專利名稱：巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈式反應試劑盒，具體是涉及一種，比常規(guī)聚合酶鏈式反 應試劑盒技術(shù)更高特異性、更高擴增效率的巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒，屬于分子 生物學檢測技術(shù)中的DNA體外擴增技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有的DNA體外擴增技術(shù)中，聚合酶鏈式反應是最主要的也是很有效的常用技 術(shù)，在常規(guī)聚合酶鏈式反應試劑盒中，由于經(jīng)常遇到引物二聚體和其它非特異性擴增的產(chǎn) 生，而一旦產(chǎn)生非特異性模板，由于其與特異性擴增的效率相當，并竟爭底物與酶，往往與 特異性擴增差不多同時進入擴增的平臺期，這不僅使擴增結(jié)果難以判斷，而且使特異性擴 增效率降低，尤其在擴增粗提的臨床標本時，常導致臨床基因診斷的假陽性和假陰性結(jié)果 的產(chǎn)生。用于提高聚合酶鏈式反應試劑盒擴增特異性的方法，已有熱啟動法、固體石蠟膜 法、抗體-酶法、雙鏈引物法，這些方法雖然都能在一定程度上提高聚合酶鏈式反應試劑盒 擴增的特異性與其擴增效率，但與常規(guī)聚合酶鏈式反應試劑盒相比都只是略有改進，而沒 有本質(zhì)的變化，特異性擴增效率都不會超過2n倍。巢式聚合酶鏈式反應試劑盒是一種特異性很高的聚合酶鏈式反應試劑盒，其本質(zhì) 是在一段待擴增的靶序列中設計外側(cè)、內(nèi)側(cè)兩對引物，先用外側(cè)引物進行擴增，完成后再取 擴增產(chǎn)物作模板用內(nèi)側(cè)引物擴增，即要進行兩次連續(xù)的聚合酶鏈式反應，這種方法操作較 復雜，費時較長，而其每一次的聚合酶鏈式反應試劑盒中，擴增的效率也不會超過2n倍，同 時由于第二次擴增要用外側(cè)引物擴增的聚合酶鏈式反應試劑盒產(chǎn)物做模板，很容易造成聚 合酶鏈式反應試劑盒產(chǎn)物污染，導致擴增的假陽性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種操作簡單，特異性擴增效率超過2n倍的、高特異性的 DNA體外擴增技術(shù)，即巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒，其英文名稱是nest coamplific ationpolymerase chain reaction, 英文縮寫是NCA-PCR。本發(fā)明的技術(shù)方案是首先根據(jù)待擴增靶DNA序列合成一對特異的外側(cè)引物和一對特殊的巢式引物，然 后將內(nèi)側(cè)與外側(cè)引物放入同一個含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、聚合酶鏈 式反應緩沖液、超純水等組成的聚合酶鏈式反應擴增緩沖反應體系中，在熱循環(huán)儀上進行 高溫、低溫、中溫的反復熱循環(huán)，使內(nèi)外側(cè)引物同時引導新鏈合成，獲得分別由內(nèi)內(nèi)、外外、 內(nèi)外側(cè)引物界定的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物；由于每一循環(huán)中合成的由外外、內(nèi)外側(cè)引物界定 的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物都可以作為內(nèi)內(nèi)引物附加的模板，使內(nèi)內(nèi)引物引導的聚合酶鏈式反 應產(chǎn)物以超過2倍的速度增加，經(jīng)過η個循環(huán)，其理論值為初始模板量的1/4 (η2+3η) 2η倍， 大大提高了特異性擴增的效率。
所用擴增緩沖反應體系是由引物、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、聚 合酶鏈式反應緩沖液、超純水等組成的，各個成分的終濃度分別如下特異的引物每條 0. 2-0. 4umol/L、Taq DNA 聚合酶 l_3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5mmol/L、模板 DNA 若干、 Mg++1. 5-3. 5mmol/L、緩沖液 1-1. 5XPCR ；其中 IXPCR 緩沖液包括 50mmol/L KClUOmmol/ LTris, HCl ΡΗ8· 3、0· 01 % 明膠。該巢式共擴增聚合酶鏈式反應由于每一循環(huán)中合成的由外外、內(nèi)外側(cè)引物界定的 聚合酶鏈式反應產(chǎn)物都可以作為內(nèi)內(nèi)引物附加的模板，使內(nèi)內(nèi)引物引導的聚合酶鏈式反應 產(chǎn)物以超過2倍的速度增加，經(jīng)過η個循環(huán)，其理論值為初始模板量的1/4 (η2+3η) 2η倍，與 常規(guī)巢式聚合酶鏈式反應方法相比，具有以下優(yōu)點1、操作簡便快速，只做一次聚合酶鏈式 反應即可達到巢式擴增的提高特異性的效果；2、擴增前不進行聚合酶鏈式反應產(chǎn)物操作， 減少可能出現(xiàn)的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物污染；3、自動化程度高，人工成本低，還可以高通量檢 測，每次可以檢測90個以上標本；4、需要的檢測樣本材料微量，每個反應最低僅需要待檢 靶DNA 10拷貝，便于取材。根據(jù)上述巢式共擴增聚合酶鏈式反應原理，將上述引物和其他聚合酶鏈式反應試 劑混合后分裝到聚合酶鏈式反應擴增管中，并配以系列稀釋度的標準DNA模板組裝成巢式 共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒。有鑒于此，我們設計了一種操作簡單、特異性高、特異性擴增效率超過2η倍的DNA 體外擴增技術(shù)即巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒。


附圖是本發(fā)明的原理示意圖
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明做進一步的描述實施例1、材料用本室常規(guī)的鹽析法提取30份正常人外周血DNA，作為待擴增模板。引物設計根據(jù)脆性X智力低下1號基因(fragile X mental retardation 1， FMRl)的 5，非翻譯區(qū)序列(GenBanK S74494 和 Nature Genet，8 (1) 88-94，1994)合成以下 特異的內(nèi)外側(cè)引物外側(cè)上游引物Pl :5，-GGT TTC ACC TTC CGG TGG AGG-3，(SEQ ID NO 1)；外側(cè)下游引物P2 :5，-CTC CAT CTT CTC TTC AGC CCT GC-3，(SEQ ID NO :2)；內(nèi)側(cè)上游引物 P3 :5，-AAA CCC CTG CAG GGG CGT GCG GCA GCG-3，(SEQ ID NO
3)；內(nèi)側(cè)下游引物P4 5'-AAA CGT CGG GCC CGA CGC CCG CGA GCT C_3，(SEQ ID NO 4)。2、巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒的反應巢式共擴增聚合酶鏈式反應混合50ul反應體系，內(nèi)含內(nèi)、外側(cè)引物(PI、P2、P3、 P4)各 10pmol，正常人 DNA 5-10ng, 1X PCR 緩沖液，Taq DNA 聚合酶 2u，Mg++終濃度 2mmol/L,然后在PE9600上96°C下變性5分鐘，然后按96°C 20秒，65°C 40秒，72°C 1分30秒熱循 環(huán)28次；同時用僅有相同濃度的內(nèi)側(cè)引物P3、P4，其它成分和反應條件完全相同的常規(guī)聚 合酶鏈式反應做對照實驗。3、2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，GelDoclOOO下觀察，灰度掃描分析記錄各聚 合酶鏈式反應的結(jié)果，并比較各個標本巢式共擴增聚合酶鏈式反應和相應常規(guī)聚合酶鏈式 反應的P3P4片段擴增強度。4、結(jié)果在30個標本的巢式共擴增聚合酶鏈式反應和對應的常規(guī)聚合酶鏈式反應中，都 獲得了預期大小的P3P4DNA條帶，未加DNA標本的陰性對照未見相應擴增產(chǎn)物，經(jīng)統(tǒng)計學分 析巢式共擴增聚合酶鏈式反應產(chǎn)生的P3P4DNA片段的量，顯著大于常規(guī)聚合酶鏈式反應產(chǎn) 生的P3P4DNA片段的量。巢式共擴增聚合酶鏈式反應過程中，96°C時，模板DNA變性為單鏈；65°C時引物 P1、P2、P3、P4分別與DNA相應靶位點結(jié)合，并分別引導合成新鏈；當Pl引導合成的新鏈到 達P3引導合成的新鏈時，隨著該新鏈的繼續(xù)延伸，P3引導合成的新鏈逐步從模板上解鏈為 單鏈，從而P3、P4又分別與該新合成的單鏈上相應結(jié)合位點結(jié)合引導相應的DNA新鏈合成； 這樣，第一個循環(huán)結(jié)束時，一分子的P1P2模板將產(chǎn)生二分子的P1P2，一分子的P1P4，一分子 的P3P2和二分子的P3P4 ；在第二個循環(huán)中，二分子的PlPl將產(chǎn)生兩分子的P1P4，二分子 的P3P2和四分子的P3P4 ；—分子的P1P4將產(chǎn)生二分子的P1P4和一分子的P3P4 ；—分子的 P3P2將產(chǎn)生二分子的P3P2和一分子的P3P4 ；二分子的P3P2將產(chǎn)生四分子的P3P2 ；經(jīng)過η 次循環(huán)，由 Ρ1Ρ2 模板分子將產(chǎn)生 2ηΡ1Ρ2 ；η2η_1Ρ1Ρ4 ；η2η_1Ρ3Ρ2 ； 1/4 (η2+3η) 2ηΡ3Ρ4。在附圖中示雙鏈DNA Ρ1Ρ2變性形成2條單鏈DNA，引物(Pl，P2，P3and P4)與單 鏈DNA復性引發(fā)DNA合成；合成的第一步示首先合成2條￡1拉，1條單鏈_和1條單鏈 P1P4 ；第二步示由上述新合成的單鏈DNA作模板分別合成1條P3P2與1條P1P4以及2條單 鏈P3P4 第三步示以新產(chǎn)生的單鏈為模板，繼續(xù)合成2條P3P4 ；這樣，由1分子雙鏈DNAP1P2 為模板，通過一個NCA-PCR熱循環(huán)，可以合成2分子El徑，1分子E1M，1分子P2P3and 2分 子 P3P4 經(jīng)過 η 次循環(huán)，理論上可以產(chǎn)生 2ηΡ1Ρ2 ；η2η_1Ρ1Ρ4 ；η2η_1Ρ3Ρ2 ； 1/4 (η2+3η) 2ηΡ3Ρ4。本發(fā)明適用于分子生物學檢測技術(shù)中的DNA體外擴增技術(shù)領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種操作簡單、特異性高、每個循環(huán)特異性擴增效率可以超過2倍的DNA體外擴 增技術(shù)，即巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒，其英文名稱是nest coamplific ation polymerasechain reaction,英文縮寫是NCA-PCR ；首先根據(jù)待擴增靶DNA序列合成一對特 異的外側(cè)引物和一對特殊的巢式引物，然后將內(nèi)側(cè)與外側(cè)引物放入同一個含有耐熱DNA聚 合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、聚合酶鏈式反應緩沖液、超純水等組成的擴增緩沖反應體系 中，在熱循環(huán)儀上進行高溫、低溫、中溫的反復熱循環(huán)，使內(nèi)外側(cè)引物同時引導新鏈合成，獲 得分別由內(nèi)內(nèi)、外外、內(nèi)外側(cè)引物界定的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物；其特征在于每一循環(huán)中合成 的由外外、內(nèi)外側(cè)引物界定的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物，都可以作為內(nèi)內(nèi)引物擴增附加的模板， 使內(nèi)內(nèi)引物引導的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物以每個熱循環(huán)超過2倍的速度增加，經(jīng)過η個循環(huán)， 內(nèi)內(nèi)引物引導的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物理論值即擴增為初始模板量的1/4(η2+3η)2η倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒，其特征在 于，所述的擴增緩沖反應體系中各成分及其濃度含量分別如下內(nèi)外側(cè)特異的引物各 0. 2-0. 4umol/L、TaqDNA 聚合酶 l_3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5mmol/L、模板 DNA 若干、 Mg++1. 5-3. 5mmol/L、緩沖液 1-1. 5XPCR ；其中 IXPCR 緩沖液包括 50mmol/L KClUOmmol/L Tris, HCl ΡΗ8· 3、0· 01% 明膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒，其特征在于，根據(jù) 該技術(shù)要求所組裝的巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種操作簡單、特異性高、特異性擴增效率超過2n倍的DNA體外擴增技術(shù)，即巢式共擴增聚合酶鏈式反應試劑盒，其英文名稱是nest coamplific ation polymerase chain reaction，英文縮寫是NCA-PCR；首先根據(jù)待擴增靶DNA序列合成一對特異的外側(cè)引物和一對特殊的巢式引物，然后將內(nèi)側(cè)與外側(cè)引物放入同一個含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、聚合酶鏈式反應緩沖液、超純水等組成的擴增緩沖反應體系中，在熱循環(huán)儀上進行高溫、低溫、中溫的反復熱循環(huán)，使內(nèi)外側(cè)引物同時引導新鏈合成，獲得分別由內(nèi)內(nèi)、外外、內(nèi)外側(cè)引物界定的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物，由于每一循環(huán)中合成的由外外、內(nèi)外側(cè)引物界定的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物都可以作為內(nèi)內(nèi)引物附加的模板，使內(nèi)內(nèi)引物引導的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物以每個熱循環(huán)超過2倍的速度增加，經(jīng)過n個循環(huán)，內(nèi)內(nèi)引物引導的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物理論值即擴增為初始模板量的1/4(n2+3n)2n倍，大大提高了特異性擴增的效率。
文檔編號C12Q1/68GK102146447SQ20111000492
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者劉欽松, 夏慶杰 申請人:山東博奧克生物科技有限公司