專利名稱：一種slc22a1基因多態(tài)性檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種SLC22A1基因多態(tài)性檢測特異性引物和液相芯片。
背景技術(shù)：
有機陽離子轉(zhuǎn)運體I (0CT1，編碼基因SLC22A1)是一種具有基因多態(tài)性的轉(zhuǎn)運蛋白，主要分布于人的肝臟，介導(dǎo)一些藥物、毒物和內(nèi)源性化合物等一系列有機陽離子的轉(zhuǎn)運。SLC22A1在許多外源性藥物的吸收、分布和排泄中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，SLC22A1基因多態(tài)性是造成其轉(zhuǎn)運功能個體差異的主要原因。目前，對SLC22A1基因多態(tài)性進行檢測和分析的方法很少，主要有直接測序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內(nèi)切酶識別位點的改變，如位點丟失或產(chǎn)生新位點，通過PCR擴增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產(chǎn)生新酶切位點的基因突變檢測。再次，以上這些方法都存在著檢測通量的局限性，每次只能檢測一種突變類型，不能滿足實際應(yīng)用的需要。本發(fā)明目標檢測的SLC22A1基因突變位點，如表所示
序號 SLC22A1位點突變的內(nèi)容簡寫
~SEQ ID NO. 75的第117位核苷酸，發(fā)生C —T突變C117T
2SEQ ID NO. 75的第198位核苷酸，發(fā)生T — C突變T198C
~SEQ ID NO. 76的第86位核苷酸，發(fā)生C — T突變C86T
~SEQ ID NO. 76的第97位核苷酸，發(fā)生C — G突變C97G
5SEQ ID NO. 77的第164位核苷酸，發(fā)生C — T突變C164T
~6SEQ ID NO. 78的第123位核苷酸，發(fā)生G — T突變G123T
~1SEQ ID NO. 79的第127位核苷酸，發(fā)生G — A突變G127A
SEQ ID NO. 79的第148位核苷酸，發(fā)生A — G突變A148G
9SEQ ID NO. 80的第129位核苷酸，發(fā)生G — C突變G129CSEQ ID NO. 75TCCTCATCTTATGCCTGCTGTCGGCTGCCTTTGCGCCCATCTGTGTGGGCATCGTCTTCCTGGGTTTCACACCTGACCACCACTGCCAGAGTCCTGGGGTGGCTGAGCTGAGCCAGCGCTGTGGCTGGAGCCCTGCGGAGGAGCTG
AACTATACAGTGCCAGGCCTGGGGCCCGCGGGCGAGGCCTTCCTTGGCCAGTGCAGGCGCTATGAAGTGGACTGGAA
CCAGAGCGCCCTCAGCTGTGTAGACCCCCTGGCTAGCCTGGCCACCAACAGGAGCCACCTGCCGCTGGGTCCCTGCC
AGGATGGCTGGGTGTATGACACGCCCGGCTCTTCCATCGTCACTGSEQ ID NO. 76GAGCAACAGCATCACCCCGCTCAGGGCTGAACGTCAGACCGAGGAAAATGCCAGATAGTGATGAGTGGTGTTCGCAGGTGTGTGCCGGAGTCCCCTCGGTGGCTGTTATCACAAAAAAGAAACACTGAAGCAATAAAGATAATGGA CCACATCGCTCAAAAGAATGGGAAGTTGCCTCCTGCTGATTTAAAGGTGAAATCTAGGAAGGGGTATCTCACATCACTGAATCTGGGGCTGGGTTCTGGTGCAGATTCGTCTGGGGCTGCCAGGGGAAAGAGCAGAACTGTGCCCCTSEQ ID NO. 77 GAAGCACGGTGGTGGCAAGGCTCACCTCCCCAGGGGCTCCCAGGTGGCTCTGCTCATGACAGCGTGAGTGTGGCTGATGCTCTCCCTCCCTCCTAGATGCTTTCCCTCGAAGAGGATGTCACCGAAAAGCTGAGCCCTTCATTTGCAGACCTGTTCCGCACGCCGCGCCTGAGGAAGCGCACCTTCATCCTGATGTACCTGTGGTGAGGGGCGTTCCTGTGCGTCTCTCCAGGCAGAATCAGCACGCTYGCCCAAGCACTGGGCTATAGATTAGAGACAGTGGAATACTCAGGTGGAAAAAGAGAAAGGGAAASEQ ID NO. 78CCTGGGAACTGTGCTGGTCAACGCGGTGTCGGGCGTGCTCATGGCCTTCTCGCCCAACTACATGTCCATGCTGCTCTTCCGCCTGCTGCAGGGCCTGGTCAGCAAGGGCAACTGGATGGCTGGCTACACCCTAAGTAATTATCATGGGGATGAGGCCAGGTCTCAGGGTAGAATGGGATGGGCCTAACGTGGGTAGGGGGTTGTTTGTGGGGTCAAGGAGCTTGCGGGGCACCAGTTCCTTGTATTTATGTGACTAGGGCAGGACATGGGCTSEQ ID NO. 79GTGCTCTATCAGGGGCTCATCCTGCACATGGGCGCCACCAGCGGGAACCTCTACCTGGATTTCCTTTACTCCGCTCTGGTCGAAATCCCGGGGGCCTTCATAGCCCTCATCACCATTGACCGCGTGGGCCGCATCTACCCCATGGCCATGTCAAATTTGTTGGCGGGGGCAGCCTGCCTCGTCATGATTTTTATCTCACCTGGTAAGTTGGTAAGTTGTCTGCTTTCATCATTTCCCAGGCAATCGAAGTGTGGGGAAAGTGTTGTGACTCTTTGATAAGCCTCTGGAATGAGAACAAAGATGAGGTGCSEQ ID NO. 80GAGCACTGGACAGCCACAGCAAGCTGCAGGTATTGGCATTGTACTTGTTTTAGCATCAGGTGAACATTTGGAAAAGTGAATCACAGAATTATCGTATTTTTTGTCCTTTGTATTTTATCAGGAACCTCGGAGTGATGGTGTGTTCCTCCCTGTGTGACATAGGTGGGATAATCACCCCCTTCATAGTCTTCAGGCTGAGGGAGGTCTGGCAAGCCTTGCCCCTCATTTTGTTTGGTAAGATTTTGTGGAGCATATATCATTCCTTCTTTTGCAGCTCGGCAGTGGGCTCAGCATGGGTGGAACTGAGTGTGAGTACTCAGTCGTATTTGTTGAGTGAAGGGAATGATATCTCTCAGTGAGTTTACAGAAGGCAAGGATGATGCATGCTCTTGGGATGTCTTCTGGCTTA

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片，該液相芯片可用于單項或者并行檢測SLC22A1基因九種常見基因型C117T、T198C、C86T、C97G、C164T、G123T、G127A、A148G和G129C的野生型和突變型。一種SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片，包括有
(A).針對SLC22A1基因不同多態(tài)性位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因多態(tài)性位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對C117T位點的SEQ ID NO. 19及SEQ ID NO. 20 ;針對T198C 位點的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;針對 C86T 位點的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ IDNO. 24 ;針對 C97G位點的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26 ;針對 C164T 位點的 SEQ ID NO. 27及 SEQ ID NO. 28 ;針對 G123T 位點的 SEQ ID NO. 29 及 SEQ ID NO. 30 ;針對 G127A 位點的SEQ ID NO. 31 及 SEQ IDN0. 32 ;針對 A148G 位點的 SEQ ID NO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ;和 / 或針對 G129C 位點的 SEQ IDN0. 35 及 SEQ ID NO. 36 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID NO. I SEQID NO. 18 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 37 SEQ ID NO. 54，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增出需要檢測的、具有相應(yīng)多態(tài)性位點的目標序列的引物。優(yōu)選地，所述擴增引物為針對C117T、T198C位點的SEQ ID NO. 55及SEQ IDNO. 56 ;針對 C86T、C97G 位點的 SEQ ID NO. 57 及 SEQ ID NO. 58 ;針對 C164T 位點的 SEQ IDNO. 59 及 SEQID NO. 60 ;針對 G123T 位點的 SEQ ID NO. 61 及 SEQ ID NO. 62 ;針對 G127A、A148G 位點的 SEQID NO. 63 及 SEQ ID NO. 64 ;和 / 或針對 G129C 位點的 SEQ ID NO. 65 及SEQ ID NO. 66。優(yōu)選地，所述ASPE引物為針對C117T位點的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 19組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 20組成的序列；針對T198C位點的由SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 21組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 22組成的序列；針對C86T位點的由SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 23組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 24組成的序列；針對C97G位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 25組成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 26組成的序列；針對C164T位點的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 27組成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQID NO. 28組成的序列；針對G123T位點的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 29組成的序列及由SEQID NO. 12和SEQ ID NO. 30組成的序列；針對G127A位點的由 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 31 組成的序列及由 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 32組成的序列；針對A148G位點的由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 33組成的序列及由SEQ IDNO. 16和SEQ ID NO. 34組成的序列；和/或針對G129C位點的由SEQ ID NO. 17和SEQ IDNO. 35組成的序列及由SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 36組成的序列。本發(fā)明的另一目的是提供用于SLC22A1基因多態(tài)性檢測的特異性引物。用于SLC22A1基因多態(tài)性檢測的特異性引物，該特異性引物為針對C117T位點的 SEQ IDN0. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;針對 T198C 位點的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;針對 C86T 位點的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24 ;針對 C97G 位點的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ IDNO. 26 ;針對C164T位點的SEQ ID NO. 27及SEQ ID NO. 28 ;針對G123T位點的SEQ ID NO. 29及 SEQ ID NO. 30 ;針對 G127A 位點的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32 ;針對 A148G 位點的SEQ ID NO. 33 及 SEQ IDN0. 34 ;和 / 或針對 G129C 位點的 SEQ ID NO. 35 及 SEQ ID NO. 36。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于I.本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100%，且檢測所需要的時間遠遠低于常用的測序技術(shù)，特別符合實際應(yīng)用需要。所制備的SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標簽序列、anti-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個多態(tài)性位點的并行檢測。2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設(shè)計經(jīng)驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標檢測的突變位點，準確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標檢測的PCR擴增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的多態(tài)性情況，檢測效果一致。3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，九種多態(tài)性位點檢 測可通過一步多重PCR即可完成六條含有多態(tài)性位點的目標序列的擴增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準確可靠。
具體實施例方式實施例I SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對SLC22A1 基因九種常見基因型 C117T、T198C、C86T、C97G、C164T、G123T、G127A、A148G和G129C的野生型和突變型，分別設(shè)計特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表I SLC22A1基因的ASPE弓丨物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是，包括有 (A).針對SLC22A1基因不同多態(tài)性位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因多態(tài)性位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對C117T位點的SEQ ID NO. 19及SEQ ID NO. 20 ;針對T198C位點的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;針對 C86T 位點的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24 ；針對 C97G 位點的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26 ;針對 C164T 位點的 SEQ ID NO. 27 及 SEQID NO. 28 ;針對 G123T 位點的 SEQ ID NO. 29 及 SEQ ID NO. 30 ;針對 G127A 位點的 SEQ IDNO. 31 及SEQ IDN0.32 ;針對A148G位點的SEQ ID NO. 33及SEQ ID NO. 34 ;和/或針對G129C位點的 SEQ IDNO. 35 及 SEQ ID NO. 36 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 18 ； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 37 SEQ ID NO. 54，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).用于擴增出需要檢測的、具有相應(yīng)多態(tài)性位點的目標序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為針對 C117T、T198C 位點的 SEQ ID NO. 55 及 SEQ ID NO. 56 ;針對 C86T、C97G 位點的 SEQIDNO. 57 及 SEQ ID NO. 58 ;針對 C164T 位點的 SEQ ID NO. 59 及 SEQ ID NO. 60 ;針對 G123T位點的 SEQ ID NO. 61 及 SEQ ID NO. 62 ;針對 G127A、A148G 位點的 SEQ ID NO. 63 及 SEQ IDNO. 64 ;和 / 或針對 G129C 位點的 SEQ ID NO. 65 及 SEQ ID NO. 66。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為:針對C117T位點的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 19組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 20組成的序列；針對T198C位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 21組成的序列及由SEQ IDNO. 4和SEQ ID NO. 22組成的序列；針對C86T位點的由SEQ ID NO. 5和SEQID NO. 23組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 24組成的序列；針對C97G位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ IDNO. 25組成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 26組成的序列；針對C164T位點的由SEQ IDNO. 9和SEQ ID NO. 27組成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQID NO. 28組成的序列；針對G123T位點的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 29組成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 30組成的序列；針對G127A位點的由SEQ ID NO. 13和SEQID NO. 31組成的序列及由SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 32組成的序列；針對A148G位點的由 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 33 組成的序列及由 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 34 組成的序列；和/或針對G129C位點的由SEQ ID NO. 17和SEQID NO. 35組成的序列及由SEQ IDNO. 18和SEQ ID NO. 36組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是， (A).所述ASPE引物為針對C117T位點的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 19組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 20組成的序列；針對T198C位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 21組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 22組成的序列；針對C86T位點的由SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 23組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 24組成的序列；針對C97G位點的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 25組成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 26組成的序列；針對C164T位點的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 27組成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQID NO. 28組成的序列；針對G123T位點的由SEQ ID NO. 11和SEQID NO. 29組成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 30組成的序列；針對G127A位點的由 SEQ ID NO. 13 和 SEQ IDNO. 31 組成的序列及由 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 32 組成的序列；針對A148G位點的由SEQID NO. 15和SEQ ID NO. 33組成的序列及由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 34組成的序列；和針對G129C位點的由SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 35組成的序列及由SEQ ID NO. 18和SEQ IDNO. 36組成的序列； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 37 SEQ ID NO. 54，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).所述擴增引物為針對C117T、T198C位點的SEQID NO. 55及SEQ ID NO. 56 ;針對 C86T、C97G 位點的 SEQ ID NO. 57 及 SEQ ID NO. 58 ;針對 C164T 位點的 SEQ ID NO. 59 及SEQID NO. 60 ;針對 G123T 位點的 SEQ ID NO. 61 及 SEQ ID NO. 62 ;針對 G127A、A148G 位點的 SEQID NO. 63 及 SEQ ID NO. 64 ;和針對 G129C 位點的 SEQ ID NO. 65 及 SEQ ID NO. 66。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的SLC22A1基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10個T。
6.用于SLC22A1基因多態(tài)性檢測的特異性引物，其特征是，該特異性引物為針對C117T 位點的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;針對 T198C 位點的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ IDNO. 22 ;針對 C86T 位點的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24 ;針對 C97G 位點的 SEQ ID NO. 25及 SEQ ID NO. 26 ;針對 C164T 位點的 SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28 ;針對 G123T 位點的SEQ ID NO. 29 及 SEQ IDNO. 30 ;針對 G127A 位點的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32 ;針對A148G 位點的 SEQ ID NO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ;和 / 或針對 G129C 位點的 SEQ ID NO. 35 及SEQ ID NO. 36。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種SLC22A1基因檢測液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為針對C117T位點的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20；針對T198C位點的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22；針對C86T位點的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；針對C97G位點的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26；針對C164T位點的SEQ ID NO.27及SEQID NO.28；針對G123T位點的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30；針對G127A位點的SEQ IDNO.31及SEQ ID NO.32；針對A148G位點的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34；和/或針對G129C位點的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36；有anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達100％，實現(xiàn)多個突變位點的野生型和突變型并行檢測。
文檔編號C12N15/11GK102952874SQ20111025173
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者許嘉森, 羅可銀 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司