專利名稱：Cox-1基因snp檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學和生物技術，具體的是涉及一種C0X-1基因SNP檢測液相芯片以及特異性引物。
背景技術：
環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸轉化成類花生酸類物質途徑中重要的限速酶，如前列腺素的合成(ftOstaglandinsPk)。環(huán)氧合酶存在兩種同工酶，即為 C0X-1和C0X-2，C0X-1 (Cyclooxygenase 1)屬于管家酶，又名前列腺素內過氧化物G/H合成酶(prostaglandin endoperoxide G/H synthase，PTGS1)，在機體的各組織中均有表達， 它產生的前列腺素參與機體正常的生理過程和保護功能，在大多數正常細胞中都呈穩(wěn)定表達。一般情況下活性穩(wěn)定，在應激狀態(tài)下或受某些激素、生長因子刺激時，其活性可輕度增加2倍 4倍。C0X-1蛋白由576個氨基酸組成，其編碼基因位于染色體9，大小約221Λ，含有 11個外顯子。有研究表明，攜帶不平衡完全連鎖的C50T和A842G單核苷酸突變的患者，阿司匹林在前列腺素H2合成過程中比正常的基因型起著更大的抑制作用。此外，C0X-1的G123A 位點多態(tài)性與阿司匹林抵抗(Aspirin Resistance, AR)相關。其中，C50T(rs3842787)位于 C0X-1 的 exon2 上，A842G(rsl0306114)發(fā)生在 C0X-1 的啟動子區(qū)域，G123A(rs3842788) 發(fā)生在C0X-1的exon3上。目前對C0X-1多態(tài)性檢測的產品一般基于PCR技術的熒光定量PCR法、RFLP法和 DNA測序法等，存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點，同時由于檢測通量的局限性，不能滿足實際應用的需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種C0X-1基因SNP檢測液相芯片，該液相芯片可用于檢測C0X-1基因三種常見基因型C50T、A842G和G123A的野生型和突變型。實現上述目的的技術方案如下一種C0X-1基因SNP檢測液相芯片，主要包括有(A)針對C0X-1基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對每種 ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物組成，所述特異性引物是針對C50T SNP位點的SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8、針對A842G SNP位點的SEQID N0. 9 和 SEQ ID N0. 10、和 / 或針對 G123A SNP 位點的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 12 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 6 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述 anti-tag序列選自SEQ ID N0. 13 SEQ ID N0. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C)用于擴增出具有C50T、A842G和/或G123A SNP位點的C0X-1基因目標序列的擴增引物。
優(yōu)選地，所述擴增引物為針對C50T SNP位點的SEQ ID NO. 19 SEQ ID NO. 20, 針對 A842GSNP 位點的 SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 22，和 / 或針對 G123A SNP 位點 SEQ ID NO. 23 SEQ IDN0. 24。更優(yōu)選地，所述ASPE引物對為針對C50T SNP位點的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 7組成的序列以及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 8組成的序列、針對A842G SNP位點的由SEQ IDN0. 3和SEQ ID N0. 9組成的序列以及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID NO. 10組成的序列、和/或針對G123A SNP位點的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID NO. 11組成的序列以及由SEQ ID N0. 6和SEQ IDN0. 12組成的序列。本發(fā)明還提供了用于C0X-1基因SNP檢測的特異性引物，包括有針對C50T SNP 位點的野生型和突變型的SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8、針對A842G SNP位點的野生型和突變型的SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 10、和/或針對G123A SNP位點的野生型和突變型的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 12。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1.本發(fā)明所提供的液相芯片與測序法的檢測結果吻合率高達100%。所制備的C0X-1基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及 anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、anti-tag標簽序列的選取以及 tag標簽序列與具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應，實現多個SNP位點的并行檢測。2.本發(fā)明設計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準確區(qū)分各種型別的基因型。3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，三種SNPs檢測可通過一步多重PCR即可完成三個具有SNP位點的目標序列的擴增，避免了反復多次PCR等復雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結果的可重復性差的缺陷， 同時對現有的液相芯片技術進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結果更加準確可靠。
具體實施例方式實施例1 C0X-1基因SNP檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對C0X-1 基因的三種常見 SNP 位點 C50T(rs3842787)、A842G(rsl0306114)和 G123A(rs3842788)，分別設計特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性引物序列” 組成。ASPE引物序列如下表所示表1 ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)基因基因型類型ASPE引物Tag序列特異性引物序列COX-IC50TC50T -W5'TCAATTACCTTTTCAATACAATAC (SEQ ID NO. 1)TTCCTGCTCCTGCTCCC 3' (SEQIDNO.7)C50T -m5 'CTTTTCAATTACTTCAAATCTTCA (SEQIDNO.2)TTCCTGCTCCTGCTCCT 3' (SEQ ID NO.8)A842GA842G -W5 ‘ AATC A ATCTTC ATTCAA ATCATC A (SEQIDNO.3)AGCA CCTACTACATGCTGGA 3' (SEQIDNO.9)A842G -m5'TCAATCAATTACTTACTCAAATAC (SEQIDNO.4)AGCA CCTACTACATGCTGGG 3' (SEQIDNO.IO)G123AQ123A-W5'TCATTTACCAATCTTTCTTTATAC (SEQ ID NO.5)GTTGTTACTATCCATGCCAG 3' (SEQIDNO.ll)G123A -m5' CTACTAATTCATTAACATTACTAC (SEQIDNO.6)GTTGTTACTATCCATGCCAA 3' (SEQ ID NO. 12)每條ASPE引物包括兩個部分，5’端為針對相應微球上anti-tag序列的特異性tag 序列，3’端為突變型或野生型特異的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。合成后的每條引物分別用lOmmol/LTris Bufferm 制成lOOpmol/mL的貯存液。二、anti-tag序列包被的微球根據所設計的ASPE特異性引物片段，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的 anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級結構，選擇的6種微球編號與微球上相應的anti-tag序列如表2所示表2微球編號與微球上相應的anti-tag序列
權利要求
1.一種C0X-1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對C0X-1基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對每種ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物組成，所述特異性引物是針對 C50T SNP 位點的 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、針對 A842G SNP 位點的 SEQID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、和 / 或針對 G123A SNP 位點的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 6 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增具有C50T、A842G和/或G123ASNP位點的C0X-1基因目標序列的擴增引物。
2.根據權利要求1所述的C0X-1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為針對C50T SNP位點的SEQ ID N0. 19 SEQ ID N0. 20，針對A842G SNP 位點的 SEQ ID N0. 21 SEQ ID N0. 22，和 / 或針對 G123A SNP 位點 SEQ ID N0. 23 SEQ IDN0. 24。
3.根據權利要求1所述的C0X-1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物對為針對C50T SNP位點的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 7組成的序列以及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 8組成的序列、針對A842G SNP位點的由SEQ ID N0. 3 和SEQID N0. 9組成的序列以及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID NO. 10組成的序列、和/或針對 G123A SNP位點的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID NO. 11組成的序列以及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 12組成的序列。
4.根據權利要求1-3所述的C0X-1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個T。
5.用于C0X-1基因SNP檢測的特異性引物，其特征是，包括有針對C50TSNP位點的野生型和突變型的SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8、針對A842G SNP位點的野生型和突變型的SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 10、和/或針對G123A SNP位點的野生型和突變型的SEQ IDN0. 11 和 SEQ ID N0. 12。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種COX-1基因SNP檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點的特異性引物組成的ASPE引物對，所述特異性引物是針對C50T SNP位點的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、針對A842G SNP位點的SEQID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或針對G123A SNP位點的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；所述tag序列選自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；微球；擴增引物。所述檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，能夠避免交叉反應，且可以實現多個SNP位點的并行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102277413SQ20101019684
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權日2010年6月8日
發(fā)明者余剛, 曾濤, 秦會娟, 許嘉森 申請人:廣州益善生物技術有限公司