專利名稱：：一種cyp3a4基因snp檢測特異性引物、液相芯片及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及CYP3A4基因SNP檢測特異性引物、液相芯片及方法。
背景技術(shù)：
：細胞色素P450(cytochromeP450,cytochromeCYPs，簡稱P450)是一類以血紅素為輔基的B族細胞色素超家族蛋白酶，存在于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。P450酶系是最重要的一組代謝酶，參與的代謝包括致癌物質(zhì)和臨床治療藥物等。在CYP450超家族中，CYP1A2，CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4與目前市場上95%以上藥物代謝及藥物間相互作用有關(guān)。CYP3A同工酶參與了煙草致癌物和類固醇代謝，包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43，在人類肺部組織的表達和活性的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著的個體間差異。其中，CYP3A4被認為是肝臟和小腸中含量最豐富的CYP，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CYP3A4參與了大約38個類別共150多種藥物的代謝。研究證明CYP3A4的酶活性與肝癌、前列腺癌、白血病等的發(fā)生密切相關(guān)。此夕卜，該酶還參與了部分前致癌物質(zhì)的活化，與之相關(guān)的藥物相互作用亦十分多見。目前已報道的CYP3A4等位基因型超過40種，其中CYP3A4*1B是較早發(fā)現(xiàn)的突變基因型，研究證明CYP3A4*1B等位基因存在與啟動子活性的提高和晚期前列腺癌直接相關(guān)。CYP3A4*1B等位基因攜帶者患上非小細胞肺癌風(fēng)險顯著提高，其中，女性攜帶者患上肺癌的風(fēng)險更高。吸煙劑量大的CYP3A4*1B等位基因攜帶男性比吸煙劑量小的*1A/*1A攜帶者患上肺癌的幾率更高。CYP3A4*2的分布頻率較低，國內(nèi)暫未發(fā)現(xiàn)，有研究證明該突變基因型會導(dǎo)致人體對硝苯地平的藥物清除能力下降；CYP3A4*4、CYP3A4*5和CYP3A4*6是在對中國人群的研究中首先發(fā)現(xiàn)的，均會導(dǎo)致酶活性的下降；有研究發(fā)現(xiàn)CYP3A4*17和CYP3A4*18會影響睪酮的藥效，其中CYP3A4*18在中國人群的分布頻率達10%;CYP3A4*19在亞洲的分布頻率為2%，主要出現(xiàn)在印度和巴基斯坦一帶，CYP3A4*3在中國人中分布頻率為1.5%。CYP3A4基因的多態(tài)性是造成個體對藥物治療效果差異的主要原因之一，因此專家建議在藥物使用前對靶標(biāo)進行檢測，使臨床醫(yī)生了解遺傳信息，從而有針對性地使用藥物和劑量，有效減少毒副作用和提高藥效。目前國內(nèi)外檢測CYP3A4基因多態(tài)性的方法有少量報道，主要建立在傳統(tǒng)固相芯片和PCR的基礎(chǔ)上，固相芯片價格昂貴，而且敏感度不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差。而其它以PCR為基礎(chǔ)的SNPs檢測技術(shù)，如直接測序法，半定量PCR技術(shù)，PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)檢測等，存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點。普通PCR方法和熒光定量PCR由于檢測通量的局限性不能滿足臨床的需要，而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)(PCR-RFLP)分析技術(shù)和基于TaqMan技術(shù)的等位基因差異分析法一次只能進行一種突變的檢測，耗時費力?；谛酒脑?，美國Luminex公司開發(fā)出了以微球為載體的懸浮液相芯片技術(shù)。該項技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的蛋白質(zhì)或核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強度，并根據(jù)微球中不同色彩而編號分類，從而確定反應(yīng)的類型；綠色激光檢測樣本中熒光標(biāo)記物的熒光強度，再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析激光所檢測到微球種類、數(shù)量，從而判定待測樣本多種目標(biāo)測試物各自的濃度。因此，液相芯片技術(shù)既滿足了高通量檢測的要求，同時具備了快速準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性好，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點。我們采用xTAG液相芯片技術(shù)可以同時檢測多種SNPs，實現(xiàn)高通量快速簡便化操作，大大提高了檢測效率，在同類檢測技術(shù)中處于領(lǐng)先地位。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供CYP3A4基因SNP檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測CYP3A4基因十種常見基因型CYP3A4*1B、CYP3A4*2、CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18、和/或CYP3A4*19的野生型和突變型。一種CYP3A4基因SNP檢測液相芯片，包括有(1)針對每種型別的SNP位點分別設(shè)計的野生型和突變型ASPE引物對，每種ASPE引物對由5’端的tag序列和3’端的針對目的基因SNP位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列分別選自:SEQIDNO.21及SEQIDNO.22,SEQIDNO.23及SEQIDNO.24、SEQIDNO.25及SEQIDNO.26、SEQIDNO.27及SEQIDNO.28、SEQIDNO.29及SEQIDNO.30、SEQIDNO.31及SEQIDNO.32、SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、SEQIDNO.35及SEQIDNO.36、SEQIDNO.37及SEQIDNO.38、和SEQIDNO.39及SEQIDNO.40中的一對或多對；所述tag序列選自SEQIDN0.1SEQIDN0.20中的序列；(2)分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補配對，所述anti-tag序列選自SEQIDN0.41SEQIDN0.60中的序列；(3)用于擴增具有CYP3A4*1B、CYP3A4*2、CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18和CYP3A4*19中一個或多個SNP位點的CYP3A4基因目標(biāo)序列的引物。優(yōu)選地，用于擴增的引物包括針對CYP3A4*1BSNP位點的SEQIDN0.61和SEQIDN0.62；針對CYP3A4*4SNP位點的SEQIDN0.63和SEQIDN0.64；針對CYP3A4*15SNP位點的SEQIDN0.65和SEQIDN0.66；針對CYP3A4*2、CYP3A4*5和CYP3A4*17SNP位點的SEQIDNO.67和SEQIDNO.68；針對CYP3A4*6SNP位點的SEQIDNO.69和SEQIDNO.70；針對CYP3A4*18SNP位點的SEQIDN0.71和SEQIDN0.72；和針對CYP3A4*3和CYP3A4*19SNP位點的SEQIDN0.73和SEQIDN0.74中的一對或一對以上。優(yōu)選地，所述野生型及突變型ASPE引物對選自針對CYP3A4*1BSNP位點的由SEQIDN0.1和SEQIDN0.21組成的序列及由SEQIDN0.2和SEQIDN0.22組成的序列、針對CYP3A4*2SNP位點的由SEQIDN0.3和SEQIDN0.23組成的序列及由SEQIDN0.4和SEQIDNO.24組成的序列、針對CYP3A4*3SNP位點的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.25組成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.26組成的序列、針對CYP3A4*4SNP位點的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.27組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.28組成的序列、針對CYP3A4*5SNP位點的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.29組成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.30組成的序列、針對CYP3A4祁SNP位點的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.31組成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.32組成的序列、針對CYP3A4*15SNP位點的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.33組成的序列及由SEQIDNO.14和SEQIDNO.34組成的序列、針對CYP3A4*17SNP位點的由SEQIDN0.15和SEQIDNO.35組成的序列及由SEQIDNO.16禾口SEQIDNO.36組成的序列、針對CYP3A4*18SNP位點的由SEQIDNO.17和SEQIDNO.37組成的序列及由SEQIDNO.18和SEQIDNO.38組成的序列、和針對CYP3A4*19SNP位點的由SEQIDNO.19和SEQIDNO.39組成的序列及由SEQIDNO.20和SEQIDNO.40組成的序列中的一對或多對。本發(fā)明的另一目的是提供CYP3A4基因SNP檢測的特異性引物序列，該引物序列特異性強，能準(zhǔn)確區(qū)分各種基因型，并且多位點同步檢測不存在交叉反應(yīng)率。用于CYP3A4基因SNP檢測的特異性引物，包括有針對CYP3A4*1BSNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.21及SEQIDN0.22；針對CYP3A4*2SNP位點的S野生型和突變型的EQIDN0.23及SEQIDN0.24；針對CYP3A4*3SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.25及SEQIDN0.26；針對CYP3A4*4SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.27及SEQIDN0.28；針對CYP3A4*5SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.29及SEQIDN0.30；針對CYP3A4*6SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.31及SEQIDN0.32；針對CYP3A4*15SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.33及SEQIDN0.34；針對CYP3A4*17SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.35及SEQIDN0.36；針對CYP3A4*18SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.37及SEQIDN0.38；和/或針對CYP3A4*19SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.39及SEQIDN0.40。本發(fā)明的另一目的是提供使用上述液相芯片對CYP3A4基因SNP進行檢測的方法。一種使用上述液相芯片對CYP3A4基因SNP檢測的方法，主要包括以下步驟(一)PCR擴增待測樣品DNA；(二)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-IT試劑盒進行酶切處理；(三)用所述ASPE引物進行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記；(四)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進行雜交反應(yīng)；(五)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應(yīng)；(六)通過熒光檢測儀檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1.本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100%。所制備的CYP3A4基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個SNP位點的并行檢測。2.本發(fā)明設(shè)計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型。3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，可通過一步多重PCR即可完成七個具有SNP位點的目標(biāo)序列的擴增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間遠遠低于常用的測序技術(shù)，特別符合臨床需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。具體實施例方式實施例1CYP3A4基因SNP檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE引物針對CYP3A4的十種常見SNP位點，分別設(shè)計特異性的引物序列。其中CYP3A4*1B為A392G突變，發(fā)生在5，UTR；CYP3A4*2為T664C突變，發(fā)生在外顯子7；CYP3A4*3為T1334C突變，發(fā)生在外顯子12；CYP3A4*4為A352G突變，發(fā)生在外顯子5；CYP3A4*5為C653G突變，發(fā)生在外顯子7；CYP3A4*6為831insA，發(fā)生在外顯子9；CYP3A4*15為G485A突變，發(fā)生在外顯子6，CYP3A4*17為T566C突變，發(fā)生在外顯子7；CYP3A4*18為T878C突變，發(fā)生在外顯子10；CYP3A4*19為C1399T突變，發(fā)生在外顯子12。ASPE引物由“Tag+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表1ASPE引物序列(Tag+特異性引物序列)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>C1399T-mTTCAT(SEQN0.20)AT3'(SEQN0.40)每條ASPE引物包括兩個部分，5’端為針對相應(yīng)微球上anti-tag序列的特異性tag序列，3’端為突變型或野生型特異性引物序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用lOmmol/LTrisBufferm制成lOOpmol/mL的貯存液。二、anti-tag序列包被的微球根據(jù)所設(shè)計的ASPE引物序列，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的anti-tag序列之間以及tag與ASPE引物序列可能形成的二級結(jié)構(gòu)，選擇的二十種微球編號與微球上相應(yīng)的anti-tag序列如表2所示表2微球編號與微球上相應(yīng)的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>選擇的20種微球購自美國Luminex公司，將anti-tag序列包被與微球上。anti-tag序列與微球之間連接有5-10個T的間隔臂序，即在每個anti-tag序列前加上一段5-10個T的間隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的anti-tag序列用滅菌ddH20配成lOOnmol/ml的貯存液。所述間隔臂為用于將anti-tag與微球表面間隔開來或是將anti-tag置于親水性環(huán)境中的序列。通過在anti-tag序列與微球之間設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(η彡3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用Poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5-10個T，微球包被的過程如下分別取5XIO6個上述編號的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入IOul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配M10ng/ml白勺EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(_自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02%的Tween-20洗滌一次，再用0.的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有anti-tag序列的微球重懸于IOOul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，lmmol/LEDTA中，2_8°C避光保存。三、擴增出具有SNP位點的目標(biāo)序列的引物目標(biāo)檢測的十種常見的CYP3A4SNP位點發(fā)生在不同的外顯子上，其中，A392G發(fā)生在5，UTR,A352G發(fā)生在外顯子5，831insA發(fā)生在外顯子9，G485A發(fā)生在外顯子6，T878C發(fā)生在外顯子10，CYP3A4*2、CYP3A4*5和CYP3A4*17均發(fā)生在外顯子7，設(shè)計一對引物擴增出含有3個突變位點的目標(biāo)序列；CYP3A4*3和CYP3A4*19均位于外顯子12，設(shè)計一對引物擴增出含有2個突變位點的目標(biāo)序列。利用Primer5.0設(shè)計七對引物(見表3)，分別擴增出七條具有SNP位點的目標(biāo)序列。表3擴增出具有SNP位點的目標(biāo)序列的引物SEQ基因外顯子類型擴增引物NO.61CYP5'UTRA392G-Forward5'TCCACCAGCCTTTCTAGTTG3*<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用IOmmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的C存液。實施例2運用CYP3A4基因SNP檢測液相芯片對臨床樣本的檢測所述各種溶液的配方如下50mM的MES緩沖液(ρΗ5·0)配方(250ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>過濾后貯存于4°C。ExoSAP-IT試劑盒購自美國USB公司。生物素標(biāo)記的dCTP購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。一、樣本的DNA提取參照AxyPr印全血基因組小量提取試劑盒說明，得到待檢測的DNA。二、待測樣品的PCR擴增利用Primer5.0設(shè)計七對引物，多重PCR—步擴增出CYP3A4的5，UTR、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子9、外顯子10和外顯子12共七條具有SNP位點的目標(biāo)序列，產(chǎn)物大小分別為758bp、594bp、460bp、539bp、401bp、437bp、553bp。引物序列(SEQNO.61-74)見上述表3所示。首先配制多重PCR引物工作液分別各取SEQNO.61_74的引物貯存液IOOul于1.5ml微量離心管中，混合均勻即為多重PCR引物工作液。多重PCR反應(yīng)體系如下PCR擴增程序為95°C3min；94°C20s，56°C30s,72°C30s，30個循環(huán)；72°CIOmin；4°C保存?zhèn)溆?。三、PCR產(chǎn)物的酶切處理參照ExoSAP-IT試劑盒說明，詳細步驟如下1.取7.5ulPCR反應(yīng)后的產(chǎn)物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37°C孵育15min。80°C孵育15min，使多余的酶滅活。酶切處理后的產(chǎn)物直接用于后續(xù)的ASPE引物延伸反應(yīng)。四、位點特異的引物延伸反應(yīng)(ASPE)利用上述設(shè)計的位點特異性引物進行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記。首先配制混合的ASPE引物工作液分別各取A392Gi，A392G_m，T664C-W,T664C-m,T1334C-W,T1334C_m，A352G_w，A352G_m，C653G_w，C653G_m，831insA-w，831insA-m,G485A-W,G485A_m，T566C-W,T566C_m，T878C-W,T878C_m，C1399T-W,C1399T_m相應(yīng)的ASPE引物貯存液IOul于1.5ml微量離心管中，混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應(yīng)的體系如下10*緩沖液2ulMgCl2(50mmol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各lOOumol/L)IulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)Iul酶切處理的PCR擴增產(chǎn)物5ulddH20IOul_共20ulPCR程序為96°C2min；94°C30s,58°Clmin，72°C2min，30個循環(huán)；4°C保存?zhèn)溆?。五、雜交反應(yīng)1.根據(jù)設(shè)計的ASPE引物，選擇相應(yīng)的最優(yōu)的二十種微球(微球濃度均為2.5XIO5個/ml)。每種微球分別帶有不同顏色編碼，同時每種微球表面分別連接有一段24bp的特異性的寡核苷酸序列(anti-tag)，這些anti-tag序列能分別與對應(yīng)的ASPE引物5’端的tag序列特異結(jié)合；2.分別取Iul每種編號的微球于1.5ml的微量離心管中；3.微球于≥10000g離心l_2min；4.棄去上清，微球重懸于IOOul的2XTm雜交緩沖液中，渦旋混勻；5.取25ul上述微球懸液于96孔濾板相應(yīng)的孔中，對照孔加25ul的ddH20；6.取5_25ul的ASPE反應(yīng)液于相應(yīng)的孔中，用ddH20補足至50ul；7.用錫箔紙包住96孔板以避光，95°C60s,37°C15min孵育雜交；8.雜交后的微球于≥3000g離心2-5min；9.去上清，將微球重懸于75ul的IXTm雜交緩沖液中；10.微球于≥3000g離心2_5min；11將微球重懸于75ul的IXTm雜交緩沖液中，加入15ul濃度為10ug/ml的鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE)；12.37°C孵育15min，于Luminex儀器上檢測。六、結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測。以聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸分子進行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，檢測結(jié)果如表4表7所示。對熒光值(MFI)和數(shù)據(jù)處理有以下要求1.每個位點需至少有一個等位基因MFI大于300而且大于10XPCR陰性對照MFI；2.NETMFI=樣品MFI-PCR陰性對照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；3.滿足以上兩個條件的數(shù)據(jù)，按下列公式計算突變比值突變比值=突變型NETMFI+(突變型NETMFI+野生型NETMFI)4.根據(jù)經(jīng)驗對每個檢測位點的突變比值確定閾值(cut-off值)，以劃分野生型純合子、雜合子和突變型純合子。使用本方法檢測大量樣本的CYP3A4基因多態(tài)性，實驗數(shù)據(jù)符合上述要求，因此可計算得它們的突變比值。閾值(cut-off值)的設(shè)置如下突變比值范圍在0%-20%視為野生型純合子；30%-70%視為雜合子；80%-100%視為變異型純合子。以測序法檢測與液相芯片結(jié)果作對照，計算本發(fā)明所提供的分型方法檢測結(jié)果的吻合率。本方法檢測20份樣本的TPMT基因型檢測結(jié)果與測序結(jié)果吻合率達到100%?？梢姳景l(fā)明所提供的TPMT基因SNP檢測液相芯片能夠準(zhǔn)確地檢測出CYP3A4基因的SNP類型，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。表4樣本檢測結(jié)果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5樣本檢測結(jié)果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表6樣本檢測結(jié)果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表7樣本CYP3A4基因多態(tài)性分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例3不同的ASPE引物的液相芯片對CYP3A4基因SNP檢測基因突變的檢測一、液相芯片制備的設(shè)計(Tag序列及Anti-Tag序列的選擇)以CYP3A4基因CYP3A4*1B(A392G)位點突變的檢測液相芯片為例，針對A392G的野生型和突變型設(shè)計ASPE引物3’端的特異性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列則選自SEQIDNO.I-SEQIDNO.20中的6條，相應(yīng)的，包被于微球上的與對應(yīng)tag序列互補配對的anti-tag序列選擇SEQIDNO.41-SEQIDNO.60。具體設(shè)計如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、擴增引物、檢測方法等如實施例1和實施例2所述。表8液相芯片制備的設(shè)計<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>二、樣品檢測采用上述設(shè)計制備的液相芯片，按實施例2所述檢測過程和方法對血清樣品21-40進行檢測，檢測結(jié)果如下表9樣本檢測結(jié)果(MFI)與基因多態(tài)性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>以上是針對本發(fā)明的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。序列表<110>廣州益善生物技術(shù)有限公司<120>一種CYP3A4基因SNP檢測特異性引物、液相芯片及方法<160>74<170>PatentInversion3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1ctttaatcctttatcactttatca24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2aatcaatcttcattcaaatcatca24<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>3ataccaataatccaattcatatca24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4ttcacttttcaatcaactttaatc24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5caatatcatcatctttatcattac24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6attattcacttcaaactaatctac24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7ctttttcaatcactttcaatteat24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8cttttacaatacttcaatacaatc24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9tcataatctcaacaatctttcttt24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列.<400>10ttcaatcattcaaatctcaacttt24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>11caatttactcatatacatcacttt24<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>12cttttcatcaataatcttaccttt24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>13aatcttactacaaatcctttcttt24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>14tcatttactc<210>15<211>24<212>DNA<213〉人工序列<400>15tcaattaccttttcaatacaatac24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>16tcaatcaattacttactcaaatac24<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>17cttttcaattacttcaaatcttca24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>18actatactatctac24<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>19tccaataatcteat24<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>20tcattcatatacataccaatteat24<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>21gccatagagacaagggcaa19<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>22gccatagagacaagggcag19<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>23ttttggatccattctttctct21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>24ttttggatccattctttctcc21<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>25ccagaaactgcattggcat19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>26ccagaaactgcattggcac19<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>27gggatttatgaaaagtgcca20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28gggatttatgaaaagtgccg20<210>29<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>29taagatttgattttttggatcc22<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>30taagatttgattttttggateg22<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>31ccttcagctgatgattgac19<210>32<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>32ccttcagctgatgattgaa19<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>33ggtgagaaatctgaggcg18<210>34<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>34ggtgagaaatctgaggca18<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>35gtgatcactagcacatcatt20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>36gtgatcactagcacatcatc20<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>37tttcagctctgtccgatct19<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>38tttcagctctgtccgatcc19<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>39tcagaacttctccttcaaac20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>40tcagaacttctccttcaaat20<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>41tgataaagtgataaaggattaaag24<210>42<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>42tgatgatttgaatgaagattgatt24<210>43<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>43gtattgtattgaaaaggtaattga24<210>44<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>44gtatttgagtaagtaattgattga24<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>45aaagaaagattgttgagattatga24<210>46<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>46aaagttgagatttgaatgattgaa24<210>47<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>47tgatatgaattggattattggtat24<210>48<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>48gattaaagttgattgaaaagtgaa24<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列.<400>49gtaatgataaagatgatgatattg24<210>50<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>50gtagattagtttgaagtgaataat24<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>51atgagattattggatttgtagatt24<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>52atgaattggtatgtatatgaatga24<210>53<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>53atgaattgaaagtgattgaaaaag24<210>54<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>54gattgtattgaagtattgtaaaag24<210>55<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>55aaagtgatgtatatgagtaaattg24<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>56aaaggtaagattattgatgaaaag24<210>57<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>57aaagaaaggatttgtagtaagatt24<210>58<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>58gatttgtaattgttgagtaaatga24<210>59<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>59tgaagatttgaagtaattgaaaag24<210>60<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>60gtagatagtatagttgtaatgtta24<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>61tccaccagcctttctagttg20<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>62ctgagtcttcctttcagctct21<210>63<211>19<212>DNA<213〉人工序列<400>63tagcatagggcccatcacc19<210>64<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>64aaccccatggctgcgctt18<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>65tcacttactgctccatgctg20<210>66<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>66ccctaaaggatatatttagtcttct25<210>67<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>67gtgatagaaggtgatctagtaga23<210>68<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>68tgattagtggttgcatatgatg22<210>69<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>69agggagatcaaggaccacg19<210>70<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>70tccacagaccgcagactga19<210>71<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>71gaaaccacccccagtgtac19<210>72<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>72agccttcctacatagagtcag21<210>73<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>73aacgtggaaccagattcagc20<210>74<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>74cttctccaagttctggttgg20權(quán)利要求一種CYP3A4基因SNP檢測液相芯片，其特征在于主要包括有(1)針對每種型別的SNP位點分別設(shè)計的野生型和突變型ASPE引物對，每種ASPE引物對由5’端的tag序列和3’端的針對目的基因SNP位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列分別選自SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、SEQIDNO.23及SEQIDNO.24、SEQIDNO.25及SEQIDNO.26、SEQIDNO.27及SEQIDNO.28、SEQIDNO.29及SEQIDNO.30、SEQIDNO.31及SEQIDNO.32、SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、SEQIDNO.35及SEQIDNO.36、SEQIDNO.37及SEQIDNO.38、和SEQIDNO.39及SEQIDNO.40中的一對或多對；所述tag序列選自SEQIDNO.1～SEQIDNO.20中的序列；(2)分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補配對，所述anti-tag序列選自SEQIDNO.41～SEQIDNO.60中的序列；(3)用于擴增具有CYP3A4*1B、CYP3A4*2、CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18和CYP3A4*19中的一個或多個SNP位點的CYP3A4基因目標(biāo)序列的引物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP3A4基因SNP檢測液相芯片，其特征在于所述野生型及突變型ASPE引物對選自針對CYP3A4*1BSNP位點的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.21組成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.22組成的序列、針對CYP3A4*2SNP位點的由SEQIDNO.3和SEQIDN0.23組成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.24組成的序列、針對CYP3A4*3SNP位點的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.25組成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDNO.26組成的序列、針對CYP3A4*4SNP位點的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.27組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDN0.28組成的序列、針對CYP3A4*5SNP位點的由SEQIDNO.9和SEQIDNO.29組成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.30組成的序列、針對CYP3A4*6SNP位點的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.31組成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.32組成的序列、針對CYP3A4*15SNP位點的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.33組成的序列及由SEQIDNO.14和SEQIDNO.34組成的序列、針對CYP3A4*17SNP位點的由SEQIDNO.15和SEQIDNO.35組成的序列及由SEQIDNO.16和SEQIDNO.36組成的序列、針對CYP3A牡18SNP位點的由SEQIDNO.17和SEQIDNO.37組成的序列及由SEQIDNO.18和SEQIDNO.38組成的序列、和針對CYP3A4*19SNP位點的由SEQIDN0.19和SEQIDNO.39組成的序列及由SEQIDNO.20和SEQIDNO.40組成的序列中的一對或多對。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP3A4基因SNP檢測液相芯片，其特征在于所述用于擴增的引物包括針對CYP3A4*1BSNP位點的SEQIDNO.61和SEQIDNO.62；針對CYP3A4*4SNP位點的SEQIDN0.63和SEQIDNO.64；針對CYP3A4*15SNP位點的SEQIDNO.65和SEQIDNO.66；針對CYP3A4*2、CYP3A4*5和CYP3A4*17SNP位點的SEQIDNO.67和SEQIDNO.68；針對CYP3A4*6SNP位點的SEQIDNO.69和SEQIDNO.70；針對CYP3A4*18SNP位點的SEQIDN0.71和SEQIDNO.72；和針對CYP3A4*3和CYP3A4*19SNP位點的SEQIDNO.73和SEQIDN0.74中的一對或多對。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP3A4基因SNP檢測液相芯片，其特征在于(2)中所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP3A4基因SNP檢測液相芯片，其特征在于主要包括有(1)所述野生型及突變型ASPE引物對為針對CYP3A4*1BSNP位點的由SEQIDNO.1和SEQIDNO.21組成的序列及由SEQIDNO.2和SEQIDNO.22組成的序列；針對CYP3A4*2SNP位點的由SEQIDNO.3和SEQIDNO.23組成的序列及由SEQIDNO.4和SEQIDNO.24組成的序列；針對CYP3A4*3SNP位點的由SEQIDNO.5和SEQIDNO.25組成的序列及由SEQIDNO.6和SEQIDN0.26組成的序列；針對CYP3A4*4SNP位點的由SEQIDNO.7和SEQIDNO.27組成的序列及由SEQIDNO.8和SEQIDNO.28組成的序列；針對CYP3A4*5SNP位點的由SEQIDNO.9和SEQIDN0.29組成的序列及由SEQIDNO.10和SEQIDNO.30組成的序列；針對CYP3A4*6SNP位點的由SEQIDNO.11和SEQIDNO.31組成的序列及由SEQIDNO.12和SEQIDNO.32組成的序列；針對CYP3A4*15SNP位點的由SEQIDNO.13和SEQIDNO.33組成的序列及由SEQIDNO.14和SEQIDNO.34組成的序列；針對CYP3A4*17SNP位點的由SEQIDNO.15和SEQIDNO.35組成的序列及由SEQIDNO.16和SEQIDNO.36組成的序列；針對CYP3A4*18SNP位點的由SEQIDNO.17和SEQIDNO.37組成的序列及由SEQIDNO.18禾口SEQIDNO.38組成的序列；和針對CYP3A4*19SNP位點的由SEQIDNO.19禾口SEQIDNO.39組成的序列及由SEQIDNO.20和SEQIDNO.40組成的序列；(2)分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補配對；所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列為SEQIDNO.41SEQIDNO.60中的序列；(3)用于擴增具有CYP3A4*1B、CYP3A4*2、CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18和CYP3A4*19SNP位點的CYP3A4基因目標(biāo)序列的引物，所述引物為針對CYP3A4*1BSNP位點的SEQIDNO.61和SEQIDNO.62，針對CYP3A4*4SNP位點的SEQIDNO.63和SEQIDNO.64，針對CYP3A4*15SNP位點的SEQIDNO.65和SEQIDN0.66，針對CYP3A4*2、CYP3A4*5禾口CYP3A4*17SNP位點的SEQIDNO.67和SEQIDNO.68，針對CYP3A4*6SNP位點的SEQIDNO.69和SEQIDNO.70；針對CYP3A4*18SNP位點的SEQIDN0.71和SEQIDNO.72；和針對CYP3A4*3和CYP3A4*19SNP位點的SEQIDNO.73和SEQIDN0.74。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的CYP3A4基因SNP檢測液相芯片，其特征在于所述間隔臂序列為5-10個T。7.一種使用權(quán)利要求1-6任一項所述的液相芯片對CYP3A4基因SNP檢測的方法，其特征在于主要包括以下步驟(一)PCR擴增待測樣品DNA;(二)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-IT試劑盒進行酶切處理；(三)用所述ASPE引物進行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記；(四)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進行雜交反應(yīng)；(五)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應(yīng)；(六)通過熒光檢測儀檢測。8.用于CYP3A4基因SNP檢測的特異性引物，其特征在于包括有針對CYP3A4*1BSNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.21及SEQIDNO.22；針對CYP3A4*2SNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.23及SEQIDNO.24；針對CYP3A4*3SNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.25及SEQIDNO.26；針對CYP3A4*4SNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.27及SEQIDN0.28；針對CYP3A4*5SNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.29及SEQIDNO.30；針對CYP3A4*6SNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.31及SEQIDNO.32；針對CYP3A4*15SNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.33及SEQIDNO.34；針對CYP3A4*17SNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.35及SEQIDNO.36；針對CYP3A4*18SNP位點的野生型和突變型的SEQIDNO.37及SEQIDNO.38；和/或針對CYP3A4*19SNP位點的野生型和突變型的SEQIDN0.39及SEQIDNO.40。全文摘要本發(fā)明公開了CYP3A4基因SNP檢測特異性引物、液相芯片和方法，所述液相芯片包括針對每種型別的突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型ASPE引物對、分別包被有特異的anti-tag序列的微球，和用于擴增具有CYP3A4*1B、CYP3A4*2、CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18和/或CYP3A4*19SNP位點的CYP3A4基因目標(biāo)序列的引物。所制備的CYP3A4基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。本發(fā)明設(shè)計的ASPE引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種類型的突變位點。所述檢測方法步驟簡單，十種SNP位點可以一步檢測完成，操作方便，并且避免了多次操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率。文檔編號C12Q1/68GK101812511SQ200910214369公開日2010年8月25日申請日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者何嘉英,曾濤,許嘉森申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司