專利名稱：：具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸涉及序列表本申請含有計算機可讀形式的序列表。將所述計算機可讀形式通過提述并入本文。發(fā)明背景發(fā)明領域本發(fā)明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關技術描述植物細胞壁多糖構(gòu)成植物細胞壁的90%并且能夠分成以下三組纖維素、半纖維素和果膠。纖維素是細胞壁多糖的主要成分。半纖維素是植物細胞壁中第二豐富的成分。主要的半纖維素聚合物是木聚糖。植物細胞壁中發(fā)現(xiàn)的木聚糖的結(jié)構(gòu)取決于它們的來源可能差異顯著，但是它們總是含有β-1，4-連接的D-木糖主鏈。β-1，4-連接的D-木糖主鏈能夠用多個側(cè)基取代，所述側(cè)基如L-阿拉伯糖(L-aribinose)、D-半乳糖、乙酰基、阿魏酰基(feruloyl)、對-香豆?；?p-coumaroyl)和葡糖醛酸殘基。木聚糖主鏈的生物降解依賴于兩類酶內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶。內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)將木聚糖主鏈切割成較小的寡糖，這些寡糖能夠進一步通過β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)降解成木糖。木聚糖的降解中涉及的其它酶包括，例如，乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和對-香豆酸酯酶。乙酰木聚糖酯酶(EC3.1.1.6)從乙酰木聚糖的β-D-吡喃木糖基殘基(β-D-xylopyranosylresidue)上的2位和/或3位去除0_乙?；Ｒ阴Ｄ揪厶窃谀揪厶堑乃庵邪l(fā)揮重要作用，因為所述乙酰側(cè)基能夠在空間上干擾切割主鏈的酶的接近。乙酰側(cè)基的去除促進內(nèi)切木聚糖酶的作用?；谛蛄邢嗨菩缘奶酋ッ阜诸愺w系產(chǎn)生了對13個家族的定義，其中的七個含有乙酰木聚糖酯酶(HenrissatB.，1991，Biochem.J.280309-316，及Henrissat禾口Bairoch，1996，Biochem.J.316:695-696)。本發(fā)明涉及來自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的乙酰木聚糖酯酶和編碼該多肽的多核苷酸。根據(jù)WO1995/002689已知來自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶(GENESEQPAAR63006)；然而，該酶和本發(fā)明的乙酰木聚糖酯酶并無顯著的同源性。根據(jù)EP507369已知來自黑曲霉(Aspergillusniger)的乙酰木聚糖酯酶(GENESEQP:AAR25291)。該酶與本發(fā)明的乙酰木聚糖酯酶80%相同。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及乙酰木聚糖酯酶，所述乙酰木聚糖酯酶具有SEQIDNO2中所示的氨基酸序列，5.0的pi和32.7Da的麗，且具體涉及具有與SEQIDNO2中公開的棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶同源或相同的氨基酸序列的乙酰木聚糖酯酶。在第一方面，本發(fā)明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分離的多肽，選自下組(a)一種多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少85%同一性的氨基酸序列；(b)一種由下述多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)一種由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有至少85%同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。在第二方面，本發(fā)明涉及包含編碼第一個方面的多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸。在第三方面，本發(fā)明涉及包含可操作地連接于一個或多個在表達宿主中指導所述多肽產(chǎn)生的調(diào)控序列的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。在第四方面，本發(fā)明涉及包含第三方面的核酸構(gòu)建體的重組表達載體。在第五方面，本發(fā)明涉及包含第三方面的核酸構(gòu)建體的重組宿主細胞。在第六方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生第一方面的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含下述核酸構(gòu)建體的宿主細胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。在第七方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生第一方面的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。在第八方面，本發(fā)明涉及經(jīng)編碼第一方面的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞。在第九方面，本發(fā)明涉及用于降解乙酰木聚糖的方法，包括用第一方面的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽處理包含乙?；哪揪厶堑牟牧?。在第10方面，本發(fā)明涉及包含第一方面的多肽和一種或多種其他選自如下的酶的組合物木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、葡聚糖酶、果膠酶、蛋白酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonas)和木聚糖酶。在第11方面，本發(fā)明涉及第一方面的多肽或第10方面的組合物用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝中的用途，所述工藝包括下述步驟(a)預處理含木素纖維素材料；(b)在纖維素分解酶和本發(fā)明的酶的存在下水解所述材料；(c)使用發(fā)酵微生物進行發(fā)酵。定義乙酰木聚糖酯酶活性術語“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定義為羧酸酯酶活性(EC3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆系哪揪厶?、乙?；咎?、乙?；咸烟恰⒁宜幡?萘酯(alpha-napthylacetate)禾口乙酸對石肖基苯酉旨(p—nitrophenylacetate)的水角軍。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是按照標題為“乙酰木聚糖酯酶活性的確定”的段落中所述的方法而確定的。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO2的成熟多肽的乙酰木聚糖酯酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。分離的多肽術語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，如通過SDS-PAGE測定的，所述多肽為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多肽術語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過如下實現(xiàn)通過公知的重組方法或通過經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術語“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最終形式存在的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸34-308。成熟多肽編碼序列術語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸136-963。同一性兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性由參數(shù)“同一性”來描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來測定。使用的可選參數(shù)是缺口打開罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性并且是如下計算的(相同的殘基XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和mmsch，1970，見上)來測定。使用的可選參數(shù)是缺口打開罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性并且是如下計算的(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))同源序列術語“同源序列”在本文中定義為用SEQIDN0:2的棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶、其成熟肽或其片段，在tfasty檢索(Pearson，W.R，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols，S.Misener和S.A.Krawetz編，185-219頁)中給出小于0.001的E值(或預期分數(shù))的預測蛋白質(zhì)?；蛘撸g語“同源序列”定義為與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性程度的具有乙酰木聚糖酯酶活性的氨基酸序列。當用于表征多核苷酸序列時，術語“同源序列”表明所述多核苷酸序列編碼其為“同源序列”的氨基酸序列。多肽片段術語“多肽片段”在本文定義為從SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個(數(shù)個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有乙酰木聚糖酯酶活性。在一個優(yōu)選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少200個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少215個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少230個氨基酸殘基。亞序列術語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的5'和/或3'端缺失了一個或多個(數(shù)個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少600核苷酸，更優(yōu)選至少650個核苷酸，并且最優(yōu)選至少700個核苷酸。等位變體(allelicvariant)術語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多核苷酸術語“基本上純的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制備物，其不含其它外來的或不期望的核苷酸，并且處于適合在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。cDNA:術語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術語核酸構(gòu)建體與術語“表達盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術語“調(diào)控序列”在本文定義為包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達所必需或有利的所有組分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等是易感的(susceptible)0修飾術語“修飾”在本文的意思是，對由SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼這樣的多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(數(shù)個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(數(shù)個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當用在本文時，術語“人工變體”的意思是具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(humanintervention)，通過修飾公開于SEQIDNO:1的多核苷酸序列或其同源序列來獲得。發(fā)明詳述具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度的氨基酸序列的分離的多肽，所述多肽具有乙酰木聚糖酯酶活性(下文稱為“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至308，或其等位變體；或它們的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體，或它們的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸1至308或其等位變體，或它們的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段組成。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選極低嚴格條件、更優(yōu)選低嚴格條件、更優(yōu)選中嚴格條件、更優(yōu)選中-高嚴格條件、甚至更優(yōu)選高嚴格條件、和最優(yōu)選非常高嚴格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)(i)或()的亞序列，或(iv)(i)、()或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch禾口T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可以編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。SEQIDNO1的核苷酸序列或其亞序列；以及SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段，可用于設計核酸探針，以根據(jù)本領域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的DNA。具體而言，可將這些探針用于根據(jù)標準的Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定并從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少14個，優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少35個，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長度上是至少100個核苷酸。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是優(yōu)選至少550個核苷酸，優(yōu)選至少600個核苷酸，甚至更優(yōu)選至少650個核苷酸，或最優(yōu)選至少700個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記用于檢測相應的基因(例如，用％pJH、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；它們的全長互補鏈；或其亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸136-963。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍栏裥詾?0%的甲酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預雜交和雜交最佳12至M小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選在45°C(非常低嚴格性)，更優(yōu)選在50°C(低嚴格性)，更優(yōu)選在55°C(中嚴格性)，更優(yōu)選在60°C(中-高嚴格性)，甚至更優(yōu)選在65°C(高嚴格性)，并且最優(yōu)選在70°C(非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計算得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,IXDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二S1I內(nèi)(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算得出的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及由如下多核苷酸編碼的具有乙酰木聚糖酯酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少85%，優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成，其編碼活性多肽。參見本文多核苷酸部分。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(或數(shù)個)氨基酸的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells，1989，ScienceM4:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，乙酰木聚糖酯酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.30959-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或W095/2^25公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利5，223，409號；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽如SEQIDNO2的氨基酸34-308的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關的術語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是具有乙酰木聚糖酯酶活性的革蘭氏陽性細菌多肽如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽；或具有乙酰木聚糖酯酶活性的革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)λt^i^^^ifelfS"(Bacillusamyloliquefaciens)、失豆Ii包If菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。本發(fā)明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選具有乙酰木聚糖酯酶活性的酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽；或更優(yōu)選具有乙酰木聚糖酯酶活性的絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、麥角菌屬(Clavic印s)、方寵孢腔菌屬(Cochliobolus)、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)>H耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霄屬(Humicola)、奉巴齒菌屬(Irpex)、香燕屬(Lentinula)>Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)(Piromyces)>Poitrasia>j[xllii|ifM(Pseudoplectania)>Pseudotrichonympha>根毛霉屬(Rhizomucor)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)>SfSIf^M(Tolypocladium)(Trichoderma)、Trichophaea^f^l^ifeM(Verticillium)、小包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威,廉抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霄(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霄(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革胃(Phanerochaetechrysosporium))^冑(Thielaviaachromatica)>Thielaviaalbomyces>Thielaviaalbopilosa^^yifl^ifil^(Thielaviaaustraleinsis)>Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana^^^(Thielaviaspededonium)>^^(Thielaviasetosa)>Thielaviasubthermophila、^(Thielaviaterrestris)>(^^7^(Trichodermaharzianum)>^tJ27^β(Trichodermakoningii)、^枝7^(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霄(Trichodermareesei)或參錄色木霄(Trichodermaviride)多肽。在一個更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的棘孢曲霉多肽，例如，包含SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的多肽。可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員會容易地識別適合的等同物的身份(identity)。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏機構(gòu)對于公眾能夠容易地取得，所述保藏機構(gòu)如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術是本領域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白質(zhì)釋放具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3568-76；Svetina，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-ffiIsonφ,1997,App1.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等，1995,Biotechnology13:498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基后通過因子fe蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25=505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989,ProteinsStructure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg后通過凝血酶切割Gtevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln后通過TEV蛋白酶切割Gtevens，2003，見上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln后通過遺傳工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由該核苷酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1或由SEQIDNO:1組成。在在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸37-963或由SEQIDNO:1的核苷酸37-963組成。本發(fā)明還涵蓋編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2或其成熟多肽的氨基酸序列，或由SEQIDNO:2或其成熟多肽的氨基酸序列組成；由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的SEQIDNO2的片段。本發(fā)明還涉及突變的多核苷酸，其在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變或由具有至少一個突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中突變的核苷酸序列編碼SEQIDNO2的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內(nèi)已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)。可以從梭胞殼屬菌株，或另外的或相關的生物體克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其組成，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少85%，更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多核苷酸編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95一107。對于本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領域公知的方法，如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上)來鑒定。在后一技術中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，并且測試所得突變分子的乙酰木聚糖酯酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上；Smith等，1992，見上；Wlodaver等，1992，見上)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴格條件下，優(yōu)選低嚴格條件，更優(yōu)選中嚴格條件，更優(yōu)選中-高嚴格條件，甚至更優(yōu)選高嚴格條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴格條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈，或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定義的。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發(fā)明還涉及通過如下獲得的分離的多核苷酸(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴格條件下，將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(數(shù)個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列指導編碼序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下的表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸用于多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調(diào)控序列可以是適當?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α_淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),\)JsRtac(DeBoer1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21—25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"TScientificAmerican，1980，242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見上中描述。用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(lihizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992Jeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可為信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，該信號肽編碼序列與編碼分泌多肽的編碼序列區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列為外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前(多)肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒旎钚远嚯??？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(數(shù)個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達本發(fā)明的多核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)谋磉_用調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)粒或兩個或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個(數(shù)個)選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase),sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。19為了自主復制，載體可以還包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質(zhì)粒復制子(r印licator)，其在細胞中發(fā)揮功能。術語“復制起點”或“質(zhì)粒復制子”在本文定義為能夠使質(zhì)粒或載體體內(nèi)復制的核苷酸序列。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米復制起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝，從而也含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上)。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，將所述重組宿主細胞有利地用于多肽的重組產(chǎn)生。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體引入宿主細胞從而將所述載體作為染色體整合體或作為自復制的染色體外載體保持，如前文所述。術語“宿主細胞”包含親本細胞的任何子代，其因為在復制過程中發(fā)生的突變而與該親本細胞不同。宿主細胞的選擇在很大程度上會依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是天藍色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5271—5278)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，R)liaMicrobiol,(praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，hfect.Immun.321295_1四7)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可使用將DNA引入宿主細胞的領域中已知的任何方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞。“真菌”用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi，第八版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢^(mitosporicfungi)(Hawksworth等’1995,)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個甚至更優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filikisidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。在一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFiffllif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、Ceriporiopsissubvermispora、B譽角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、粗金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngu)、土生梭孢霉、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞?？梢詫⒄婢毎ㄟ^涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194，182-187頁，AcademicPress，Inc.，NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細胞是青霉屬的。在一個更優(yōu)選的方面，所述細胞是Penicilliumaurantiogriseum0本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)如本文所述的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，所述多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，從而以可回收的量表達和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘撸瑯涌梢詫⒑性撝亟M多肽的植物或植物部分用于改進食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties)，或用于破壞抗營養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細胞質(zhì)(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如為了促進本發(fā)明的應用而分離的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)0同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細胞的子代。表達本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個(數(shù)個)表達構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞。表達載體方便地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該多核苷酸序列所需的適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構(gòu)建體可以包含對于鑒定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了表達構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對于組成性表達，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294,Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18:675-689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動子如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889)，來自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:9；35_941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術領域：
公知的任何其它種子特異性的啟動子，例如，在TO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology洸85-93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領域已知的常規(guī)技術并入植物基因組，所述常規(guī)技術包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉(zhuǎn)化、病毒介導的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293；Potrykus,1990，Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和khilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物其它的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994，CurrentOpinionBiotechnology5:158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology10667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-4所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領域熟知的方法選擇并入了表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這樣的多肽。術語“富含”表示所述組合物的乙酰木聚糖酯酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如，單組分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(p^tidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木毒ο可以依照本領域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途的實例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領域內(nèi)已知的方法確定。用途本發(fā)明還涉及使用具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽或其組合物的方法。本發(fā)明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可用于多種應用以通過用有效量的多肽(參見，例如W02002/18561)處理含乙酰木聚糖材料來降解或轉(zhuǎn)化所述含乙酰木聚糖材料。本發(fā)明的多肽優(yōu)選與其他木聚糖降解酶如木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶一同用于必須降解木聚糖的工藝中。作為脫?；磻暮蠊?，木聚糖變得更加易受木聚糖酶和其他木聚糖降解酶的作用。具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可用于多種應用體內(nèi)修飾含木聚糖的動物飼料以改善可消化性；由生物質(zhì)降解或轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖所得的用于產(chǎn)生例如燃料和/或飲用乙醇的一般應用；用于紙漿和紙脫木質(zhì)化中的處理助劑(processingaid)；用于紡織品的酶煮煉系統(tǒng)(enzymaticscouringsystem)的組分；食品應用，例如烘烤，與其他酶功能組合以改善烘烤商品的物理性質(zhì)；和與其他酶功能組合用于洗衣用洗滌劑(laundrydetergent)。26所述多肽可用于根據(jù)美國專利5，658，765號的供處理牛皮紙漿的方法。一般而言，用木聚糖酶處理牛皮紙漿以在紙產(chǎn)品的制備中去除木質(zhì)素。由于木聚糖的高乙?；潭?，當用乙酰木聚糖酯酶在木聚糖酶處理之前或同時處理紙漿時，木聚糖酶的有效性得到極大提高。所述多肽亦可用于根據(jù)美國專利5，658，765號的供產(chǎn)生木糖或木寡糖的工藝。所述多肽亦可用作根據(jù)美國專利6，245,546號的改善飼料可消化性以增加其利用效率的飼料增強酶。乙酰木聚糖酯酶在飼料中的使用可減少飼料組分的溶解度，從而減少其粘度并減少戊聚糖(pentosanes)的抗營養(yǎng)作用(anti-nutritionaleffect)。所述多肽亦可用于根據(jù)美國專利5，693，518號的烘烤。所述多肽還可用于根據(jù)W02002/24^6的釀造，其中該酶與其他酶的組合可用于降解生物細胞壁材料以在涉及制備果汁或啤酒的應用中增加可消化性或流體性質(zhì)(flowcharacteristics)0因此，本發(fā)明亦涉及用于降解乙?；揪厶堑姆椒ǎㄓ么朔N具有乙?；揪厶酋ッ富钚缘亩嚯奶幚戆鲆阴；揪厶堑慕M合物。在一個優(yōu)選的方面，用木聚糖降解酶進一步處理所述包含乙?；揪厶堑牟牧?。所述木聚糖降解酶可選自下組木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合。纖維素材料的加工本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括，用酶組合物在纖維素分解酶和本發(fā)明的酶的存在下處理纖維素材料。在一個優(yōu)選的方面，所述方法進一步包括回收經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)用纖維素分解酶組合物在本發(fā)明的酶的存在下糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料用纖維素分解酶組合物在本發(fā)明的酶的存在下糖化。在一個優(yōu)選的方面，所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個優(yōu)選的方面，所述方法進一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的酶可為去除或未去除細胞的粗發(fā)酵液的形式，或為半純化或純化的酶制劑的形式，或在使用生物質(zhì)的發(fā)酵工藝中所述組合物可包含本發(fā)明的宿主細胞作為本發(fā)明的酶的來源。本發(fā)明的方法可用于將纖維素材料糖化為可發(fā)酵的糖，并將可發(fā)酵的糖轉(zhuǎn)化為許多有用物質(zhì)，例如化學品和燃料。從纖維素材料產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明纖維素材料的加工可使用本領域常規(guī)工藝達成。而且，本發(fā)明的方法可使用配置為依照本發(fā)明操作的任何常規(guī)生物質(zhì)加工裝置實施。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟以首先將木素纖維素酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，木素纖維素的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵在一個步驟中組合(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan，J.，和Himmel，Μ.,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨水解步驟，所述步驟可以在同一個反應器中進行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度，S卩，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進行SSF。DMC在一個或多個步驟中組合了所有三個過程(酶產(chǎn)生、木素纖維素水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將木素纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd，L.R.，ffeimer,P.J.，vanZyl,W.H.,禾口Pretorius,I.S.,2002,Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本領域中任何已知的方法，包括預處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實施本發(fā)明的方法。常規(guī)設備包括補料批式攪拌反應器、批式攪拌反應器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應器和/或連續(xù)活塞流柱式反應器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin禾口IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33-38；Gusakov,A.V.,禾口Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反應器(Ryu,S.K.，和Lee，J.Μ.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65),或者具有由電磁場引起的強烈攪拌的反應器(Gusakov，Α.V.，Sinitsyn,Α.P.，Davydkin,I.y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應器類型包括流化床、升流層、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機型的反應器。預處理。在本發(fā)明的方法的實施中，可以使用本領域已知的任何預處理過程破壞植物細胞壁成分(Chandra等，2007，Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.10867-93；Galbe禾口Zacchi,2007,Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks禾口Zeeman,2009,Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.100:10-18；Mosier等，2005,Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.96:673-686；Taherzadeh禾口Karimi,2008,Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.ofMol.Sci.9:1621—1651;Yang禾口Wyman,2008,Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.226-40)。纖維素材料也可以在預處理之前使用本領域中已知的方法進行粒度減小、預浸泡、潤濕、洗滌或調(diào)節(jié)。常規(guī)的預處理包括但不限于，蒸汽預處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預處理、熱水預處理、堿性預處理、石灰預處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機溶劑預處理和生物預處理。其它預處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界H20、臭氧和Y輻射預處理?？梢栽谒夂?或發(fā)酵之前預處理纖維素材料。預處理優(yōu)選在水解前進行。或者，預處理可以與水解同時進行，如與用本發(fā)明的酶組合物同時處理纖維素材料以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預處理。在蒸汽預處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可以到達纖維素和其它部分，例如，半纖維素酶。將木素纖維素材料通過或穿過反應容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應時間。蒸汽預處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200°C，并且最優(yōu)選170-190°C進行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于任何化學催化劑的加入。蒸汽預處理的停留時間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時間依賴于溫度范圍和任何化學催化劑的加入。蒸汽預處理允許相對較高的固體加載量，使得纖維素材料在預處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預處理經(jīng)常與預處理后對物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff禾口Murray,1996，BioresourceTechnology8551-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628；美國專利申請No.20020164730)。在蒸汽預處理過程中，切割半纖維素乙?；鶊F，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成單糖和寡糖。去除木質(zhì)素至有限的程度。經(jīng)常在蒸汽預處理之前加入催化劑如或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可減少時間，降低溫度，增加回收率，并促進酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116509-523；Sassner等，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)?；瘜W預處理術語“化學處理“指能促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學處理。合適的化學預處理步驟的實例包括例如稀酸預處理、石灰預處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)和有機溶劑預處理。在稀酸預處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是吐504)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時間后閃變至大氣壓?？梢杂煤芏喾磻髟O計進行稀酸預處理，例如，活塞流式反應器、逆流反應器或連續(xù)逆流收縮床反應器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91:179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。還可以使用堿性條件下的幾種預處理方法。這些堿預處理包括，但不限于，石灰預處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85_150°C的低溫進行石灰預處理，停留時間從1小時到幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)WO2006/11089UW02006/110899,WO2006/110900和WO2006/110901公開了使用氨的預處理方法。濕法氧化是熱預處理，通常在180-220°C進行5_15分鐘，加入氧化劑如過氧化氫或過壓氧(Schmidt禾口Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen等，2004,Appl.Biochem.Biotechnol.1171-17；Varga^,2004,Biotechnol.Bioeng.88567-574;Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預處理以優(yōu)選1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)性5-20%干物質(zhì)進行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經(jīng)常會增加。濕氧化預處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預處理過程中，在一定的停留時間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預處理(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-100°C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨處理纖維素材料5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等，2007,Biotechnol.Bioeng.96219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX預處理導致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復合物得到切割。有機溶劑預處理通過用含水乙醇00-60%乙醇)在160_200°C提取30_60分鐘而將纖維素材料去木質(zhì)素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121219-230)。通常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，去除大部分半纖維素。合適的預處理方法的其他實例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:ρ·69-85，和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673_686，和美國專利公開申請2002/0164730所述。在一個方面，化學預處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的PH范圍內(nèi)進行。在一個方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸，更優(yōu)選0.05至IOwt%酸，甚至更優(yōu)選0.1至5wt%酸，并且最優(yōu)選0.2至2.Owt%酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料接觸，并在優(yōu)選160-220°C，和更優(yōu)選165-195°C范圍內(nèi)的溫度保持數(shù)秒到數(shù)分鐘，例如1秒-60分鐘的時間。在另一個方面，預處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預處理步驟)進行。在另一個方面，預處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預處理過程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)性30-60wt%，如約50wt%的量存在。預處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機械預處理術語“機械預處理”指各種類型的研磨或碾磨(例如，干磨、濕磨或振動球磨)。物理預處理術語“物理預處理”指促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何處理。例如，物理預處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。物理預處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個方面，高壓指優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi的壓力。在另一個方面，高溫指約100至300°C，優(yōu)選約140至235°C的溫度。在一個優(yōu)選的方面，機械預處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進行。組合的物理和化學預處理可以對纖維素材料進行物理和化學預處理。例如，預處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時進行物理和化學預處理。還可以包括機械預處理。因此，在一個優(yōu)選的方面，對纖維素材料進行機械、化學或物理預處理，或者它們的任何組合，以促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預處理術語“生物預處理”指可以促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預處理。生物預處理技術可以包括應用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,1996,Pretreatmentofbiomass，于HandbookonBioethanolProductionandUtilization，Wyman，C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh禾口Singh，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.App1.Microbiol.39295-333；McMillan，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction，Himmel,Baker禾口Overend編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington,DC，chapter15；Gong,Cao,Du禾口Tsao，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65:207-241；Olsson禾口Hahn-Hagerdal，1996，F(xiàn)ermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction，Enz.Microb.Tech.18312—331；禾口Vallander禾口Eriksson，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)0糖化。在水解(也稱作糖化)步驟中，將預處理的纖維素材料水解以將纖維素和任選地也將半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或可溶的寡糖。水解用酶組合物在本發(fā)明的酶存在下以酶法進行。所述組合物可進一步包含一種或多種半纖維素分解酶。組合物的酶還可以順序加入。酶水解優(yōu)選在易于由本領域技術人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進行。在一個優(yōu)選的方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最優(yōu)的條件下進行。水解可以以補料批式或連續(xù)的工藝進行，其中將預處理的纖維素材料(底物)逐漸補入，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進行。合適的處理時間、溫度和PH條件可以由本領域技術人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長達200小時，但是通常優(yōu)選進行約12至約168小時，更優(yōu)選約M至約120小時，并且最優(yōu)選約48至約72小時。溫度優(yōu)選約40°C至約70°C，更優(yōu)選約45°C至約65°C，并且最優(yōu)選約3150°C至約60°C，特別是約55°C。pH優(yōu)選約3至約9，更優(yōu)選約3.5至約8，更優(yōu)選約4至約7，并且最優(yōu)選約4.5至約6，特別是約pH5。干燥固體含量優(yōu)選約1至約50wt%，更優(yōu)選約5至約40wt%，更優(yōu)選約10至約30wt%，并且最優(yōu)選約15至約25wt%。除本發(fā)明的酶之外，所述組合物的纖維素分解酶成分優(yōu)選是具有內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶與β-葡糖苷酶活性的酶。在一個優(yōu)選的方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一個優(yōu)選的方面，所述纖維素分解酶制備物另外或甚至還包含一種或多種其他選自下組的酶活性半纖維素酶，酯酶(例如，脂肪酶，磷脂酶和/或角質(zhì)酶)，蛋白酶，漆酶，過氧化物酶或其混合物。在本發(fā)明的方法中，所述其他酶可在發(fā)酵之前或之中添加，包括在發(fā)酵微生物繁殖過程中或之后添加。所述酶可源自或獲得自任何合適的來源，包括細菌，真菌，酵母，植物或哺乳動物來源。在本文中術語“獲得”意指該酶可分離自天然產(chǎn)生該酶作為天然酶的生物。在本文中術語“獲得”亦意指所述酶可為在宿主生物中使用本文所描述的方法重組產(chǎn)生的，其中所述重組產(chǎn)生的酶對于所述宿主生物可為天然的或外源的，或具有經(jīng)修飾的氨基酸序列，例如，缺失，插入和/或取代了一個或多個氨基酸，亦即，該重組產(chǎn)生的酶其為天然氨基酸序列的突變體和/或片段，或者其為通過本領域已知的核酸改組過程(nucleicacidshufflingprocess)產(chǎn)生的酶。天然酶含意所涵蓋的范圍包含天然變體，而外源酶含意所涵蓋的范圍包含重組獲得的變體，例如，通過定位誘變或改組得到的變體。用于本發(fā)明中的酶可為任何適用于本文所描述的方法中的形式，例如，有或無細胞的粗發(fā)酵培養(yǎng)液，或基本上純的多肽。所述酶可為干粉或顆粒，液體，穩(wěn)定化的液體或受保護的酶。液體酶制備物可例如通過添加穩(wěn)定劑例如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或另一有機酸根據(jù)已經(jīng)建立的過程加以穩(wěn)定化。酶和具有纖維素分解增強活性的多肽的最適量取決于幾個因素，其包括但不限于，組分纖維素分解酶的混合物、含纖維素底物、含纖維素底物的濃度、含纖維素底物的預處理、溫度、時間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個優(yōu)選的方面，纖維素分解酶對于纖維素材料的有效量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，并且最優(yōu)選約2.5至約IOmg每g纖維素材料。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽對于纖維素材料的有效量是約0.01至約50.Omg,優(yōu)選約0.01至約40mg，更優(yōu)選約0.01至約30mg，更優(yōu)選約0.01至約20mg，更優(yōu)選約0.01至約10mg，更優(yōu)選約0.01至約5mg，更優(yōu)選約0.025至約1.5mg,更優(yōu)選約0.05至約1.25mg,更優(yōu)選約0.075至約1.25mg,更優(yōu)選約0.1至約1.25mg,甚至更優(yōu)選約0.15至約1.25mg,并且最優(yōu)選約0.25至約1.Omg每g纖維素材料。在本發(fā)明的方法中，所述解酶組合物可包含任何參與將含纖維素材料加工為葡萄糖，或?qū)肜w維素加工為木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、其聚合物、或如下所述由其衍生的產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。在一個方面，所述酶組合物包含一種或多種選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。在另一方面，所述纖維素分解酶組合物另外還或甚至還包含一種或多種其他的酶活性以改進含纖維素材料的降解。優(yōu)選的其他酶為木聚糖酶、半纖維素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角質(zhì)酶)、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或其混合物。所述解酶組合物可為單組分制備物，例如，內(nèi)切葡聚糖酶，可為多組分制備物，例如，內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶，或多組分和單組分蛋白質(zhì)制備物的組合。所述纖維素分解蛋白可具有活性，亦即，可于酸性、中性或堿性PH范圍水解所述含纖維素材料。所述酶組合物的一個或多個組分可為重組組分，亦即，通過克隆編碼單一組分的DNA序列，并隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細胞并在宿主中表達來產(chǎn)生(參見，例如，W091/17243和W091/17244)。所述宿主優(yōu)選為異種宿主(酶對宿主是外源的)，但在一些情況下所述宿主亦可為同種宿主(酶對宿主是內(nèi)源的)。單組分纖維素分解蛋白亦可通過從發(fā)酵液中純化上述蛋白質(zhì)來制備。用于本發(fā)明中的酶可為任何適用于本文所述工藝的形式，如例如，有或無細胞的粗發(fā)酵液、干粉或顆粒、液體、穩(wěn)定化的液體或受保護的酶。液體酶制備物可，例如，通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或另一種有機酸根據(jù)已經(jīng)確立的方法加以穩(wěn)定化。具有纖維素分解酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是具有纖維素分解酶活性的革蘭氏陽性細菌多肽如芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬多肽；或具有纖維素分解酶活性的革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或脲原體屬多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌多肽。本發(fā)明具有纖維素分解酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選具有纖維素分解酶活性的酵母多肽如念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽；或更優(yōu)選具有纖維素分解酶活性的絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬、傘菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、Botryospaeria、擬蠟菌屬、毛喙殼屬、金孢子菌屬、麥角菌屬、旋孢腔菌屬、鬼傘屬、Coptotermes、棒囊殼屬、隱叢赤殼菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、Filikisidium、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲屬、腐質(zhì)霉屬、耙齒菌屬、香菇屬、Leptospaeria,梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、Pseudotrichonympha,根毛霉屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、Trichophaea、輪枝孢屬、小包腳菇屬或炭角菌屬多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiummops、粗金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀鍵孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、白耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、無色梭孢殼、Thielaviaalbomyces,Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢殼、Thielaviafimeti、小孢梭孢殼、卵孢梭孢殼、ThielaviaThielaviasubthermophila、_zht—ife_、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木霉或iTrichophaeasaccata多肽。亦可使用經(jīng)化學修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的纖維素分解蛋白的突變體。適用于本發(fā)明的商業(yè)性的纖維素分解蛋白制備物的實例包括，舉例而言，CELLICCtec2(NovozymesA/S),CELLUCLAST(NovozymesA/S)和NOVOZYM188(NovozymesA/S)。其它包含纖維素酶的可以使用的商業(yè)上可得到的制備物包括CELLUZYME、CEREFL0和ULTRAFLO(NovozymesA/S)，LAMINEX和SPEZYMECP(GenencorInt.),R0HAMENT7069W(RohmGmbH)以及FIBREZYMELDI、FIBREZYMELBR或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.，Jupiter，F(xiàn)L，USA)。所述纖維素酶以固體的約0.001%到約5.0%wt.，更優(yōu)選固體的約0.025%到約4.0%wt.，且最優(yōu)選固體的約0.005%到約2.0%wt.的有效量添加。可以用于本發(fā)明的方法的細菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(WO91/05039；W093/15186；美國專利5,275,944；WO96/02551；美國專利5，536，655，W000/70031,WO05/093050)；Thermobififusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)；和Thermobififusca內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263；GENBANK登錄號M15665)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22;GENBANK登錄號M19373)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANK登錄號AB003694)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249584-591；GENBANK登錄號Y11113)；以及里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219-2;GENBANK登錄號Z33381)；棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995,CurrentGenetics27=435-439)；胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14)；尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號L29381)；灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號MAL515703)；粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號XM_324477)；特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V；嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶；擔子菌綱(basidiomycete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶；擔子菌綱CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8U6CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133號內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號M15665)?？捎糜诒景l(fā)明的方法的纖維二糖水解酶的示例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶I；里氏木霉纖維二糖水解酶II；特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II、土生梭孢霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)、嗜熱毛殼(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I以及嗜熱毛殼纖維二糖水解酶II?？捎糜诒景l(fā)明的方法的葡糖苷酶的實例包括但不僅限于米曲霉葡糖苷酶；煙曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶;黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根據(jù)WO2002/095014獲取。具有β-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可根據(jù)WO2005/047499獲取。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根據(jù)WO2007/019442獲取。具有β_葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲取。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根據(jù)Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲取。所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一個方面，所述β-葡糖苷酶是根據(jù)WO2008/057637獲取的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。其它內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶公開于許多使用根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino—acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316禾口HenrissatB.,andBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696的分類法的糖基水解酶家族中。其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于EP495，257、EP531，315、EP531,372、WO89/09259、WO94/07998、WO95/24471、WO96/11262、W096/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、W02000/009707,WO2002/050245、WO2002/0076792,WO2002/101078,W02003/027306,WO2003/052054,WO2003/052055,WO2003/052056,W02003/052057,WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、W02004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050,W02005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432、WO2007/071818、W02007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國專利4，435，307、美國專利5，457，046、美國專禾Ij5，648，263、美國專利5，686，593、美國專利5，691，178、美國專利5，763，254以及美國專利5，776，757。適用于本發(fā)明的商業(yè)性木聚糖降解酶制備物的實例包括，例如SHEARZYME(NovozymesA/S)、CELLICHtec(NovozymesA/S)、VISCOZYME(NovozymesA/S)>ULTRAFLO(NovozymesA/S)>PULPZYMEHC(NovozymesA/S)、MULTIFECTXylanase(Genencor)、ECOPULPTX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM),DEP0L333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK),DEPOL740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)和DEPOL762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)可用于本發(fā)明方法的木聚糖酶的實例包括但不限于棘孢曲霉木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790；WO94/21785)、煙曲霉木聚糖酶(W02006/078256)和土生梭孢霉NRRL8126木聚糖酶(W02009/079210)?？捎糜诒景l(fā)明方法的木糖苷酶的實例包括但不限于里氏木霉木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號Q92458)，埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登錄號Q8X2U)和粗糙脈孢菌(SwissProt登錄號Q7S0W4)。可用于本發(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實例包括但不限于紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(W02005/001036)、粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登錄號q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(W02009/042846)、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q2GWX4)、細麗毛殼菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GenekqP登錄號AAB821M)、穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q0UHJ1)和特異腐質(zhì)霉DSM1800乙酰木聚糖酯酶(W02009/073709)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)、粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號Q9HGR3)和費希新薩托菌(Neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號A1D9T4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶(GenekqP登錄號AAR94170)。可用于本發(fā)明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實例包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號alccl2)、里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q990M)、埃默森踝節(jié)菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q0CJP9)和煙曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q4WW45)。用于本發(fā)明方法的纖維素分解酶和蛋白可通過在含有合適碳源和氮源和無機鹽，使用本領域已知方法(參見，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上發(fā)酵上述指出的微生物菌株來產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應商獲得，或可根據(jù)已公開組合物制備(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長和纖維素分解酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領域是已知的(參見，例如Bailey，J.Ε.和Ollis，D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為纖維素分解酶表達或分離的培養(yǎng)細胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述纖維素分解酶得以表達或分離的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，或在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的纖維素分解酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。皿得自所述經(jīng)預處理與水解的纖維素材料的可發(fā)酵的糖可由一種或多種能夠?qū)⑺鎏侵苯踊蜷g接發(fā)酵為所期望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物進行發(fā)酵?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵工藝”指任何發(fā)酵工藝或任何包含發(fā)酵步驟的工藝。發(fā)酵工藝亦包括用于醇類消費品工業(yè)(例如，啤酒與葡萄酒)、乳制品工業(yè)(例如，發(fā)酵的乳產(chǎn)品)、皮革工業(yè)與煙草工業(yè)的發(fā)酵工藝。發(fā)酵條件取決于所期望的發(fā)酵產(chǎn)物以及發(fā)酵生物，且可由本領域技術人員容易地確定。在所述發(fā)酵步驟中，作為預處理與酶水解步驟的結(jié)果自所述纖維素材料釋放的糖由發(fā)酵生物(如酵母)發(fā)酵為產(chǎn)物，例如乙醇?？煞謩e或同時進行水解(糖化)與發(fā)酵。上述方法包括但不限于，分別水解與發(fā)酵(SHF)；同時糖化與發(fā)酵(SSF)；同時糖化與共發(fā)酵(SSCF)；混合水解與發(fā)酵(HHF)；SHCF(分別水解與共發(fā)酵)；HHCF(混合水解與發(fā)酵)，以及直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。在本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇底物，如本領域中所公知。適用于本發(fā)明的方法的底物的實例包括纖維素材料，如木材或植物殘余物或從經(jīng)加工的纖維素材料獲得的低分子糖DP1-3，其可由發(fā)酵微生物代謝，并可通過直接添加至發(fā)酵介質(zhì)來提{共。術語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基。“發(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(；和/或C5發(fā)酵生物體，或它們的組合。C6和C5發(fā)酵生物體均在本領域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成理想的發(fā)酵產(chǎn)品。可產(chǎn)生乙醇的細菌和真菌發(fā)酵生物體的實例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實例包括細菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實例包括細菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬(Pichia)，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，如運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)；漢遜酵母屬(Hansenula)，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)；克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母(K.fragilis)；裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大腸桿菌的菌株，特別是已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而改進乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌菌株。在一個優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)0在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是假絲酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是Clavisporaopuntiae。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolentarmophilus)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretarmomyces)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis，G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細菌包括，例如，運動發(fā)酵單胞菌和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis,1996，見上文)。在一個優(yōu)選的方面，細菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面，細菌是運動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，細菌是梭菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ETHANOLRED酵母(可從RedStar/Lesaffre，USA獲得)、FALI(可從Fleischmann，sYeast,BumsPhilpFoodInc.,USA的部門獲得)、SUPERSTART和THERMOSACC新鮮酵母(可從KhanolTechnology,WI,USA獲得)、BIOFERMAFT和XR(可從NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA，USA獲得)、GERTSTRAND(可從GertStrandAB，Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen禾口Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPiichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae，App1.Biochem.Biotechnol.39-40135-147；Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,App1.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter禾口Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,App1.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple，F(xiàn)EMSYeastResearch4655-664；Beall1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoliBiotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilistrainbymetabolicpathwayengineering，App1.Environ.Microbiol.62:4465-4470)。在一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)0本領域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向降解的木素纖維素或水解物加入發(fā)酵微生物，并進行約8至約96小時，如約M至約60小時發(fā)酵。溫度通常為約至約60°C，特別是約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，如約pH4-5、6或7。在一個優(yōu)選的方面，對降解的木素纖維素或水解物施用酵母和/或另一種微生物，并進行約12至約96小時，如通常為M-60小時發(fā)酵。在一個優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，特別是約32°C或50°C，并且pH通常為約pH3至約pH7，優(yōu)選約pH4_7。然而，一些例如細菌發(fā)酵生物體，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-IO12,優(yōu)選約IO7-IOltl,特別是約^clO8活細胞計數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關于使用酵母進行發(fā)酵的進一步指導可以在例如"TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,Τ.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中找到，其通過提述并入本文。本領域最廣泛應用的工藝是同時糖化和發(fā)酵(SSF)工藝，其中對于糖化無保持階段(holdingstage)，意指酵母和所述酶一同添加。對于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵后蒸餾漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何酶法工藝組合使用，以進一步改進發(fā)酵工藝，而且特定地，改進發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D禾口E。參見,例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess，Springer-Verlag(2002)，其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇。可理解的是，術語“醇”涵蓋包含一個或多個羥基基團的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3_丙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,禾口Tsao,G.Τ.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,Μ.Μ.,禾口Jonas,R.,2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam,P.,禾口Singh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124；Ezeji,T.C.,Qureshi,N.禾口Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603o在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是有機酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是反丁烯二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen，R.，禾口Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435_4480在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是酮。可理解的是術語“酮”包括含有一個或多個酮基的物質(zhì)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek，2003，見上文。在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard，A.，禾口Margaritis，A.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7)41-47；禾口GunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。■可以使用本領域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達約96ν01%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。乙酰木聚糖酯酶活性的確定乙酰木聚糖酯酶活性是使用乙酸對硝基苯酯(SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0,USA)作為底物確定的。稀釋樣品酶制備物以提供少于15%的乙酸對硝基苯酯的轉(zhuǎn)化，即在1.5ml微離心管中用50mM乙酸鈉pH5.O制備550倍的起始稀釋，然后用50mM乙酸鈉PH5.0進行2倍系列稀釋。然后將100μ1稀釋酶的等分試樣轉(zhuǎn)移至96孔板的孔中。乙酸對硝基苯酯的儲液是通過將對乙酸對硝基苯酯溶解于二甲亞砜(DMSO)以構(gòu)成0.IM溶液來制備的。在測定之前，將儲液樣品在50mM乙酸鈉ρΗ5.0中稀釋100倍以制備ImM溶液。將100μ1體積的ImM乙酸對硝基苯酯與該酶的每個稀釋相混合，然后在25°C溫育10分鐘。運行底物自身、酶自身和緩沖液自身作為對照。0.25,0.2,0.1、0.05和0.02mM的對硝基苯酚標準溶液是通過將IOmM儲液在50mM乙酸鈉pH5.0中稀釋來制備的。在10分鐘，將50μ11.OMTriS-HClρΗ8.0緩沖液添加至每個孔(包括樣品、底物對照、酶對照、試劑對照和標準)，混合，并立即在例如SPECTRAMAX340PC平板讀數(shù)器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)上測量在405nm處的吸光度。一個單位的乙酰木聚糖酯酶活性定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放Iymol對硝基苯酚陰離子的酶量。實施例測定法乙酰木聚糖酯酶測定法為了測定AXE活性，將20μ1的培養(yǎng)液添加至測定緩沖液中的ImM乙酸對硝基苯酯(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)，并在37°C溫育15分鐘。通過添加2MTRIS緩沖液pH8.0中止反應，并通過測量405nm處的吸光度來即時監(jiān)測對硝基苯基的釋放。培養(yǎng)基和緩沖液FG4P培養(yǎng)基成分去月旨的大豆粉(soyflour,degreased)麥芽糊精BactoTMPeptone(DifcoLaboratories)KH2PO4DowfaxTM63N10(DowChemicalCo.)量/升30g15g5g15g0.2ml測定緩沖液50mM磷酸50mM乙酸50mM硼酸50mMKClImMCaCl20.01%TritonX-IOOpH調(diào)整至6.O乙酸對硝基苯酯儲液IOOmM溶解于DMSO的乙酸對硝基苯酯在4°C儲藏并在即將使用之前稀釋實施例1.表達來自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶為了獲得用于測試來自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶的材料，克隆了來自SEQIDNO1的DNA序列，并將其在米曲霉中表達?？蓮腉ENEARTAG(Regensburg,Germany)或類似的DNA合成供應商定購合成的DNA構(gòu)建體，其包含SEQIDNO=I的編碼部分，其中Kozak序列“TCACC”添加至緊接著起始密碼子的5’，以及適當?shù)南拗菩晕稽c例如BamHI和B10I分別添加至5’和3’端以協(xié)助亞克隆至曲霉表達載體。將合成的基因片段亞克隆至適當?shù)那贡磉_載體，例如pMMr57(TO04/03^48)，并可對所得的曲霉屬表達構(gòu)建體進行測序以確證該序列完全與SEQIDNO=I的編碼序列一致。用所述表達構(gòu)建體根據(jù)Christensen等，1988，Biotechnology6，1419-1422和WO04/03沈48所述的實驗方案轉(zhuǎn)化適當?shù)拿浊贡磉_宿主，例如BECh2(W000/39322)。為了鑒定產(chǎn)生重組AXE的轉(zhuǎn)化體，將所述轉(zhuǎn)化體和BECh2在合適的培養(yǎng)基中，例如在500ml搖瓶中的100mlTO4P培養(yǎng)基中在30°C和200RPM培養(yǎng)4日，并就重組的乙酰木聚糖酯酶產(chǎn)生進行測定。為了測定AXE活性，將20μ1的培養(yǎng)液添加至ImM測定緩沖液中的乙酸對硝基苯酯(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)，并在37°C溫育15分鐘。通過添加2MTRIS緩沖液pH8.0中止反應，并通過測量405nm處的吸光度立即監(jiān)測對硝基苯基的釋放?；谠摻Y(jié)果，選擇了這些轉(zhuǎn)化體之一，并將其在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵以提供用于純化的材料。實施例2.表達來自黑曲霉的乙酰木聚糖酯酶克隆了在US6，010，892中作為SEQIDNO:7描述的來自黑曲霉的最接近的現(xiàn)有技術乙酰木聚糖酯酶，并將其在黑曲霉中表達。為了獲得該基因，從GENEARTAG(Regensburg，Germany)定購了合成的DNA構(gòu)建體，其包含來自US6，010，892的SEQIDNO7的編碼序列，其中Kozak序列“TCACC”添加至緊接著起始密碼子的5’，以及適當?shù)南拗菩晕稽c例如BamHI和B10I分別添加至5’和3’端以協(xié)助亞克隆至曲霉表達載體。將所述BamHI-XhoI合成基因片段亞克隆至曲霉表達載體pMStr57(W004/032648)，并可對所得的曲霉表達構(gòu)建體pMMr201進行測序。該序列完全與來自US6，010,892的SEQIDNO7的編碼序列一致。用pMStr201根據(jù)Christensen等，1988，Biotechnology6，1419-1422和恥04/032648所述的實驗方案轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株1^化118(1004/090155)。為了鑒定產(chǎn)生重組AXE的轉(zhuǎn)化體，將所述轉(zhuǎn)化體和MBinl18在500ml搖瓶中的IOOml的TO4P培養(yǎng)基中在30°C和200RPM培養(yǎng)4日，并就重組的乙酰木聚糖酯酶產(chǎn)生進行測定。為了測定AXE活性，將20μ1的培養(yǎng)液添加至ImM測定緩沖液中的乙酸對硝基苯酯(Sigma-AldrichAt.Louis,MO,USA)，并在37°C溫育15分鐘。通過添加2MTRIS緩沖液pH8.0中止反應，并通過測量405nm處的吸光度立即監(jiān)測對硝基苯基的釋放?；谠摻Y(jié)果，選擇了這些轉(zhuǎn)化體之一，命名為MStr362，并將其如上所述在TO4P培養(yǎng)基中發(fā)酵以提供用于純化的材料。_仿丨丨3·艦先棘謹IS將在米曲霉中如實施例1中所述表達的來自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶從發(fā)酵上清純化。將發(fā)酵上清滅菌過濾，并調(diào)整至1摩爾硫酸銨的終濃度，并將PH調(diào)整至7。將50ml柱用苯基Sepharose(Pharmacia/NowGE-healthcare)±真充，并用含有IM硫酸銨的50mM磷酸鹽平衡，且pH為7。將發(fā)酵上清加載于苯基kpharose柱上，并用含有IM硫酸銨的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合的物質(zhì)。洗滌柱直至^Onm處的UV吸光度低于0.05。用50%乙醇洗脫結(jié)合的蛋白。透析洗脫的蛋白，并將電導率調(diào)整為低于2MSi且pH為7。將在50mlQS印harose柱上的陰離子交換(Pharmacia/nowGEHealthcare)用50mMTris乙酸pH7緩沖液平衡。將來自苯基kpharose的經(jīng)透析的洗脫物加載于QSepharose柱上。用50mMTris乙酸緩沖液pH7洗去未結(jié)合的物質(zhì)。將結(jié)合的蛋白使用含有0.5MNaCl的50mMTris乙酸緩沖液pH7使用線性鹽梯度以10個柱體積洗脫。使用SDS-PAGE檢查純度，并通過質(zhì)譜法確定分子量。N端通過Edman降解確定。實施例4.純化來自黑曲霉的乙酰木聚糖酯酶為了減少顏色，將如實施例2中所述獲得的發(fā)酵上清在純化之前使用SartoriusUFIOkDa膜過濾/緩沖液交換。最終體積為800mL并使用HOAc將pH調(diào)整至4.4。步驟1使用具有固定相為XpressLineProA(Upfront,Copenhagen,Denmark)的70mL柱純化樣品。使用50mMHOAcpH4.4洗滌樣品直至吸光度低于0.05，之后使用50mMHEPES，PH7.5洗脫蛋白。使用活性測定(如實施例2中所述)以鑒定含有AXE活性的級分，然后將其匯集以供進一步純化。步驟2使用具有固定相為Source15Q(GEHealthcare，Uppsala，Sweden)的20mL柱純化來自步驟1的樣品。使用20mMHEPESpH7.5洗滌樣品直至吸光度低于0.05，然后使用50mMHEPES+IMNaCl，pH7在400mL中以線性鹽梯度洗脫蛋白。同樣，使用上述活性測定以鑒定含有AXE活性的級分，然后將其匯集以供進一步純化。步驟3<吏用具有固定才目為ButylToyopearl(TosohBioscience,Stuttgart,Germany)的60mL柱純化樣品。將1.8MNH40Ac,ρΗ7·5添加至樣品。使用1.8MNH40Ac,ρΗ7·5洗滌樣品直至吸光度低于0.05，然后使用20mMHEPES,pH7.5以不連續(xù)梯度然后是20mMHEPES,pH7.5+50%EtOH以不連續(xù)梯度洗脫蛋白。_仿丨丨5.膽MZJ先棘謹船千·誦側(cè)比較并衡量了棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶和黑曲霉乙酰木聚糖酯酶對經(jīng)處理的玉米纖維水解的作用。玉米纖維是來自玉米仁(cornkernel)濕磨的級分。玉米纖維是種皮和在去除淀粉并進一步加工之后留下的殘余胚乳。通過在140°C高壓處理(autoclave)150分鐘來預處理玉米纖維。使用下述方法，將底物中理論上阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的量確定為114、302和204g每kg干物質(zhì)。阿拉伯糖和木糖通過使用稀鹽酸進行糖水解來加以確定。將經(jīng)預處理的玉米纖維轉(zhuǎn)移至125ml錐形瓶中，并稀釋至含有約10%的干物質(zhì)。將所得玉米纖維樣本在油浴中在100°C預加熱。通過添加5ml的2M鹽酸在100°C處理2小時來開始水解。在溫育后，將所述燒瓶在冰上冷卻，并以4M氫氧化鈉中和。用MINISART0.2微米注射器式濾器(SartoriusAG.Goettingen,Germany)過濾樣本，并在DIONEXBIOLC系統(tǒng)(DionexCorporation,Sunnyvale,CA,USA)上分析阿拉伯糖和木糖。通過對所述經(jīng)預處理的玉米纖維樣本進行兩步硫酸水解來進行確定葡萄糖。將三ml的72%硫酸添加至壓力管(AceGlass,Inc.，Vineland,NJ,USA)中大約300mg的干玉米纖維中。將樣本混合并置于30°C水浴中60分鐘。每5到10分鐘攪拌樣本。在60分鐘后，移除所述樣本，并添加8細1的去離子水。將樣本置于高壓滅菌器中，并在121°C加熱1小時。在冷卻后，將所述樣本過濾以去除殘余的固體，并通過添加碳酸鈣進行中和。用DIONEXBIOLC系統(tǒng)根據(jù)下述方法確定葡萄糖濃度。將樣本(10μ1)加載到裝有與CARB0PACPAl保護柱0x50mm)(DionexCorporation,Sunnyvale,CA,USA)組合的DIONEXCARB0PACPAl分析柱(4x250mm)(DionexCorporation,Sunnyvale,CA,USA)的DIONEXBIOLC系統(tǒng)。單糖用IOmM氫氧化鉀以每分鐘Iml的流速進行等度分離，并通過處于脈沖安培測量模式(pulsedamperiometriemode)的脈沖電化學檢測器(pulsedelectrochemicaldetector)進行檢測。電極的電勢經(jīng)程序設計為+0.1伏特(t=0-0.4秒)到-2.0伏特(t=0.41-0.42秒)到0.6伏特(t=0.43秒)以及最終-0.1伏特(t=0.44-0.50秒)，而將所得信號自t=0.2-0.4秒進行積分。阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的混合物(每種組分的濃度每升0.0050-0.075g)用作標準物。用里氏木霉纖維素分解蛋白質(zhì)組合物(包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱霉(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽和米曲霉β-葡萄糖苷酶融合物的里氏木霉培養(yǎng)液；W02008/151079(PCT/US2008/065417))和里氏木霉β-木糖苷酶來進行經(jīng)預處理的玉米纖維的水解。通過如Rasmussen等，2006，BiotechnologyandBioengineering94:869-876所述的使用米曲霉標準培養(yǎng)方法在米曲霉中表達來重組獲得里氏木霉β-木糖苷酶。所述棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶可如實施例1所述獲得。所述黑曲霉乙酰木聚糖酯酶如實施例2所述獲得。所述經(jīng)預處理的玉米纖維的水解在2mlEPPENDORF管(EppendorfAG,Germany)中在50°C的溫度和5.O的pH在50mM琥珀酸中進行。將樣本在THERMOMIXERComfort(EppendorfAG,Germany)中溫育，其對每個樣本進行不斷加熱和混合。使用的底物量為在2ml的總樣本體積中的2.5w/w%。除添加所述里氏木霉纖維素分解蛋白質(zhì)組合物和里氏木霉β-木糖苷酶外，將所述棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶和黑曲霉乙酰木聚糖酯酶以每g干物質(zhì)Img酶的酶加載量添加。所述里氏木霉纖維素分解蛋白質(zhì)組合物以每g干物質(zhì)5mg酶的加載量添加，而里氏木霉β-木糖苷酶以每g干物質(zhì)Img酶的加載量添加。在24小時后通過在加熱塊(TechneInc.，BurlingtonNJ，USA)中將所述樣本在100°C加熱10分鐘來終止水解。使用下述公式通過確定自所述底物釋放的糖量占起始時添加的糖量的百分比來計算轉(zhuǎn)化率。用樣本數(shù)據(jù)的等方差(equalvariance)和雙尾(two-tailed)分布來進行T-檢驗。轉(zhuǎn)化率(％)=(水解物中的糖量/添加的底物中的糖量)χ100將經(jīng)預處理的玉米纖維當以每克干物質(zhì)Img的酶的酶加載量添加棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶連同每克干物質(zhì)Img酶的里氏木霉β-木糖苷酶和每克干物質(zhì)5mg酶的里氏木霉纖維素分解蛋白質(zhì)組合物時的轉(zhuǎn)化率，與僅添加每克干物質(zhì)Img酶的來自里氏木霉的β-木糖苷酶和每克干物質(zhì)5mg酶的里氏木霉纖維素分解蛋白質(zhì)組合物時的轉(zhuǎn)化率進行比較，顯示相對轉(zhuǎn)化率由100.O顯著(p(0.000007)增加為140.5(表1)。表權利要求1.一種具有乙酰木聚糖酯酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)一種多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85%同一性的氨基酸序列；(b)一種由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)一種由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少85%同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(數(shù)個)氨基酸的變體。2.權利要求1的多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈。3.權利要求1或2任一項的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO1的核苷酸序列或其編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亞序列或由SEQIDN0:1的核苷酸序列或其編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亞序列組成。4.權利要求1至3中任一項的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO1的核苷酸136至963或由SEQIDNO1的核苷酸136至963組成。5.權利要求1至4中任一項的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。6.權利要求1至5中任一項的多肽，其中所述多肽為SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。7.權利要求1至6中任一項的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸34至308。8.權利要求1至7中任一項的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸136至963。9.一種分離的多核苷酸，包含編碼權利要求1至8中任一項的多肽的核苷酸序列。10.一種核酸構(gòu)建體，包含可操作地連接于一個或多個在表達宿主中指導所述多肽產(chǎn)生的調(diào)控序列的權利要求9的多核苷酸。11.一種重組表達載體，包含權利要求10的核酸構(gòu)建體。12.—種重組宿主細胞，包含權利要求10的核酸構(gòu)建體。13.—種產(chǎn)生權利要求1至8中任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。14.權利要求9的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:1的核苷酸136至963，或同源序列。15.一種產(chǎn)生權利要求1至8中任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。16.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，其經(jīng)編碼權利要求1至8中任一項的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。17.一種用于降解乙酰木聚糖的方法，包括用權利要求1至8中任一項具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽處理包含乙?；揪厶堑牟牧稀?8.權利要求17的方法，進一步包括用木聚糖降解酶處理所述包含乙?；揪厶堑牟牧?。19.權利要求17或18的方法，其中所述木聚糖降解酶選自下組木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合。20.權利要求17至19中任一項的方法，其中所述包含乙?；揪厶堑牟牧鲜莿游镲暳?。21.權利要求17至20中任一項的方法，其中所述包含乙?；揪厶堑牟牧鲜桥Ｆぜ垬S(Kraftpulp)。22.權利要求17至21中任一項的方法，其中所述包含乙?；揪厶堑牟牧鲜抢w維素或木素纖維素生物質(zhì)。23.一種組合物，其包含權利要求1至8中任一項的多肽和一種或多種其他選自如下的酶木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、葡聚糖酶、果膠酶、蛋白酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶和木聚糖酶。24.權利要求1至8中任一項的多肽或權利要求23的組合物在從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝中的用途，所述工藝包括下述步驟(a)預處理含木素纖維素材料；(b)在纖維素分解酶和本發(fā)明的酶存在下水解所述材料；(c)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵。全文摘要本發(fā)明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N15/82GK102365360SQ201080013739公開日2012年2月29日申請日期2010年3月23日優(yōu)先權日2009年3月24日發(fā)明者A.維克索-尼爾森,J.博杰森,P.K.漢森申請人:諾維信公司