專利名稱：陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和食用菌功能性多糖領(lǐng)域，涉及基因傳遞系統(tǒng)，具體涉及一 種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖納米?；騻鬟f系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
多糖是廣泛存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通過(guò)糖苷鍵連接在一起的高分子聚 合物，是植物、菌類、海洋生物等的重要組成成分。多糖的分子結(jié)構(gòu)中存在著大量的活性羥 基，可以進(jìn)行許多化學(xué)反應(yīng)，從而增加多糖的生物學(xué)功能。隨著近代生物技術(shù)的發(fā)展與人類基因庫(kù)的不斷完善，基因治療已經(jīng)受到越來(lái)越廣 泛的關(guān)注。各種與人類疾病相關(guān)基因逐步被揭曉，使人類從分子水平上認(rèn)識(shí)某些疾病根源 已逐步成為可能，為基因治療提供了理論基礎(chǔ)?；蜉d體，即基因傳遞系統(tǒng)，屬于特殊的靶 向給藥系統(tǒng)，它不同于一般的靶向藥物作用于某些器官或組織，而是在細(xì)胞和分子水平上 的靶向作用。目前，基因傳遞系統(tǒng)主要面臨兩個(gè)重大問(wèn)題需要解決一是安全性，即治療基 因(或稱目的基因)進(jìn)入受體細(xì)胞后，能否得到正常的表達(dá)，產(chǎn)生人們期望的治療蛋白質(zhì)，而 不產(chǎn)生其他異常蛋白質(zhì)；二是高效性，即目的基因能順利通過(guò)細(xì)胞膜不受破壞，進(jìn)入受體細(xì) 胞核，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄，翻譯成治療蛋白質(zhì)，并達(dá)到可接受的基因表達(dá)水平，即具有較高的基因轉(zhuǎn) 染效率。一般來(lái)說(shuō)，基因載體有病毒和非病毒兩種類型。雖然，病毒型基因載體的基因轉(zhuǎn)染 效率較高，但是存在著以下問(wèn)題，如能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)、有潛在的致突變和致癌作用、裝 在基因的容量有限、制備病毒型基因載體的代價(jià)高等，特別是1999年出現(xiàn)首例因使用腺病 毒載體而致病人死亡的事件發(fā)生后，美國(guó)許多科研機(jī)構(gòu)已停止使用病毒類載體，重點(diǎn)轉(zhuǎn)向 非病毒類載體研究和應(yīng)用。目前，人們?cè)絹?lái)越多地關(guān)注非病毒載體的設(shè)計(jì)和應(yīng)用，特別是對(duì) 陽(yáng)離子聚合物應(yīng)用于基因傳遞系統(tǒng)的研究。精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖是一種新型的 非病毒基因傳遞系統(tǒng)，因其具有生物相容性、生物可降解性、幾乎無(wú)毒和較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效 率等優(yōu)勢(shì)而廣受人們關(guān)注。陽(yáng)離子化多糖結(jié)合DNA質(zhì)粒的基本原理是基于陽(yáng)離子化多糖的正電荷與DNA質(zhì) 粒的負(fù)電荷的靜電作用而結(jié)合。除了殼聚糖之外，其它的天然植物多糖幾乎都不帶正電 荷，無(wú)法直接作為基因的載體，必須先將天然多糖陽(yáng)離子化進(jìn)行修飾以提高其電位，才能 成功結(jié)合DNA質(zhì)粒。目前，研究得比較多的陽(yáng)離子多糖聚合物，除殼聚糖及其衍生物[參 考:Tae Hee Kimj Hu Lin Jiang, Dhananjay Jere et al. Chemical modification of chitosan as a gene carrier in vitro and in vivo. Progress in polymer science, 2007, 32(7):726-753.]之外的陽(yáng)離子多糖基因載體主要是精胺-葡聚糖[參考 Hagit Eliyahuaj b, Aviva Josephaj c, Tony Azzam et al. Dextran - spermine-based polypIexes-Evaluation of transgene expression and of local and systemic toxicity in mice. Biomaterials 27 (2006) 1636 - 1645.]、精胺-淀粉[參考Yuichiro Kidoj Jun-ichiro Joj Yasuhiko Tabata. A gene transfection for rat mesenchymal stromal cells in biodegradable gelatin scaffolds containing cationizedpolysaccharides. Biomaterials 2010 ]:Jo Jun-ichiro, Okazaki
Arimichi, Nagane Kentaro et al. Preparation of Cationized Polysaccharides as Gene Transfection Carrier for Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Journal of Biomaterials Science, PolymerEdition, 2010, 21 (2) : 185-204. ]、PEI i^^^WMo·^ [參考:Soma Patnaik, Anita Aggarwal, Surendra Nimesh et al. PEI-alginate nanocomposites as efficient in vitro gene transfection agents. Journal of Controlled Release 114 (2006) 398 - 409]以及其它以環(huán)糊精[參考 Forrest ML, Gabrielson N, Pack Dff. Cyclodextrin-polyethylenimine conjugates for targeted in vitro gene delivery. Biothechnolgy Bioengineering, 2005, 89(4) :416- 423. ]:Soma Patnaik, Anita Aggarwal', Surendra Nimesh.
PEI-alginate nano- composites as efficent in vitro gene transfection agents. Journal of controlled release, 2006, 114(3) : 398-409.]等為骨架而進(jìn)行氨基化修飾 的聚合物。在目前陽(yáng)離子化多糖基因載體的構(gòu)建中，所使用的多糖基本上都是人工合成或 是在天然多糖基礎(chǔ)上進(jìn)行加工處理過(guò)的成分結(jié)構(gòu)比較均一的多糖。杏鮑菇多糖是杏鮑菇 子實(shí)體中一類具有生物活性的重要組成成分，因具有抗癌、抗氧化、降血脂、降膽固醇等功 效(參考:Yang Lihong, Shi Yali, Wang Xiaojie et al. Isolation and purification of polysaccharides of Pleurotus eryngii and its bio-active. Food science and technology, 2005，6 G) : 18-20)而日益受到人們關(guān)注。本發(fā)明首次將杏鮑菇多糖作為一 種天然活性高分子材料加以修飾，使其成為一種有效的基因傳遞系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從具有很好保健效果的杏鮑菇(拉丁學(xué)名P. eryngi (DC. :Fr.) Qurl.)新 鮮子實(shí)體中，采用水提醇沉、柱色譜純化的方法得到杏鮑菇總多糖，繼而對(duì)其進(jìn)行胺化修 飾。該陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖基因傳遞系統(tǒng)兼具胺類化合物的正電性和杏鮑菇多糖的生物活 性的優(yōu)點(diǎn)，制備工藝流程簡(jiǎn)單。本發(fā)明將三種陽(yáng)離子化的杏鮑菇多糖對(duì)質(zhì)粒DNA的結(jié)合、干 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果、細(xì)胞黏附性進(jìn)行了對(duì)比，同時(shí)設(shè)置脂質(zhì)體陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明精胺修飾 的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖與質(zhì)粒DNA的結(jié)合作用好，干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率明顯高于乙二胺修飾的 杏鮑菇的多糖和小分子量PEI修飾的杏鮑菇多糖，也高于陽(yáng)性對(duì)照脂質(zhì)體的干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效 率，并且細(xì)胞黏附性試驗(yàn)表明其具有良好的細(xì)胞黏附性，細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明其安全無(wú)毒。具 體工藝流程如圖1。本發(fā)明采用化學(xué)修飾的方法，提供了一種基于陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖的高效無(wú)毒的 基因傳遞系統(tǒng)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)，它是一種用胺類化合物修飾的杏鮑菇 多糖結(jié)合DNA質(zhì)粒的基因傳遞系統(tǒng)，杏鮑菇多糖的分子量分布為50(T550KD，其中按質(zhì)量 比計(jì)，陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖DNA質(zhì)粒=0.5-100:1，陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù) 合物的粒徑為50-100nm，所述的胺類化合物為精胺、乙二胺或數(shù)均分子量為600Da-2000Da 的聚乙烯亞胺。一種制備上述陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)的方法，它包括以下步
5驟
步驟1.氧化杏鮑菇多糖的制備
稱取0. 2 Ig杏鮑菇多糖，溶解于20m廣50ml雙蒸水中，加入KI04，KIO4與多糖中單糖單 位的摩爾比為0.5 5:1，迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應(yīng)721!；反應(yīng)液加入l(T20ml乙 二醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)， 在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到氧化杏鮑菇多糖0. 2^0. Sg ；
步驟2.陽(yáng)離子化鮑菇多糖的制備
A.精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖的制備
稱取0.廣0.5g步驟1制得的氧化杏鮑菇多糖，溶解于10-50ml雙蒸水中；稱取精 胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)，精胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0. 5 5:1 ；將精 胺的硼酸鹽溶液用一次性注射器緩慢加入到氧化杏鮑菇多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌； 加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)24h ；然后，向反應(yīng)液中加入0. Γ0. 5g硼氫化鈉，相同條 件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0. Γ0. 5g硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質(zhì)量與氧 化多糖的質(zhì)量之比為0. 5 3:1，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)Mh;將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分 子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖 0. 2 0. 6g ；
B.乙二胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖的制備
稱取0. Γ0. 6g步驟1制得的氧化杏鮑菇多糖，溶解于l(T60ml雙蒸水中；取乙二胺 溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)，乙二胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0. 5-5:1 ；將乙 二胺的硼酸鹽溶液用一次性注射器緩慢加入到杏鮑菇多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加 完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)Mh ；然后，向反應(yīng)液中加入0. Γ0. 5g硼氫化鈉，相同條件 下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0. Γ0. 5g硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質(zhì)量與氧化 多糖的質(zhì)量之比為0. 5 3:1，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)Mh;將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子 量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h;透析液凍干，得到乙二胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖 0. 2 0. 6g ；
C.PEI修飾的杏鮑菇多糖的制備
稱取0. 2^1g精制的杏鮑菇多糖，溶于l(T20ml磷酸鹽緩沖液(pH=7)；將活化羥基的連 接劑，如N，N’ -羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N，N’ - 二琥珀酰亞胺基硫酸酯中 的任一種，溶解于5 ml 二氯甲烷中，多糖與連接劑的質(zhì)量比為0. 5 3:1，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下， 首先在多糖液中加入催化劑三乙胺，再將羥基連接劑的二氯甲烷溶液緩慢加入多糖溶液 中，邊加邊攪拌，在3(Tl00min內(nèi)加完，加完之后，室溫反應(yīng)9(Tl50min，獲得活化的多糖溶 液；將數(shù)均分子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，多糖與聚乙烯 亞胺的質(zhì)量比為0. 5 4:1，加入催化劑三乙胺，在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下緩慢加入到活 化的多糖液中，邊加邊攪拌，在12(Tl50min加完，加完之后避光、室溫下反應(yīng)10h，反應(yīng)完成 之后的溶液經(jīng)透析(截取分子量>3500Da)、凍干之后，得到PEI修飾的杏鮑菇多糖；
步驟3.陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)的制備
分別稱取l(T50mg上述步驟2制得的三種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖，各自溶解于0. 5^2ml 雙蒸水，得到陽(yáng)離子多糖儲(chǔ)備液；取陽(yáng)離子多糖儲(chǔ)備液50 μ 1，稀釋100倍后，得到陽(yáng)離子 多糖應(yīng)用液；取10 μ 1陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液和10 μ 1含0. Γ3μδ DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加熱30~60min;再將二者混合，渦旋30s，即得到三種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù) 合物的基因傳遞系統(tǒng)。有益效果
三種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖均有良好的DNA質(zhì)粒結(jié)合作用，糖鏈結(jié)合的伯、仲、叔氨基所 攜帶的正電荷能夠很好的與帶負(fù)電荷的DNA質(zhì)粒通過(guò)靜電作用而結(jié)合，保護(hù)DNA質(zhì)粒免受 細(xì)胞內(nèi)外各種酶的降解。其中，精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖具有最佳的干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效 果，經(jīng)電泳實(shí)驗(yàn)和干細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)說(shuō)明其對(duì)DNA質(zhì)粒有更好的結(jié)合和釋放效果。而且，杏鮑 菇多糖是具有良好的生物活性的天然多糖，與以往用來(lái)制備陽(yáng)離子聚合物的多糖相比，具 有更好的生物可降解性和生物相容性，制備工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉。陽(yáng)離子化的杏鮑菇多糖在 其天然的生物活性基礎(chǔ)上，增加了新的生物學(xué)功能，成為一種生物可降解、高效低毒的新型 非病毒基因載體材料。


圖1為杏鮑菇陽(yáng)離子多糖制備工藝流程圖。圖2為陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖 )ΝΑ質(zhì)粒納米復(fù)合物電泳圖，其中 孔道 1 裸 pTGFii-l ；
孔道2 8，陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖pTGFi3-l質(zhì)量比依次為1:1 ；1:5 ；1:10 ；1:20 ；1:40 ； 1:60 ；1:100。圖3為杏鮑菇陽(yáng)離子多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的粒徑分布圖。圖4為杏鮑菇陽(yáng)離子化多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的透射電鏡圖。圖5為杏鮑菇陽(yáng)離子化多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物基因轉(zhuǎn)染效果圖，圖中 Lipfectimane代表陽(yáng)性對(duì)照脂質(zhì)體lifectamine 2000,杏鮑菇-PEI代表杏鮑菇多糖 與聚乙烯亞胺(PEI)的復(fù)合物，杏鮑菇-SP代表杏鮑菇多糖與精胺(sp)的復(fù)合物。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例所采用的材料和儀器
實(shí)驗(yàn)材料杏鮑菇(鮮品，鎮(zhèn)江市食用菌種植基地)；95%乙醇(山東廣源醫(yī)藥有限公 司)；無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、乙二醇、三氯乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DEAE-52纖 維素樹脂(Whatman 公司，英國(guó))；S印hadexG-100 凝膠樹脂(Shanghai RiChu Bioscience 有限公司)；ΚΙ04 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；精胺(Biosharp公司，美國(guó))，乙二胺 (Sigma-Aldrich, USA), PEI (Sigma_Aldrich，USA)，硼氫化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司);無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(康為世紀(jì));Rat TGF-β 1 ELISA Kit (煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù) 有限公司)。實(shí)驗(yàn)器材磁力攪拌器(金壇大中儀器廠)；透析袋(Biosharp公司，美國(guó))；超低溫 高速離心機(jī)(Heareus，德國(guó))；CHRIST冷凍干燥干機(jī)(BMH公司，德國(guó))；DY602S穩(wěn)流穩(wěn)壓電 泳儀(南京新校園生物技術(shù)研究所)；JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (Heidolph公司，德國(guó))。實(shí)施例1.精制的杏鮑菇多糖的制備
1.稱取新鮮杏鮑菇lOOOg，粉碎成漿狀；按如下工藝進(jìn)行提取料液比1 :4，提取溫度80°C，提取時(shí)間2h/次，提取次數(shù)2次；過(guò)濾，將兩次的提取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原 提取液體積的八分之一；濃縮液用95%無(wú)水乙醇沉淀，乙醇終濃度70%，靜置12h ；收集沉 淀，依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌兩次；真空干燥，得到杏鮑菇粗多糖。2.稱取5g杏鮑菇粗多糖，完全溶解于50ml雙蒸水中，向其中加入20%三氯乙 酸溶液直至三氯乙酸終濃度為3%，邊加邊攪拌，加完之后，4°C靜置4h，離心3000r/min， IOmin,除去沉淀，上清液用l%NaOH溶液中和，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，透析，凍干，得到除蛋白的杏 鮑菇多糖。3.稱取Ig除蛋白之后的杏鮑菇多糖，完全溶解于IOml雙蒸水中，3000r/min， 離心lOmin，取上清液，上DEAE-52纖維素樹脂柱，依次用雙蒸水、0. 05mol/L、0. 1 mol/L、 0. 25 mol/L、0. 5 mol/L的NaCl溶液作為洗脫液，流速6ml/min，收集洗脫液，同時(shí)采用硫 酸-苯酚法跟蹤檢測(cè)收集的多糖含量；將含多糖的收集液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得濃縮液， 透析，凍干。4.稱取步驟3得到的杏鮑菇多糖0. 5g，溶解于雙蒸水中，上kphadexG-100凝膠 樹脂柱，以0.1 mol/LNaCl溶液作為洗脫液，流速6ml/min，收集洗脫液，同時(shí)采用硫酸-苯 酚法跟蹤檢測(cè)收集的多糖含量，將含多糖的收集液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，透析，凍干，得到純 化的杏鮑菇多糖。實(shí)施例2.氧化杏鮑菇多糖的制備
稱0. 5g精制的杏鮑菇多糖，溶解于30ml雙蒸水中，加入0. 75g KIO4,迅速放到暗室，磁 力攪拌，室溫反應(yīng)72h ；反應(yīng)液加入IOml乙二醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；將 反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到氧化杏 鮑菇多糖。實(shí)施例3.精胺修飾的杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)的制備 A.取0. 15g氧化杏鮑菇多糖，溶解于IOml雙蒸水中；稱0. 3g精胺溶解于5ml的硼
酸鹽緩沖液(pH=9)；將精胺的硼酸鹽溶液用一次性注射器緩慢加入到杏鮑菇多糖溶液中， 同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)Mh ；然后，向反應(yīng)液中加入0. 2g硼氫 化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0.2g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng) 24h ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到 精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖。稱取30mg精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖溶解于0. 5ml雙蒸水，得到陽(yáng)離子多 糖儲(chǔ)備液。取陽(yáng)離子多糖儲(chǔ)備液50 μ 1，稀釋100倍后，得到陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液；取ΙΟμΙ 陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液和10 μ 1含OJyg DNA質(zhì)粒pTGFi3-l溶液，分別在55°C加熱60min ； 再將二者混合，渦旋30s，即得到陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖PTGFi3-l質(zhì)量比為30:1的精胺修飾 的杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)，其粒徑分布見(jiàn)圖3，透射電鏡見(jiàn)圖4。B.稱取30mg精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖溶解于Iml雙蒸水，得到陽(yáng)離子多 糖儲(chǔ)備液。取陽(yáng)離子多糖儲(chǔ)備液50 μ 1，稀釋100倍后，得到陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液；取ΙΟμΙ 陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液和10 μ 1含OJyg DNA質(zhì)粒PTGFii-I溶液，分別在55°C加熱60min; 再將二者混合，渦旋30s，即得到陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖pTGF β -1質(zhì)量比為10:1的精胺修飾 的杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。實(shí)施例4.乙二胺修飾的杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)的制備取0. 3g氧化杏鮑菇多糖，溶解于30ml雙蒸水中；取0. Iml乙二胺溶解于5ml的硼酸 鹽緩沖液(pH=9)；將乙二胺的硼酸鹽溶液用一次性注射器緩慢加入到杏鮑菇多糖溶液中， 同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)Mh ；然后，向反應(yīng)液中加入0. 4g硼氫 化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0.4g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng) 24h ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到 乙二胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖。稱取20mg乙二胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖溶解于Iml雙蒸水，得到陽(yáng)離子多 糖儲(chǔ)備液。取陽(yáng)離子多糖儲(chǔ)備液50 μ 1，稀釋100倍后，得到陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液；取ΙΟμΙ 陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液和10 μ 1含0.5yg DNA質(zhì)粒pTGFi3-l溶液，分別在55°C加熱40min ； 再將二者混合，渦旋30s，即得到乙二胺修飾的杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳 遞系統(tǒng)。實(shí)施例5. PEI修飾的杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)的制備 稱0. Ig精制的杏鮑菇多糖，溶解于20ml磷酸鹽緩沖液(Ph=7)中；將活化羥基的連接
劑N，N’ -羰基二咪唑(Aldrich，美國(guó))0. 2g溶解于5ml 二氯甲烷中，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，首 先在多糖液中加入催化劑0. 1ml，再將羥基連接劑的二氯甲烷溶液緩慢加入多糖溶液中，邊 加邊攪拌，在3(Tl00min內(nèi)加完，加完之后，室溫反應(yīng)9(Tl50min，獲得活化的多糖溶液；將 1.8g小分子量PEI (分子量Mw 1300, Aldrich,美國(guó))溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，加入催 化劑三乙胺，在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下緩慢加入到上述的活化的多糖液中，邊加邊攪 拌，在120-150min加完，加完之后避光、室溫下反應(yīng)10h，反應(yīng)完成之后的溶液經(jīng)透析凍干 之后，得到PEI修飾的杏鮑菇多糖。稱取30mg PEI修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖溶解于1. 5ml雙蒸水，得到陽(yáng)離子多糖 儲(chǔ)備液。取陽(yáng)離子多糖儲(chǔ)備液50 μ 1，稀釋100倍后，得到陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液；取ΙΟμΙ陽(yáng) 離子多糖應(yīng)用液和10 μ 1含0.2yg DNA質(zhì)粒pTGFi3-l溶液，分別在55°C加熱30min;再將 二者混合，渦旋30s，即得到PEI修飾的杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。以苯并三唑碳酸酯(Aldrich，美國(guó))、羰基咪唑(Aldrich，美國(guó))或N，N，-二琥珀 酰亞胺基硫酸酯(Aldrich，美國(guó))替代N，N’ -羰基二咪唑重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果。實(shí)施例6.
瓊脂糖凝膠電泳
制備1%瓊脂糖凝膠，加入0. 5 μ g/ml溴化乙啶，鋪板，加樣，在80V電泳1. 5h后采用凝 膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。如圖2所示，陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖能夠較好的結(jié)合質(zhì)粒DNA。
瓊脂糖DNA電泳的步驟如下
步驟1.制備1%瓊脂糖凝膠稱取0. 2g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入20ml 0. 5 X TBE, 瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即得到1. 0%瓊脂糖凝膠 液。步驟2.膠板制備將電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽和制膠槽洗干凈，晾干。將有
機(jī)玻璃內(nèi)槽放入制膠槽內(nèi)，并在固定位置放好梳子。待瓊脂糖凝膠溶液冷卻到65 °C左右，向 瓊脂糖凝膠液中加0. 5 μ g/ml溴化乙錠，混勻，小心地倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，是凝膠液緩慢展 開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下，水平靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕輕拔 出梳子，將凝膠及內(nèi)槽一起放入電泳槽中。
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步驟3.加樣在點(diǎn)樣板上混合一系列陽(yáng)離子化多糖與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比的陽(yáng)離子 化多糖-質(zhì)粒DNA復(fù)合物樣品(陽(yáng)離子化多糖與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比從第2孔道到第8孔道 依次為5:1 ；10:1 ；20:1 ；40:1 ；60:1 ；80:1 ； 100 1)和上樣緩沖液，用10 μ 1微量移液器分 別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)。步驟4.電泳加油后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60-100V，樣品由正極(紅 色)向負(fù)極(黑色)方向移動(dòng)。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板前沿約Icm處時(shí)，停止電泳。步驟5.電泳完畢后，取出凝膠。步驟6.觀察照相在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出橙紅色熒光條帶，采用凝 膠成像系統(tǒng)拍照保存?？梢?jiàn)陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖對(duì)DNA質(zhì)粒具有明顯的包裹作用，結(jié)果見(jiàn) 圖2。圖2中，孔道1中為裸露的質(zhì)粒，會(huì)被凝膠中的溴化乙啶染色，在紫外燈下顯現(xiàn)橘紅 色熒光，在電泳中朝正極遷移，而從孔道2到孔道8是與陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖結(jié)合的質(zhì)粒 (陽(yáng)離子化多糖與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比從第2孔道到第8孔道依次為5:1 ；10:1 ；20:1 ；40:1 ； 60 1 ;80 1 ； 100 1 )，第2、3孔道由于多糖量不足以完全包裹質(zhì)粒而使部分質(zhì)粒裸露，顯出 橘紅色熒光，隨著多糖質(zhì)量比重的增加，由于質(zhì)粒完全被陽(yáng)離子化多糖包裹而避免被溴化 乙啶染色，從而顯現(xiàn)不出熒光，同時(shí)陽(yáng)離子化多糖的正電荷中和了質(zhì)粒的負(fù)電荷，在電泳中 不向正極遷移而滯留在原孔道中。實(shí)施例7.
WpTGFii-I質(zhì)粒為報(bào)告基因，按照實(shí)施例一、二、三所述制備三種陽(yáng)離子化杏鮑菇多 糖-DNA質(zhì)粒納米?；騻鬟f系統(tǒng)。96孔板中培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞濃度達(dá) 到2 X 105/ml完全培養(yǎng)基/ ？L，孵育Μ-4 !后，用無(wú)血清培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基，分別加入三 種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物、脂質(zhì)體Lipofectamine-DNA質(zhì)粒復(fù)合物、游 離質(zhì)粒，使每孔質(zhì)粒DNA量均為0. 2 μ g，并以空白細(xì)胞為陰性對(duì)照，孵育4h后，將無(wú)血清培 養(yǎng)基置換成新鮮的含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育72h，Rat TGF-β 1 ELISA Kit檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。 結(jié)果如圖5所示，乙二胺和小分子量PEI修飾的杏鮑菇多糖均有一定的轉(zhuǎn)染效果，但是比不 上脂質(zhì)體-DNA質(zhì)粒復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率，精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒復(fù)合物 的轉(zhuǎn)染效率最高，且高于脂質(zhì)體-DNA質(zhì)粒復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。說(shuō)明精胺修飾的陽(yáng)離子化杏 鮑菇多糖是這三種陽(yáng)離子化多糖中作為基因轉(zhuǎn)染載體的最佳選擇。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟
步驟1.干細(xì)胞分離及培養(yǎng)將SD大鼠拉頸處死，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡3 5min， 無(wú)菌條件下取出脛骨和股骨；將其兩端干骺端切除，露出骨髓腔，用無(wú)菌注射器吸取適量 PBS徹底沖洗骨髓腔；反復(fù)吹打沖出骨髓；使骨髓細(xì)胞充分分散；所獲得的骨髓單細(xì)胞懸液 沿管壁緩慢滴加于預(yù)置的Percoll分離液(相對(duì)體積質(zhì)量1. 073)的離心管中，骨髓單細(xì)胞 懸液與分離液的體積比為1 :1 ；2000rpm，離心20min，吸取中間云霧狀細(xì)胞層，用PBS洗滌3 次；重新懸起細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM)，置于培養(yǎng)瓶中， 37 °C體積分?jǐn)?shù)為5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。步驟2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染
分別取精胺、乙二胺和小分子量PEI修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物 (20 μ g/ml)加至96孔板中(2. 5 X IO5/孔)，并輕輕搖晃使其均勻混合；放置37°C C02培養(yǎng)箱孵育M-4 !，以脂質(zhì)體-DNA質(zhì)粒復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率作為對(duì)照。
權(quán)利要求
1.一種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖納米粒基因傳遞系統(tǒng)，其特征是它是一種用胺類化 合物修飾的杏鮑菇多糖結(jié)合DNA質(zhì)粒的基因傳遞系統(tǒng)，杏鮑菇多糖的分子量分布為 50(T550KD，其中按質(zhì)量比計(jì)，陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖DNA質(zhì)粒=0. 5-100:1，陽(yáng)離子化杏鮑 菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的粒徑50-100nm，所述的胺類化合物為精胺、乙二胺或數(shù)均分 子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺。
2.一種制備上述陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖納米?；騻鬟f系統(tǒng)的方法，其特征是它包括以 下步驟步驟1.氧化杏鮑菇多糖的制備稱0. 2 Ig杏鮑菇多糖，溶解于20m廣50ml雙蒸水中，加入KI04，KIO4與多糖中單糖單位 的摩爾比為0. 5 5:1，迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應(yīng)72h;反應(yīng)液加入l(T20ml乙二 醇終止反應(yīng)，按前述條件繼續(xù)反應(yīng)30min ；將反應(yīng)液裝入透析袋(截取分子量>3500Da)，在 雙蒸水中透析48h ；透析液凍干，得到氧化杏鮑菇多糖0. 2~0. Sg ；步驟2.陽(yáng)離子化鮑菇多糖的制備A.精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖的制備取0. Γ0. 5g步驟2制得的氧化杏鮑菇多糖，溶解于10-50ml雙蒸水中；稱取精胺溶解 于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)，精胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0. 5 5:1 ；將精胺的硼酸 鹽溶液用一次性注射器緩慢加入到杏鮑菇多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之后，磁力 攪拌，室溫反應(yīng)Mh ；然后，向反應(yīng)液中加入0. Γ0. 5g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)48h ； 再向反應(yīng)液中加入0. Γ0. 5g硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質(zhì)量與氧化多糖的質(zhì)量之比為 0. 5 3:1，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)24h ；將反應(yīng)液裝入透析袋，在雙蒸水中透析48h ；透析液凍 干，得到精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖0. 2^0. 6g ；B.乙二胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖的制備稱取0. Γ0. 6g步驟2制得的氧化杏鮑菇多糖，溶解于l(T60ml雙蒸水中；取乙二胺溶 解于5ml的硼酸鹽緩沖液(pH=9)，乙二胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0. 5-5:1 ；將乙二胺 的硼酸鹽溶液用一次性注射器緩慢加入到杏鮑菇多糖溶液中，同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌；加完之 后，磁力攪拌，室溫反應(yīng)Mh ；然后，向反應(yīng)液中加入0. Γ0. 5g硼氫化鈉，相同條件下繼續(xù) 反應(yīng)48h ；再向反應(yīng)液中加入0. Γ0. 5g硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質(zhì)量與氧化多糖的質(zhì) 量之比為0. 5 3:1，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)24h ；將反應(yīng)液裝入透析袋，在雙蒸水中透析48h ； 透析液凍干，得到乙二胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖0. 2^0. 6g ；C.PEI修飾的杏鮑菇多糖的制備稱取0. 2 lg精制的杏鮑菇多糖，溶于l(T20ml磷酸鹽緩沖液(pH=7)；將活化羥基的連 接劑溶解于5 ml 二氯甲烷中，多糖與連接劑的質(zhì)量比為0. 5 3:1，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，首先 在多糖液中加入催化劑，再將活化羥基的連接劑的二氯甲烷溶液緩慢加入多糖溶液中，邊 加邊攪拌，在3(Tl00min內(nèi)加完，加完之后，室溫反應(yīng)9(Tl50min，獲得活化的多糖溶液；將 數(shù)均分子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺溶于IOml磷酸鹽緩沖液中，多糖與PEI的質(zhì)量 比為0. 5 4:1，加入催化劑三乙胺，在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下緩慢加入到活化的多糖液 中，邊加邊攪拌，在12(Tl50min加完，加完之后避光、室溫下反應(yīng)10h，反應(yīng)完成之后的溶液 經(jīng)透析、凍干之后，得到PEI修飾的杏鮑菇多糖；步驟3.陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)的制備分別稱取l(T50mg三種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖，各自溶解于0. 5~2ml雙蒸水，得到陽(yáng)離子 多糖儲(chǔ)備液；取陽(yáng)離子多糖儲(chǔ)備液50 μ 1，稀釋100倍后，得到陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液；取10μ 1 陽(yáng)離子多糖應(yīng)用液和10 μ 1含0.1~3 μ g DNA質(zhì)粒溶液，分別在55°C加熱30~60min ；再將 二者混合，渦旋30s，即得到陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的基因傳遞系統(tǒng)。
全文摘要
一種陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖納米?；騻鬟f系統(tǒng)，它是一種用胺類化合物修飾的杏鮑菇多糖結(jié)合DNA質(zhì)粒的基因傳遞系統(tǒng)，杏鮑菇多糖的分子量分布為500~550KD，其中按質(zhì)量比計(jì)，陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖:DNA質(zhì)粒=0.5-100:1，陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖-DNA質(zhì)粒納米復(fù)合物的粒徑為50-100nm。精胺修飾的陽(yáng)離子化杏鮑菇多糖具有最佳的干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，而且，杏鮑菇多糖是具有良好的生物活性的天然多糖，陽(yáng)離子化的杏鮑菇多糖在其天然的生物活性基礎(chǔ)上，增加了新的生物學(xué)功能，成為一種生物可降解、高效低毒的新型非病毒基因載體材料。本發(fā)明公開了其制法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102146416SQ20101061348
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者余江南, 徐希明, 曹霞, 王淼, 鄧紋紋 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)