專利名稱：一種構(gòu)建t載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種構(gòu)建T載體的方法。
背景技術(shù)：
PCR是分子生物學(xué)和基因工程研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)，它被廣泛用于體外擴(kuò)增和 分離已知或未知的特異性DNA片段。將PCR產(chǎn)物快速有效的克隆到質(zhì)粒載體上是進(jìn)行高質(zhì) 量測序、體外轉(zhuǎn)錄及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物多種用途的前提。通常PCR產(chǎn)物不具有 粘端，只能進(jìn)行平端連接的克隆，由于Taq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在PCR產(chǎn)物3'末端會(huì)以非模板依賴的方式加上一個(gè)腺苷酸殘基(A)。T 載體作為一種方便的PCR產(chǎn)物克隆載體，因其3'末端帶有突出的胸腺核苷酸(T)，可直接 與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3'末端突出的A堿基配對(duì)，因此在基因克隆方面應(yīng)用十分廣泛。目前T載體售價(jià)大多偏高，1微克國外公司開發(fā)產(chǎn)品的售價(jià)大都在700元到800元 左右，國內(nèi)幾家公司開發(fā)的產(chǎn)品，售價(jià)也在200元以上，而且存在連接效率低、連接不穩(wěn)定 等缺陷。因此制備高質(zhì)量、穩(wěn)定、價(jià)廉的T載體是廣大分子生物學(xué)研究者關(guān)心的問題，也是 生物試劑廠商感興趣的業(yè)務(wù)之一。目前T載體的構(gòu)建方法主要是用產(chǎn)生平末端的限制性內(nèi)切酶(如EcoRV)在質(zhì)粒 DNA多克隆位點(diǎn)處切開，利用Taq DNA聚合酶非模板擴(kuò)增特性在線性質(zhì)粒兩條鏈的3 ‘端添 加dT制成T載體，如Promega和TaKaRa公司的產(chǎn)品，以及國內(nèi)幾家公司的產(chǎn)品。但是由于 3'端加T為非優(yōu)先聚合核苷酸，僅部分的3'端可添加T，或者添加一個(gè)以上T，造成載體在 克隆過程中自身環(huán)化率較高，而且連接不穩(wěn)定，篩選陽性克隆的難度增加。另外該方法生產(chǎn) 的T載體步驟比較繁瑣，每次生產(chǎn)T載體產(chǎn)量有限、質(zhì)量不穩(wěn)定、批次間質(zhì)量差異大、不適合 大規(guī)模生產(chǎn)，并且因價(jià)格昂貴，無法進(jìn)行循環(huán)使用，在普及上存在一定困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種簡單高效的構(gòu)建T載體的方法，利用該法所獲得的T載體 質(zhì)量穩(wěn)定，克隆效果高，不但能用于TA克隆，也可用于引物中含有Xcm I酶切位點(diǎn)的基因序 列的定向克隆，并且可避免3n+2個(gè)核苷酸的cDNA序列克隆表達(dá)移碼。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種構(gòu)建T載體的方法，包括步驟1 出發(fā)載體與Xcm I盒連接，得前T載體；步驟2 =Xcm I限制性內(nèi)切酶酶切步驟1所得前T載體，回收線性化載體，得到T載 體；其中，所述出發(fā)載體為PGEM-T Easy Vector,pBS-T Vector、pSURE_TVector，所述 Xcm I盒序列包括間隔DNA序列和緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個(gè)附加序列，所 述附加序列包括Xcm I酶切位點(diǎn)序列和XcmI酶切位點(diǎn)序列5'端的3個(gè)保護(hù)堿基。本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法是利用限制性酶切法原理，利用限制性內(nèi)切酶特異性在出發(fā)載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)引入Xcm I的酶切位點(diǎn)，然后用XcmI限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn) 生3'端具有單個(gè)T突出的線性T載體。由限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的T載體具有酶切產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定、易于操作等特點(diǎn)， 然而由于Xcm I經(jīng)常會(huì)發(fā)生酶切不完全的現(xiàn)象，因此會(huì)造成較高背景的假陽性。為了提高 克隆效率，減少假陽性，需要把完全酶切的質(zhì)粒從部分酶切的產(chǎn)物中純化出來，但是由于完 全酶切和部分酶切的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠上的大小相差不大而不容易分開。本發(fā)明在出發(fā)載 體的多克隆位點(diǎn)引入一個(gè)足夠長的間隔序列，以便能很容易區(qū)分完全酶切和部分酶切的片 段，所述間隔DNA序列是用兩條含有Xcm I酶切位點(diǎn)和Xcm I酶3個(gè)保護(hù)堿基的引物擴(kuò)增 得到的足夠在瓊脂糖凝膠上區(qū)分完全酶切和部分酶切的片段大小的任意序列。其中，作為優(yōu)選，步驟1所述出發(fā)載體與Xcm I盒用T4DNA連接酶連接。作為優(yōu)選，所述保護(hù)堿基為ATC。作為優(yōu)選，所述間隔DNA序列為長度為500-2000bp的DNA序列。更優(yōu)選地是，所述間隔DNA序列為以pUC19質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的DNA序列。作為優(yōu)選，所述Xcm I盒序列正義鏈為SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列。更優(yōu)選地是，所述Xcm I盒序列為用具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的上游 引物和具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增的DNA序列。本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法，所述附加序列包括Xcm I酶切位點(diǎn)序 列和Xcm I酶切位點(diǎn)序列5'端的3個(gè)保護(hù)堿基，所述Xcm I酶切位點(diǎn)序列為 5' -CCANNNNTNNNNTGG-3'，其5'端與Xcm I酶的3個(gè)保護(hù)堿基相連，N可以為A、T、C、G中 的任意一個(gè)。當(dāng)Xcm I盒與出發(fā)載體連接時(shí)，所述Xcm I盒序列的5'端和3'端分別與出 發(fā)載體的3'端和5'端連接，形成環(huán)狀質(zhì)粒。Xcm I限制性內(nèi)切酶酶切后，間隔DNA序列和 兩側(cè)的NNNNTGG序列被切除，Xcm I酶的3個(gè)保護(hù)堿基和Xcm I酶切位點(diǎn)序列中的CCANNNNT 序列仍連接在載體上，形成3'端具有單個(gè)T突出的線性T載體。構(gòu)建的T載體與出發(fā)載體 相比，3 ‘端增加了 Xcm I酶的3個(gè)保護(hù)堿基和Xcm I酶切位點(diǎn)序列中的CCANNNNT序列，共 llbp。當(dāng)3n+2個(gè)核苷酸的cDNA序列與利用本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的T載體連 接時(shí)，3'端單個(gè)突出T與cDNA序列中的A相連，當(dāng)構(gòu)建入表達(dá)載體時(shí)，因?yàn)?n+2個(gè)核苷酸 的cDNA序列5'端引入了 Ilbp核苷酸，使3n+2個(gè)核苷酸的cDNA序列避免移碼，基因正常 表達(dá)。本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法簡單高效，利用該法所獲得的T載體不僅具備出發(fā) 載體的優(yōu)點(diǎn)，還包含出發(fā)載體的不同多克隆位點(diǎn)，而且質(zhì)量穩(wěn)定、自身環(huán)化率低、克隆效果 高，不但能用于TA克隆，也可用于引物中含有Xcm I酶切位點(diǎn)的基因序列的定向克隆，極大 地方便了 PCR產(chǎn)物的克隆，并且可以避免3n+2個(gè)核苷酸的cDNA序列在基因表達(dá)時(shí)發(fā)生移碼。


圖1示含有Xcm I酶切位點(diǎn)的兩引物以PUC19質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，所獲產(chǎn)物的 1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1為500bp左右的目的條帶，泳道M為DL2000DNA Marker。圖2示用Xcm I酶切所獲得的前T載體pGM_T載體和pBS_T載體后進(jìn)行1 %瓊脂 糖凝膠電泳圖，泳道1-3為pGM-T載體酶切結(jié)果，泳道4-6為pBS-T載體酶切結(jié)果，3. Okb左右的條帶即為線性化的載體。圖3示本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的pGM-Tl載體與長度為750bp的目的 片段連接后，對(duì)轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，所獲產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1為以 含有750bp目的片段的質(zhì)粒做模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，泳道2-6為隨機(jī)挑選5個(gè)連接有750bp 片段的PGM-Tl載體的單菌落作為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。圖4示為含有目的片段的單菌落的質(zhì)粒用EcoR I進(jìn)行酶切鑒定的1 %瓊脂糖凝膠 電泳圖，泳道1、3為含有目的片段的質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，泳道2為以含有750bp目的片段的 質(zhì)粒做模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。圖5示本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的pBS-T 1載體和pSURE_T 1載體連接 長度為I600bp的目的片段后對(duì)目的片段進(jìn)行菌落PCR鑒定，所獲產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電 泳圖。泳道1、9為分別以不含目的片段的空質(zhì)粒PBS-T 1和PSURE-T 1為模板擴(kuò)增的結(jié)果； 泳道2、16為以含有1600bp目的片段的質(zhì)粒做模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，泳道3-8為隨機(jī)挑選 6個(gè)連接有1600bp片段的pBS-T 1載體的單菌落作為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；泳道10-15為 隨機(jī)挑選6個(gè)連接有1600bp片段的PSURE-T 1載體的單菌落作為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。圖6示本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的pGEM-T 1載體的圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例公開了一種構(gòu)建T載體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi) 容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行 了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng) 或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種構(gòu)建T載體的方法，包括步驟1 出發(fā)載體與Xcm I盒連接，得前T載體；步驟2 =Xcm I限制性內(nèi)切酶酶切步驟1所得前T載體，回收線性化載體，得到T載 體；其中，所述出發(fā)載體為pGEM-T Easy Vector,pBS-T Vector、pSURE_TVector，所述 Xcm I盒序列包括間隔DNA序列和緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個(gè)附加序列，所 述附加序列包括Xcm I酶切位點(diǎn)序列和XcmI酶切位點(diǎn)序列5'端的3個(gè)保護(hù)堿基。其中，作為優(yōu)選，步驟1所述出發(fā)載體與Xcm I盒用T4DNA連接酶連接。作為優(yōu)選，所述保護(hù)堿基為ATC。作為優(yōu)選，所述間隔DNA序列為長度為500_2000bp的DNA序列。更優(yōu)選地是，所述間隔DNA序列為以pUC19質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的DNA序列。作為優(yōu)選，所述Xcm I盒序列正義鏈為SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列。更優(yōu)選地是，所述Xcm I盒序列為用具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的上游 引物和具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增的DNA序列。本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法簡單高效，利用該法所獲得的T載體不僅具備出發(fā) 載體的優(yōu)點(diǎn)，還包含出發(fā)載體的不同多克隆位點(diǎn)，而且質(zhì)量穩(wěn)定、自身環(huán)化率低、克隆效果
5高，不但能用于TA克隆，也可用于引物中含有Xcm I酶切位點(diǎn)的基因序列的定向克隆，極大 地方便了 PCR產(chǎn)物的克隆，并且可以避免3n+2個(gè)核苷酸的cDNA序列在基因表達(dá)時(shí)發(fā)生移碼。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的構(gòu)建T載體的方法進(jìn)行 詳細(xì)說明。實(shí)施例1 :Xcm I盒的制備以pUC19質(zhì)粒做模板，用具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列的上游引物和具有 SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為
IOXtaq buffer (with 1. 5mM Mg2+)5 μ 1
IOmM dNTP1 μ 1
10 μ M的上游引物1 μ 1
10 μ M的下游引物1 μ 1
pUC 19 質(zhì)粒(20ng/ μ 1)1 μ 1
Taq 酶(5U/ μ 1)0. 5μ 1
加入滅菌蒸餾水補(bǔ)足體系總量50 μ 1。
PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 94°C預(yù)變性3min
94°C變性30s52°C退火30s72°C延伸30s
72°C延伸IOmin
35個(gè)循環(huán)所得PCR產(chǎn)物取5 μ 1，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。實(shí)施例2 前T載體的制備對(duì)實(shí)施例1所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，回收后的產(chǎn)物分別與pGEM-T Easy Vector (Promega 公司)、pBS_T Vector (原平皓生物)、pSURE-T Vector (原平皓生物)在 T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞鋪在含有 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。對(duì)篩選到的陽性克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定含有 500bp左右目的片段的質(zhì)粒即為前T載體。實(shí)施例3 =T載體的制備用Xcm I酶切實(shí)施例2所得前T載體，結(jié)果見圖2。載體pGEM-T、pBS_T和pSURE_T 大小分別為3037bp、3022bp和2773bp，因此3000bp左右的條帶即為線性化的載體?；厥站€ 性化的載體，制得T載體pGEM-T UpBS-T UpSURE-T 1。實(shí)施例4 本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的T載體的克隆效率檢測為了檢測本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的T載體的克隆效率，用本發(fā)明構(gòu)建 的pGM-T 1載體連接長度為750bp的目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的 細(xì)胞鋪在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。然后隨機(jī)挑選5個(gè)陽性單菌落，用 擴(kuò)增750bp目的片段的引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果見圖3。對(duì)菌落PCR鑒定含有750bp目的片段的菌落用含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行搖培，提取質(zhì)粒，然后用EcoR I進(jìn) 行酶切鑒定，鑒定結(jié)果見圖4。由圖3可知，本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的pGM-T 1載體與目的片段連接、 轉(zhuǎn)化，隨機(jī)挑選的5個(gè)陽性單菌落經(jīng)過菌落PCR鑒定都含有750bp大小的目的片段。由圖 4可知，經(jīng)過EcoR I酶切鑒定，含有目的片段的菌落的質(zhì)粒都為陽性克隆，表明本發(fā)明所述 構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的pGM-T 1載體克隆效率高。實(shí)施例5 本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的T載體的克隆效率檢測為了檢測本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的T載體的克隆效率，用本發(fā)明構(gòu)建 的pBS-T 1和pSURE-T 1載體連接長度為1600bp的目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài) 細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞鋪在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。然后分別隨機(jī)挑選 5個(gè)陽性單菌落，用擴(kuò)增1600bp目的片段的引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果見圖5。由圖5可知，本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的pBS-T 1和pSURE_T 1載體與 目的片段連接、轉(zhuǎn)化，隨機(jī)挑選的5個(gè)陽性單菌落經(jīng)過菌落PCR鑒定都含有1600bp大小的 目的片段，表明本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法構(gòu)建的pBS-T 1和pSURE-T 1載體克隆效率 尚ο以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì) 于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種構(gòu)建T載體的方法，包括步驟1出發(fā)載體與Xcm I盒連接，得前T載體；步驟2Xcm I限制性內(nèi)切酶酶切步驟1所得前T載體，回收線性化載體，得到T載體；其中，所述出發(fā)載體為pGEM T Easy Vector、pBS T Vector、pSURE TVector，所述Xcm I盒序列包括間隔DNA序列和緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個(gè)附加序列，所述附加序列包括Xcm I酶切位點(diǎn)序列和XcmI酶切位點(diǎn)序列5′端的3個(gè)保護(hù)堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟1所述出發(fā)載體與XcmI盒用T4DNA連 接酶連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述保護(hù)堿基為ATC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述間隔DNA序列為長度為500-2000bp的 DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述間隔DNA序列為以pUC19質(zhì)粒為模板擴(kuò) 增的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述XcmI盒序列正義鏈為SEQ ID N0:1所 示的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述XcmI盒序列為用具有SEQ ID N0:2所 示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增的DNA 序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種構(gòu)建T載體的方法。該方法以pGEM-T Easy Vector、pBS-T Vector、pSURE-T Vector為出發(fā)載體與Xcm I盒連接得到前T載體，然后用Xcm I限制性內(nèi)切酶酶切前T載體，回收線性化載體，得到T載體，所述Xcm I盒序列包括間隔DNA序列和緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個(gè)附加序列，所述附加序列包括Xcm I酶切位點(diǎn)序列和Xcm I酶切位點(diǎn)序列5′端的3個(gè)保護(hù)堿基。本發(fā)明所述構(gòu)建T載體的方法簡單高效，所獲得的T載體質(zhì)量穩(wěn)定，自身環(huán)化率低，克隆效果高，并且可以避免3n+2個(gè)核苷酸的cDNA序列在基因表達(dá)時(shí)發(fā)生移碼。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101948862SQ201010281650
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者李艷萍 申請人:原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司