專利名稱：一種肝癌組織特異性rna干擾系統(tǒng)及其建立和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)及其建立和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是嚴重威脅人類健康的惡性疾病。其發(fā)病率雖只列惡性腫瘤發(fā)病率的第六位，但是死亡率卻高居第三位。中國是原發(fā)性肝癌高發(fā)國，發(fā)病人數(shù)約占全球的55%。全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報告顯示:肝癌是我國惡性腫瘤相關(guān)死亡的第二位死因(在城市和男性則是首位死因)。肝癌在診斷時多已晚期，其治療方法有限，如何有效治療肝癌是我國目如亟需解決的重大問題。近年來，RNA干擾成為一種潛在的癌治療方法。RNA干擾是一種特異性的基因沉默方法。自發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)迅速發(fā)展成為基因研究的有力工具并成為一種具有極大潛在價值的治療方法。迄今為止已有的研究已證實其在疾病治療方面的有效性和可行性。肝癌是一種基因功能改變引起的疾病。近年來，系統(tǒng)生物學水平的研究取得前所未有的巨大進展，確立了諸多重要的致癌基因，這些癌相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)為肝癌治療提供了前所未有的巨大機遇。此外，因為RNA干擾物質(zhì)易于給入肝臟，肝腫瘤適合進行RNA干擾治療(肝腫瘤動物模型已作為一個優(yōu)良的研究模型廣泛用于RNA干擾治療的研究)。因此，RNA干擾治療在肝癌治療方面具有巨大的潛能。可以 預見的是在不遠的將來RNA干擾治療一定會廣泛應(yīng)用于肝癌治療。但是，盡管RNA干擾作為一種治療方法具有巨大潛力，要使其成為一種有效的治療方法必須解決幾個問題。這些問題包括RNA干擾的特異性，RNA干擾作用的持續(xù)性，RNA作用的效能等。RNA干擾表達必須局限于肝癌細胞內(nèi)，非肝癌細胞(如正常肝細胞)應(yīng)免于RNA干擾作用已避免和消除RNA干擾的副作用。這對于肝癌患者特別重要，因為肝癌患者多伴有肝硬化，剩余的正常功能肝細胞減少，肝功能儲備有限。目前最常用的RNA干擾藥物是化學合成的小RNA(SiRNA)和基于質(zhì)粒的III型啟動子(Pol III啟動子，如U6或Hl)驅(qū)動的shRNA。siRNA和III型啟動子驅(qū)動shRNA沒有組織特異性，會沉默任何類型細胞的靶基因，因而可能會在RNA干擾治療作用時不僅作用靶細胞，同時作用于非靶細胞。此外，siRNA或III型啟動子驅(qū)動shRNA的作用時間短(很少超過一周或幾周，而癌治療作用必須能夠維持至少更長的時間)；同時兩者的轉(zhuǎn)染效率低，細胞的攝入有限，這些是目前RNA干擾治療應(yīng)用的重要挑戰(zhàn)。為了獲得組織特異性、長期和高效的RNA干擾，一個可能的解決方案是應(yīng)用組織特異性啟動子(限制治療性RNA干擾表達于靶細胞)結(jié)合慢病毒載體(借助慢病毒載體特性獲得高轉(zhuǎn)染效能和穩(wěn)定長效的RNA干擾作用)來實現(xiàn)。AFP啟動子是肝癌細胞的組織特異性啟動子，高度特異于肝癌細胞，可以實現(xiàn)肝癌組織特異性表達。但是AFP啟動子是II型啟動子(Pol II)，雖可驅(qū)動基因過表達，但卻不能直接驅(qū)動干擾物質(zhì)shRNA的表達，本發(fā)明創(chuàng)造性地應(yīng)用Cre/LoxP開關(guān)系統(tǒng)結(jié)合AFP啟動，采用一種創(chuàng)新的設(shè)計，實現(xiàn)了 AFP驅(qū)動shRNA表達。慢病毒載體是一種能夠獲得長期、高效體內(nèi)外RNA干擾作用的強大工具，目前已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究。慢病毒干擾載體可以高效感染靶細胞(> 99% )將RNA干擾結(jié)構(gòu)(如shRNA)整合入靶細胞的基因組，實現(xiàn)穩(wěn)定表達，產(chǎn)生長效的RNA干擾基因沉默。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種肝癌組織特異性的RNA干擾系統(tǒng)及其建立和應(yīng)用方法，該系統(tǒng)可以肝癌組織特異性地、高效地、長效地沉默靶基因，從而為RNA干擾治療提供了一種有效的治療工具，使肝癌RNA干擾治療成為可能,為RNA干擾治療應(yīng)用于肝癌治療鋪平道路。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng))，其特征在于，由AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體組成(圖1 (A))，AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體均由慢病毒載體構(gòu)建而成，其中，AFP-Cre載體含有一個AFP啟動子和位于其下游的Cre重組酶基因(稱為AFP-Cre結(jié)構(gòu))，LoxP-shRNA載體含有一個經(jīng)過改造的U6啟動子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)和位于其下游的shRNA序列(稱為LoxP-shRNA結(jié)構(gòu))，LoxP-shRNA載體中所含的經(jīng)過改造的U6啟動子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)為在 U6 啟動子中插入一個可指示 AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統(tǒng)是否工作的結(jié)構(gòu)的U6啟動子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)是否工作的結(jié)構(gòu)為LoxP-CMV-eGFP-LoxPo優(yōu)選地，所述的shRNA序列為針對靶基因的shRNA序列。本發(fā)明的肝癌組織特異性 RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng))能夠特異性地工作于肝癌組織細胞，特異性地在肝癌組織細胞中發(fā)揮RNA干擾作用，而對于非肝癌組織細胞則無作用。其工作原理如下:AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)感染肝癌細胞組織，感染后AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體憑借其慢病毒特性將AFP-Cre結(jié)構(gòu)和LoxP-shRNA結(jié)構(gòu)整合入宿主細胞基因組并使其在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定表達。AFP-Cre中的AFP啟動子驅(qū)動其下游的Cre重組酶基因表達產(chǎn)生Cre重組酶，Cre重組酶剪切LoxP-shRNA中的U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6啟動子中的LoxP-CMV_eGFP-LoxP結(jié)構(gòu)，恢復U6啟動子正常結(jié)構(gòu)，激活U6啟動子活性，活化的U6啟動子驅(qū)動其下游shRNA表達，shRNA表達后沉默靶基因。本發(fā)明所述的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)含有指示結(jié)構(gòu)(LoxP-CMV-eGFP-LoxP)，具有自動指示功能，可依靠GFP熒光之減弱有無指示系統(tǒng)是否工作。若AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)感染靶細胞后GFP熒光減弱/消失則表明系統(tǒng)已工作，反之則系統(tǒng)未工作。其原理如下:AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)感染靶細胞后，系統(tǒng)中的LoxP-shRNA載體立即表達(LoxP-shRNA載體無特異性，在任何組織細胞中均可表達)，其含有的指示結(jié)構(gòu)(LoxP-CMV-eGFP-LoxP)中的CMV啟動子驅(qū)動eGFP表達，使細胞組織產(chǎn)生GFP綠色熒光，熒光顯微鏡或活體成像可檢測到GFP綠色熒光表達。若所感染的靶細胞為肝癌細胞，AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)所含的AFP-Cre會表達，AFP-Cre表達后，其AFP啟動子驅(qū)動Cre表達，剪切LoxP-CMV-eGFP-LoxP結(jié)構(gòu)，使得GFP不再表達，GFP熒光減弱至消失(圖(I)B)(需說明的是:因AFP-Cre的AFP啟動子活性弱于CMV-eGFP的CMV啟動子，該過程表現(xiàn)為GFP熒光減弱至消失，而非GFP不表達)；若為非肝癌細胞，則AFP-Cre不能表達，GFP熒光不減弱(圖(I)C)。本發(fā)明還提供了上述的肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，具體步驟為:步驟1:構(gòu)建AFP-Cre載體:步驟1.1:取pDRIVE-SV40-hAFP之AFP啟動子序列，根據(jù)其序列改造設(shè)計并人工合成新的AFP啟動子片段(540bp)(具體序列見說明書末尾)，以NheI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切pUC57質(zhì)粒，T4連接酶連接，將AFP啟動子片段克隆入pUC57質(zhì)粒，形成含有AFP啟動子片段的重組質(zhì)粒PUC57-AFP，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α，擴增，抽提質(zhì)粒；步驟1.2:以pUC57-AFP為模板，以Gecp-1，2為引物(引物序列見表I)，常規(guī)PCR擴增獲得AFP啟動子片段；WpCAG-Cre為模板，以Gecp-3，4(表I)為引物，常規(guī)PCR擴增獲得Cre片段(1070bp);然后以AFP啟動子片段和Cre片段為模板，以Gecp-1，4為引物(表I)，行PCR拼接獲得全長目的基因片段(AFP-Cre)；步驟1.3:用Spe I和Xba I限制性內(nèi)切酶對pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后回收7.0kb的載體片段(P⑶H-CMV-MCS-EF 1-Puio酶切片段)；步驟L 4:將目的基因片段AFP-Cre以同源重組法與pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段重組，構(gòu)建成AFP-Cre重組質(zhì)粒；步驟1.5:轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5ci，挑取轉(zhuǎn)化子行菌落PCR鑒定陽性克隆，接種陽性克隆，保種并分裝送測序。測序沒有問題的，再接種抽提質(zhì)粒；

步驟1.6:表達載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293T細胞鋪板，將AFP-Cre重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G和CaCl2溶液混合后加入培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染24小時后收取上清病毒液，高速離心濃縮病毒后以PCR法檢測病毒拷貝數(shù)，于293T細胞測定滴度；最終形成的AFP-Cre慢病毒顆粒即為AFP-Cre載體；步驟2:構(gòu)建 LoxP-ShRNA 載體:步驟2.1:以pSil02質(zhì)粒為模板，以Gecp-5和Gecp-6為引物(表I)，采用常規(guī)PCR擴增獲得片段A ；以pSil02質(zhì)粒為模板，以Gecp-7和Gecp-8為引物(表I)，采用常規(guī)PCR擴增獲得片段B ；以pSil04質(zhì)粒為模板，以Gecp-9，Gecp-10, Gecp-1l和Gecp-12為引物(表I)，采用常規(guī)PCR擴增獲得片段C ;以Gecp-5和Gecp-8為引物(表I)，以片段A、B、C為模板，行PCR獲得片段D，即為U6-LoXP-CMV-eGFP-U6結(jié)構(gòu)片段；步驟2.2:以XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶分別酶切片段D和pSil02質(zhì)粒，T4連接酶連接，將片段D克隆入pSil02質(zhì)粒形成LoxP-shRNA重組質(zhì)粒；步驟2.3:轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，擴增，測序鑒定陽性克隆，接種陽性克隆后擴增，進行質(zhì)粒抽提；步驟2.4:表達載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293T細胞鋪板，將LoxP-shRNA重組質(zhì)粒與無內(nèi)毒素包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G和CaCl2溶液混合后加入培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染24小時后收取上清病毒液，高速離心濃縮病毒后以PCR法檢測病毒拷貝數(shù)，于293T細胞測定滴度；；最終形成的LoxP-shRNA慢病毒顆粒即為LoxP-shRNA 載體；步驟3:形成肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng):將AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體以1-5:1比例混合溶于Opt1-MEM液中，形成肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統(tǒng))。優(yōu)選地，所述的步驟2.2還包括將LoxP-shRNA重組質(zhì)粒以AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切回收載體片段，取可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將針對靶基因的shRNA克隆入LoxP-shRNA質(zhì)粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質(zhì)粒；所得的針對靶基因的LoxP-shRNA重組質(zhì)粒繼續(xù)進行后續(xù)步驟。本發(fā)明還提供了上述肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)的體外應(yīng)用方法，其特征在于，具體步驟為:步驟1:構(gòu)建針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng):取LoxP-shRNA質(zhì)粒，以AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切回收載體片段，取驗證有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質(zhì)粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化，鑒定、測序無誤后接種抽提質(zhì)粒，再慢病毒包裝，形成LoxP-shRNA載體，將LoxP-shRNA載體與AFP-Cre載體按照1_5: I混合形成針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統(tǒng)；步驟2:使用AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)感染細胞:常規(guī)培養(yǎng)細胞(通常為混合培養(yǎng)細胞)，根據(jù)待作用的靶細胞之細胞量，取感染復數(shù)為10-20 (Μ0Ι = 10-20)，計算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)的量，將AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)加入細胞培養(yǎng)液內(nèi)，同時加入polybrene至終濃度2ug/ml,混勻后作用于對象細胞,感染24h后換液；步驟3:檢測:①GFP指示檢測:熒光顯微鏡下觀察GFP有無減弱和消失，若GFP熒光減弱/消失，表明肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)工作靶基因mRNA和蛋白檢測:以定量PCR(Q-PCR)和western blot檢測靶基因mRNA和蛋白表達抑制與否。本發(fā)明還提供了上述肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)的體內(nèi)應(yīng)用方法，其特征在于，具體步驟為:步驟1:構(gòu)建針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng):取LoxP-shRNA質(zhì)粒，以AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切回收載體片段，取驗證有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質(zhì)粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化，鑒定、測序無誤后接種抽提質(zhì)粒，再慢病毒包裝，形成LoxP-shRNA載體，將LoxP-shRNA載體與AFP-Cre載體按照1_5: I混合形成針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)；步驟2:根據(jù)瘤體估算細胞量，根據(jù)細胞量，取感染復數(shù)為10-20 (Μ0Ι = 10-20)，計算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)的量；以Iml胰島素注射器瘤內(nèi)注射或者靜脈注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)；步驟3:檢測:①GFP指示檢測:使用帶有熒光探頭的活體動物成像儀，檢測腫瘤細胞組織熒光顯色，根據(jù)腫瘤細胞熒光顯色有無減弱，判斷是否工作靶基因mRNA和蛋白檢測:體內(nèi)實驗完畢后，切取腫瘤，以定量PCR(Q-PCR)和western blot檢測靶基因mRNA和蛋白表達抑制與否。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:(I)本發(fā)明創(chuàng)造性地實現(xiàn)了肝癌組織特異性RNA干擾，首次實現(xiàn)了肝癌組織特異性靶基因沉默，為RNA干擾治療肝癌提供了有力工具，由于RNA作用具備肝癌組織特異性，對肝癌周圍組織細胞無作用，理論上預期可以避免RNA干擾治療所致的副作用。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的組織特異性 缺陷，是現(xiàn)有技術(shù)所不具備的。因為實現(xiàn)了肝癌組織特異性RNA干擾，本發(fā)明所述的肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng))對于肝癌的臨床治療和基礎(chǔ)研究具有顯著的效果:在臨床治療方面，它使得靶向干擾治療肝癌成為可能。在基礎(chǔ)研究方面，其大大拓展了基礎(chǔ)研究范圍，使許多之前不能實現(xiàn)的研究成為可倉泛;(2)本發(fā)明較之現(xiàn)有技術(shù)，實現(xiàn)了其無法實現(xiàn)的高效與長效。本發(fā)明因采用慢病毒作為基礎(chǔ)載體，憑借慢病毒的強大感染能力和逆轉(zhuǎn)錄能力等，克服了目前現(xiàn)有技術(shù)所用的siRNA的細胞導入效率低和作用時間短等不足，實現(xiàn)了高效感染導入，長期作用，具有轉(zhuǎn)染效率高、表達穩(wěn)定高效、作用時間長，操作簡便，細胞毒性小等優(yōu)點；(3)本發(fā)明較之現(xiàn)有技術(shù)，具備其所不具備的指示功能。本發(fā)明所述系統(tǒng)帶有指示結(jié)構(gòu)，由于具有良好的GFP指示功能，為實際應(yīng)用觀察提供了極大的便利，體外可借助熒光顯微鏡，體外可借助活體成像，觀察非常方便；本發(fā)明的應(yīng)用價值:本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于肝癌靶向治療的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究，具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的社會與經(jīng)濟價值。包括:(1)肝癌的靶向治療臨床應(yīng)用:對于研究已明確在肝癌中起重要作用、臨床價值確切之癌基因，應(yīng)用本系統(tǒng)肝癌組織特異性地靶向抑制其表達治療肝癌；(2)肝癌的靶向治療研究:肝癌動物模型研究中，應(yīng)用本發(fā)明體內(nèi)特異性地干擾靶基因，確認靶基因是否具有治療作用，探討其臨床價值；(3)基礎(chǔ)研究:例如用于腫瘤微環(huán)境在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用的相關(guān)研究，體外肝癌細胞和間質(zhì)細胞共培養(yǎng)是研究腫瘤微環(huán)境的重要手段，應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)，加入無組織特異性干擾物后會同時攻擊非肝癌細胞，應(yīng)用本發(fā)明可特異性干擾其中的肝癌細胞而不會干擾間質(zhì)細胞的靶基因，得到確切可靠的研究結(jié)果；(4)本發(fā)明中采用的Cre/LoxP-shRNA結(jié)構(gòu)可改造通用于其他組織特異性啟動子驅(qū)動實現(xiàn)其他組織特異性RNA干擾。例如利用前列腺癌PSA啟動子替代AFP啟動子，改造后可以實現(xiàn)前列腺癌組織特異性RNA干擾。



圖(I)為肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng))的結(jié)構(gòu)和工作示意圖=(A)AFP-Cre和LoxP-shRNA載體圖；(B，C)系統(tǒng)工作示意圖:(B)系統(tǒng)在肝癌細胞組織中，AFP-Cre和LoxP-shRNA均表達，系統(tǒng)二工作，shRNA表達，RNA干擾起效；(C)系統(tǒng)在非肝癌細胞組織中，LoxP-shRNA表達而AFP-Cre不表達，系統(tǒng)不工作，shRNA不表達，無RNA干擾作用；圖(2)為體外實驗驗證AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)的有效性及組織特異性圖:AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)感染肝癌細胞(以HCCLM3肝癌細胞為例)和非肝癌細胞(以正常肝細胞L-02為例)，Q-PCR(左側(cè)線圖)和Westernblot檢測(右側(cè)條帶圖)結(jié)果顯示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)可以組織特異性地干擾抑制肝癌細胞的靶基因(Beclin I)的mRNA和蛋白表達，而對非肝癌細胞無作用(HCCLM3細胞受抑制，而L-02無抑制);圖(3)為肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng))的熒光指示功能檢測圖:AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)感染肝癌細胞(以HCCLM3、H印G2和H印3B肝癌細胞為例)和非肝癌細胞(以正常肝細胞L-02、宮頸癌細胞Hela和結(jié)腸癌細胞SWl116為例)，兩周后熒光顯微鏡下拍照，系統(tǒng)在肝癌細胞內(nèi)穩(wěn)定工作，熒光減弱至消失，而在非肝癌細胞內(nèi)不工作，熒光不減弱不消失；圖(4)為體內(nèi)實驗驗證AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)的功能:(A)瘤內(nèi)注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)(以MHCC97L肝癌細胞皮下瘤為例)兩周后，Q-PCR和Western blot檢測表明靶基因(Beclin l)mRNA和蛋白表達被有效干擾抑制；(B)熒光指示檢測顯示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)熒光指示功能良好，系統(tǒng)注入非肝癌細胞(宮頸癌Hela細胞)皮下瘤兩周后活體動物成像GFP熒光不減弱，而系統(tǒng)注入肝癌細胞(MHCC97L)皮下瘤兩周后熒光減弱至消失，指示系統(tǒng)工作起效；圖(5)應(yīng)用本發(fā)明之AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)抑制Atg5基因輔助治療增強Sorafenib 藥效:(A) Q-PCR 和 Western blot 檢測表明應(yīng)用 AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統(tǒng)作用肝癌細胞組織后無論體外(上圖)或體內(nèi)(下圖)均有效干擾抑制靶基因Atg5基因及蛋白表達(以MHCC97L為例，下同);(B)應(yīng)用AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)抑制肝癌細胞Atg5基因可輔助增強Sorafenib誘導細胞凋亡作用；(C)皮下瘤成瘤實驗:瘤內(nèi)注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)抑制Atg5基因可輔助增強Sorafenib抑制腫瘤成瘤作用。
具體實施例方式為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實施例，并配合附圖作詳細說明如下。實施例1本實施例用以說明肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)AFP-Cre/LoxP-shRNA的構(gòu)建過程，以及應(yīng)用該系統(tǒng)特異性抑制靶基因(Beclin I)；一種肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng))由AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體組成(如圖1 (A)所示)，AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體均由慢病毒載體構(gòu)建而成，其中，AFP-Cre載體含有一個AFP啟動子和位于其下游的Cre重組酶基因(稱為AFP-Cre結(jié)構(gòu))，LoxP-shRNA載體含有一個經(jīng)過改造的U6啟動子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)和位于其下游的針對靶基因的shRNA序列(稱為LoxP-shRNA結(jié)構(gòu))，LoxP-shRNA載體中所含的經(jīng)過改造的U6啟動子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP_U6)為在U6啟動子157bp處插入一個LoxP-CMV-eGFP-LoxP結(jié)構(gòu)的U6啟動子。(一 )肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng))的構(gòu)建過程:(I)AFP-Cre載體構(gòu)建:使用pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro作為母載體構(gòu)建,將AFP啟動子和CRE重組酶基因接在一起，替換pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro上的CMV啟動子，具體步驟為:①取pDRIVE-SV40_hAFP (購自InvivoGen公司)之AFP啟動子序列，根據(jù)其序列改造設(shè)計并人工合成新的AFP啟動子片段(540bp)(具體序列見說明書末尾)。以NheI和EcoRI限制性內(nèi)切酶(購自Genescript公司)酶切pUC57質(zhì)粒(購自Genescript公司),T4連接酶(購自Genescript公司)連接，將AFP啟動子片段克隆入pUC57質(zhì)粒，形成含有AFP啟動子片段的重組質(zhì)粒pUC57-AFP，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α (購自閃晶公司)，擴增，抽提質(zhì)粒(Qiagen質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司)(相關(guān)操作參照《分子克隆實驗指南(第3版)》及各產(chǎn)品說明書進行，以下同)；@以？此57^ 重組質(zhì)粒為模板，以6況 -1，2為引物(引物序列見表1)，進行卩0 法擴增AFP啟動子片段(PCR反應(yīng)體系見附1，下同)；以pCAG-Cre質(zhì)粒(購自Addgene)為模板，以Gecp-3，4 (表I)為引物，以PCR法擴增獲得1070bp的Cre片段；然后以AFP啟動子片段和Cre片段為模板，以 Gecp-1，4為引物，PCR法拼接獲得全長目的基因片段(AFP-Cre)(1605bp)；
③用Spe I和Xba I限制性內(nèi)切酶(購自Genescript公司)對P⑶H-CMV-MCS-EF1-Puro質(zhì)粒(購自SBI公司)進行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后回收7.0kb的載體片段(pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 酶切片段);④將目的基因片段AFP-Cre以同源重組法(Clontech公司，同源重組反應(yīng)體系見附2)與pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段重組，構(gòu)建成AFP-Cre重組質(zhì)粒(圖1A); ⑤轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α (購自閃晶公司)，挑取轉(zhuǎn)化子行菌落PCR鑒定(菌落PCR反應(yīng)體系見附3)陽性克隆，接種陽性克隆，保種并分裝送測序(Invitrogen公司)。測序沒有問題的，再接種抽提質(zhì)粒。；⑥表達載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293Τ細胞(購自中國科學院細胞庫)鋪板，細胞密度為3X IO6細胞/皿。將AFP-Cre重組質(zhì)粒與無內(nèi)毒素包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G (購自Trono Lab)及CaCl2溶液混合后逐滴加入等體積的2 X HBS中，加入混合溶液輕輕加入培養(yǎng)皿中并混勻后常規(guī)培養(yǎng)(具體操作參照Trono Lab慢病毒包裝說明進行)。轉(zhuǎn)染約8小時后用完全培養(yǎng)基進行換液；換液后24小時，在生物安全柜中收取上清病毒液，并加入含2% FBS的低血清培養(yǎng)基，24h后第二次收取上清病毒液后，丟掉細胞。振蕩混勻后4°C以10，OOOg高速離心30min，吸干上清后加入適量OMEM溶解沉淀。濃縮病毒后以PCR法檢測每基因組整合的病毒拷貝數(shù)，于293T細胞測定滴度，病毒凍存于-80度冰箱備用。⑦最終形成的AFP-Cre慢病毒顆粒即為AFP-Cre載體。(2) LoxP-shRNA 載體構(gòu)建:①以pSil02質(zhì)粒(購自Micr oSCI公司)為模板，以Gecp-5,6為引物(表I)，進行PCR擴增獲得片段A ;以pSil02質(zhì)粒為模板，以Gecp-7，8(表I)為引物，進行PCR擴增獲得片段B ;以pSil04質(zhì)粒(購自MicroSCI公司)為模板，以Gecp-9，10，11，12 (表I)為引物，進行PCR擴增獲得片段C ；②以片段A、B、C為模板，以Gecp-5，8(表I)為引物，PCR擴增獲得片段D (U6-LoxP-CMV-eGFP-U6)；③以XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶(購自Genescript公司)酶切片段D和pSi 102質(zhì)粒，T4鏈接酶鏈接，將片段D克隆入pSil02質(zhì)粒形成LoxP-shRNA重組質(zhì)粒(圖1 (A))；④轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α (購自閃晶公司)，挑取轉(zhuǎn)化子行菌落PCR鑒定(菌落PCR反應(yīng)體系見附3)陽性克隆，接種陽性克隆，保種并分裝送測序(Invitrogen公司)。測序沒有問題的，再接種抽提質(zhì)粒；⑤表達載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293Τ細胞(購自中國科學院細胞庫)鋪板，細胞密度為3X IO6細胞/皿。將LoxP-shRNA重組質(zhì)粒與無內(nèi)毒素包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G(購自Trono Lab)及CaCl2溶液混合后逐滴加入等體積的2XHBS中，加入混合溶液輕輕加入培養(yǎng)皿中并混勻后常規(guī)培養(yǎng)(具體操作參照Trono Lab慢病毒包裝說明進行)。轉(zhuǎn)染約8小時后用完全培養(yǎng)基進行換液；換液后24小時，在生物安全柜中收取上清病毒液，并加入含2% FBS的低血清培養(yǎng)基，24h后第二次收取上清病毒液后，丟掉細胞。振蕩混勻后4°C以10，OOOg高速離心30min，吸干上清后加入適量OMEM溶解沉淀。濃縮病毒后以PCR法檢測每基因組整合的病毒拷貝數(shù)，于293T細胞測定滴度，病毒凍存于-80度冰箱備用；
⑥最終形成的LoxP-shRNA慢病毒顆粒即為LoxP-shRNA載體；(3)形成 AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統(tǒng):將 AFP-Cre 載體和 LoxP-shRNA 載體以 1:1比例混合溶于Opt1-MEM液(購自Invitrogen公司)中，形成肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)(AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統(tǒng))。附1:PCR反應(yīng)體系(Takara試劑盒，購自寶生物公司):
權(quán)利要求
1.種肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)，其特征在于，由AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體組成，AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體均由慢病毒載體構(gòu)建而成，其中，AFP-Cre載體含有一個AFP啟動子和位于其下游的Cre重組酶基因，LoxP-shRNA載體含有一個經(jīng)過改造的U6啟動子和位于其下游的shRNA序列，LoxP-shRNA載體中所含的經(jīng)過改造的U6啟動子為在U6啟動子中插入一個可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)是否工作的結(jié)構(gòu)的U6啟動子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)是否工作的結(jié)構(gòu)為LoxP-CMV_eGFP-LoxP。
2.權(quán)利要求1所述的肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)，其特征在于，所述的shRNA序列為針對靶基因的shRNA序列。
3.利要求1所述的肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，具體步驟為: 步驟1:構(gòu)建AFP-Cre載體: 步驟1.1:取pDRIVE-SV40-hAFP之AFP啟動子序列，根據(jù)其序列改造設(shè)計并人工合成新的AFP啟動子片段，以NheI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切pUC57質(zhì)粒，T4連接酶連接，將AFP啟動子片段克隆入pUC57質(zhì)粒，形成含有AFP啟動子片段的pUC57_AFP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α，擴增，抽提質(zhì)粒； 步驟1.2:以pUC57-AFP重組質(zhì)粒為模板，以Gecp-1，2為引物，常規(guī)PCR擴增獲得AFP啟動子片段；以pCAG-Cre為模板，以Gecp-3，4為引物，常規(guī)PCR擴增獲得Cre片段；然后以AFP啟動子片段和Cre片段為模板，以Gecp-1，4為引物，行PCR拼接獲得全長目的基因片段 AFP-Cre ；步驟1.3:用Spe I和Xba I限制性內(nèi)切酶對pCDH-CMV-MCS-EFl_Puro質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后回收7.0kb的載體片段，即為P⑶Η-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段； 步驟1.4:將步驟1.2獲得的目的基因片段AFP-Cre以同源重組法與步驟1.3獲得的pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段重組，構(gòu)建成AFP-Cre重組質(zhì)粒； 步驟1.5:轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子行菌落PCR鑒定陽性克隆，接種陽性克隆，保種并分裝送測序，測序沒有問題的，再接種抽提質(zhì)粒； 步驟1.6:表達載體包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293T細胞鋪板，將AFP-Cre重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G和CaC12溶液混合后加入培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染24小時后收取上清病毒液，高速離心濃縮病毒后以PCR法檢測病毒拷貝數(shù)，于293T細胞測定滴度；最終形成的AFP-Cre慢病毒顆粒即為AFP-Cre載體； 步驟2:構(gòu)建LoxP-shRNA載體: 步驟2.1:以pSil02質(zhì)粒為模板，以Gecp-5和Gecp-6為引物，采用常規(guī)PCR擴增獲得片段A ;以pSil02質(zhì)粒為模板，以Gecp-7和Gecp-8為引物，采用常規(guī)PCR擴增獲得片段B ；以pSil04質(zhì)粒為模板，以Gecp-9，Gecp-10, Gecp-1l和Gecp-12為引物，采用常規(guī)PCR擴增獲得片段C ；以Gecp-5和Gecp-8為引物，以片段A、B、C為模板，行PCR獲得片段D，即為U6-LoxP-CMV-eGFP-U6 結(jié)構(gòu)片段； 步驟2.2:以XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶分別酶切片段D和pSil02質(zhì)粒，T4連接酶連接，將片段D克隆入pSil02質(zhì)粒形成LoxP-shRNA重組質(zhì)粒； 步驟2.3:轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，擴增，測序鑒定陽性克隆，接種陽性克隆后擴增，進行質(zhì)粒抽提；步驟2.4:表達載體包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293T細胞鋪板，將LoxP-shRNA重組質(zhì)粒與無內(nèi)毒素包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G和CaC12溶液混合后加入培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染24小時后收取上清病毒液，高速離心濃縮病毒后以PCR法檢測病毒拷貝數(shù)，于293T細胞測定滴度；最終形成的LoxP-shRNA慢病毒顆粒即為LoxP-shRNA載體； 步驟3:形成肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng):將AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體以1-5: I比例混合溶于Opt1-MEM液中，形成肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)。
4.權(quán)利要求3所述的肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，所述的步驟2.2還包括將LoxP-shRNA重組質(zhì)粒以AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切回收載體片段，取可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質(zhì)粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質(zhì)粒；所得的針對靶基因的LoxP-shRNA重組質(zhì)粒繼續(xù)進行后續(xù)步驟。
5.利要求1所述的肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)的體外應(yīng)用方法，其特征在于，具體步驟為: 步驟1:構(gòu)建針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng):取LoxP-shRNA質(zhì)粒，以AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切回收載體片段，取驗證有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質(zhì)粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化，鑒定、測序無誤后接種抽提質(zhì)粒，再慢病毒包裝，形成LoxP-shRNA載體，將LoxP-shRNA載體與AFP-Cre載體按照1_5: I混合形成針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)； 步驟2:使用AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)感染細胞:常規(guī)培養(yǎng)細胞，根據(jù)待作用的靶細胞之細胞量，取感染復數(shù)為10-20，計算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)的量，將AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)加入 細胞培養(yǎng)液內(nèi)，同時加入polybrene至終濃度2ug/ml,混勻后作用于對象細胞，感染24h后換液； 步驟3:檢測:熒光顯微鏡下觀察GFP有無減弱和消失，若GFP熒光減弱和消失，表明AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)工作起效；以定量PCR和western blot檢測靶基因mRNA和蛋白表達抑制與否。
6.利要求1所述的肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)的體內(nèi)應(yīng)用方法，其特征在于，具體步驟為: 步驟1:構(gòu)建針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng):取LoxP-shRNA質(zhì)粒，以AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶酶切回收載體片段，取驗證有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質(zhì)粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化，鑒定、測序無誤后接種抽提質(zhì)粒，再慢病毒包裝，形成LoxP-shRNA載體，將LoxP-shRNA載體與AFP-Cre載體按照1_5: I混合形成針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)； 步驟2:根據(jù)瘤體估算細胞量，根據(jù)細胞量，取感染復數(shù)為10-20，計算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)的量；以Iml胰島素注射器瘤內(nèi)注射或者靜脈注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)； 步驟3:檢測:使用帶有熒光探頭的活體成像儀進行活體動物成像，根據(jù)腫瘤熒光顯色有無減弱，判斷AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)是否工作起效；體內(nèi)實驗完畢后，以定量PCR和western blot檢測 腫瘤祀基因mRNA和蛋白表達抑制與否。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)及其建立和應(yīng)用方法。所述的肝癌組織特異性RNA干擾系統(tǒng)由AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體組成，AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體均由慢病毒載體構(gòu)建而成，其中，AFP-Cre載體含有一個AFP啟動子和位于其下游的Cre重組酶基因，LoxP-shRNA載體含有一個經(jīng)過改造的U6啟動子和位于其下游的shRNA序列，LoxP-shRNA載體中所含的經(jīng)過改造的U6啟動子為在U6啟動子中插入一個可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)是否工作的結(jié)構(gòu)的U6啟動子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(tǒng)是否工作的結(jié)構(gòu)為LoxP-CMV-eGFP-LoxP。應(yīng)用本發(fā)明獲得的RNA干擾作用具有肝癌組織特異性高、作用長效、高效、指示良好、操作簡便等特點。本發(fā)明使肝癌RNA干擾靶向治療成為可能，并極大地方便了相關(guān)研究分析，可廣泛應(yīng)用于肝癌治療及基礎(chǔ)研究。
文檔編號C12N15/867GK103088064SQ20121055685
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者樊嘉, 史穎弘, 彭遠飛, 丁振斌 申請人:復旦大學附屬中山醫(yī)院