1所述的一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠 包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體的粒徑在40~500nm之間。5. 如權(quán)利要求1所述的一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒，其特征在于:所述的試劑 盒的制備方法和使用方法包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 20~100 mmol/L 吐溫-20 0.5-2.0 mL/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 肝源性堿性磷酸酶抑制劑 1.0~2.5 g/L 其溶劑為純化水； (b) 按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 10~60 g/L 海藻糖 5~25 g/L 聚乙二醇-6000 10-25 g/L 甘油 0.2~4.8 mL/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 乳膠包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水； (c) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (d) 用全自動(dòng)生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (e) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的骨源性堿性磷酸酶的值。6. 如權(quán)利要求1所述的一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠 包被抗人骨源性堿性磷酸酶抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的含8 mg/mL抗人骨源性堿性磷酸酶抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠 乳顆粒最終濃度為2.0 g/L; (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo 1 /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為2g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人骨源性堿 性磷酸酶抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:步驟(c)中，所述的試劑R1與試劑R2的體積比為4:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測定骨源性堿性磷酸酶的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:步驟(C)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:80 至ljl:120之間。
【文檔編號】G01N33/573GK106093387SQ201610359614
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司